JPS6040840B2 - 抗生物質類の微生物学的製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ネブラマイシン複合体はストレプトマイセステネブラリ
ウス（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクション
一Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．１７９２０および１７９２１）によ
って製造されたちがった８アミ／配糖体抗生物質成分（
ネブラマィシン因子１，１′，０，ｍ，Ｗ，Ｖ′，のお
よびＷ）をもつ知られた複合体である。 この複合体および上記微生物を使うこの製法はＡｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂｉａＩ Ａ袋ｎｔｓ ａｎｄＣｈｅｍｏｔ
ｈｅｒａｐｙ．１９６７．３１４−３４８ページおよび
米国特許第３６９１２７少号（米国特許第３８５３７０
９号も参照されたい。）に記載されており、ストレプト
マィセス テネブラリウスＮＲＲＬ３８１６，ストレブ
トマイセス テネブラリゥスＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．１７９２
０の突然変異株の発酵によるネブラマィシン因子ロおよ
び皿の製法が発表されている。ネブラマィシン因子のは
現在トブラマイシンと名づけられているが、これは構造
：をもっとＡｎｔｉｍｊｃｍｂ．ＡｇｅｎはａｎｄＣｈ
ｅｍｏｔｈｅｒ．，１９７０，３０９−３１３ページに
報告されている。 トプラマイシンはプシュードモナスおよびプロテウス微
生物に対する活性を含む中広い抗細菌活性スペクトルを
もつ市販の抗生物質である。Ｋ．Ｆ．ゴッホらはＪ．Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９７３，７４５‐７５１ペー
ジにトブラマイシンはストレプトマイセステネブラリウ
スの発酵によって直接生成されないが、ネブラマィシン
因子Ｖ′（６″一〇−カルバモイルトブラマイシン）の
酸又は塩基性加水分解から得られるときいている。ネブ
ラマイシソ因子川ま現在アプラマイシンと名づけられて
いるがこれは構造：を も っ とＡｎｎｕａｌ Ｒｅ
ｐｏ比 ｊｎ ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
，９巻，１９７４，９９ページに報告されている。 アプラマィシンは種々の動植物の病気の治療に抗菌剤と
して有用であると記載されている。（米国特許第３６９
１２７９号，第３８５３７０９号および第３８７６７６
７号参照）ネプラミン（３ーデオキシネアミン又は３′
ーデオキシーネオマイシン−Ａともいわれる。 ）はトブラマィシンの加水分解によって製造されている
アミノ配糖体抗生物質である。（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ
．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏ比ｅｒ．，１９７
０，３０９一３１３ページ）ネオブラミンの物理的生物
学的性質はベルギー特許第８０８３９３号およびＪ．Ａ
ｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６巻．１９７４，３３０
０一３３０５ページに発表されている。ネァミンはネオ
マィシンのアミノ配糖体抗生物質分解生成物でＪ．Ａｍ
ｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７３巻１９５１，２７９４
−２７９７ページに記載されている。ネブラマイシン因
子ＮおよびＶ′はそれぞれ６′′−○ーカルバモイルカ
ナマイシンＢおよび６″一〇−カルバモィルトブラマィ
シンと同定されている。（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
，２申蓋、１９７３，７４５一７５１べ−ジ）本発明者
等はこれ迄知られていない微生物の種であるストレプト
アロテイクスヒンズスタヌスのある株を発酵してアプラ
マィシンおよびネブラマィシン因子Ｖ′より成るアミノ
配糖体混合物を生成することを見出した。 従って本発明はストレプトアロテイクス属に属するアプ
ラマィシンおよび／またはネブラマィシン因子Ｖ′生産
菌を培養し、培養物からアプラマイシンおよび／または
ネブラマィシン因子Ｖ′からなるアミノ配糖体抗生物質
を採取することを特徴とするアミノ配糖体抗生物質の製
造法を提供するものである。この発酵法に使う新規発見
の微生物は本明細書でストレプトアロティクスヒンズス
タヌス株Ｃ６７７−９１，Ｃ８０１−１０４，およびＤ
２５１一１と名づける。 これらの微生物はインド±穣試料から分離したアクチノ
マイセテスバクテリアである。この微生物はワシントン
市コロンビア地区所在のアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託されＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ、３１２１
７（株Ｃ６７７−９１）、３１２１８（株Ｃ−８０１−
１０４）および３１２１９（株Ｄ２５１一１）としてそ
の永久微生物収集品に加えられている。また該微生物は
昭和５２和５月２６日１こ工業技術院微生物工業技術研
究所に委託された。（徴工研菌寄（ＦＥＲＭ−Ｐ）第４
０７び号、第４０７１号および第４０７２号。）微生物 株や６７７−９１、Ｃ−８０１一１０４およびＤ２５１
−１の形態学的、培養的および生理学的特性を次に述べ
る。 微生物の分類学的研究に用いる方法は一般にアクチノマ
イセテスの分類にも使われるものである。 この微生物の形態学的観察の為麦芽ヱキス−酵母エキス
寒天、無機塩一澱粉寒天およびチロシン寒天上で３７ｑ
０で生育させた。胞子姿の生成観察の為この微生物を麦
芽エキス−酵母エキス寒天およびグリセロールアスバラ
ギン寒天上で２浮０で３−４週間生育させた。生長力あ
る菌糸の胞子愛および他の構造をカワトとシノブにより
Ｍｅｍ．瓜ａｋａ，Ｕｎｉｖ，ＬｉＶ，ＡｎｓＥｄ比，
，８：１１４（１９５９）に記載されたカバースリップ
法によりつくった薄層培養の顕微鏡的観察によってしら
べた。運動性胞子は浸債２一４時間後に胞子嚢から水中
に放出された。微生物の培養的および生理学的特性記述
に使われた培地と方法はｌｎｔ，Ｊ．Ｓ松ｔ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１６：３１３−３４０（１９６６）に国
際ストレプトマィセスプロジェクト（ＳＰ）によって推
薦されたものである。炭水化物利用試験についてはプリ
トハムとゴットリープの基礎培地を０．０１％ジフコ酵
母エキスで補足して用いた。形態学 アクチノマィセテ株Ｃ６７７一９１は酵母ーェキスー麦
芽エキス寒天およびグリセロールーアスパラギン寒天上
の生長力ある菌糸中に単独に又は集団的に胞子愛を生成
する。 胞子嚢の形は長方形から球形に近く又は時には球形であ
り、その表面は凹凸ありまた大きさは縦２．７〜７．０
機１．５〜４．５仏ｍである。ピーナッツの殻の形の胞
子姿もある。胞子髪柄は寒天培地の表面にそって形成さ
れ、いましば枝をもっておりこの胞子髪柄の長さは５−
２０ｒｍである。各胞子姿は１乃至４又はそれ以上の胞
子を入れておりそれは棒状又はＶ−形に並んでいる。よ
り大きい胞子愛は一般に空隙をもっている。胞子は玉子
形又は棒状で棒状胞子は大てい曲つており１又は２の大
豆殻状ふくらみをもっている。胞子は大きさ縦１．２−
４ｒｍ機０．９一１．５山ｍで長さ５０仏ｍ又はそれ以
上の単極鞭毛１本をもって運動性がある。株Ｃ６７７一
９１も酵母エキス‐麦芽エキス寒天（ＩＳＰＮｏ．２）
、無機塩類−澱粉寒天（ＩＳＰＮｏ．４）および他の固
体塔地上の気生菌糸にクラスター（ｃｌ船ｔｅｒ）およ
び菌核を生ずる。 クラスターは優生な分生胞子生成性構造であり菌核の生
成は幾分気まぐれである。クラスターは枝を多数もった
曲つた又はＬ−形の短かな分生胞子鎖より成りいまいま
厚いものに発達する。分生胞子はなめらかな表面をもち
玉子形から短円筒形である。いくつかの胞子鎖がクラス
ター構造から突出し時にはオープンスパイラルをつくる
。菌核の形は玉子形又は時には不規則である。成裏灘胞
子より成る気生菌糸体は寒天表面から掻きとられ易い。
基底菌糸は分れており隔膜がなく時に撚じれまた巻いて
いる。菌糸で覆われた球状体が生じるがそれはキタサト
ア属の種と報告されているものと同じである。その直径
は３−２０Ａｍである。培養的生理学的特性株Ｃ６７７
‐９１は試験した袷んどの寒天培地上に豊富な気生菌糸
を生成する。 成熟気生菌糸の色は明るい黄色がかったベージュ色又は
淡ピンクがかった黄色である。基底菌糸は特別な色をも
っていない。気生菌糸の生成しない場合基底菌糸は寒天
中に鯵透する。拡散性色素は生成しない。チロシナーゼ
反応は陰性である。株Ｃ６７７‐９１は抗熱性であり５
０ｑｏで非常によく生育する。５％Ｎａｃｌを含む寒天
塔地中で生育が制限され７％Ｎａｃｌでは生育は見られ
ない。ロィドマンのポテトプラグ（ｐｏはｔｏ ｐｌｕ
ｇ）酸性度試験（ｌｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．母ｃｔｅｒｉ
ｏｌ．２１．２４０−２４７（１９７１））では正常な
生育が見られる。株Ｃ６７７一９１の培養的生理学的特
性および炭水化物利用は表１，ロおよびｍにそれぞれ示
している。表１ 株０６７７‐９１の培養的特性 註、Ｇ＝生育：Ｒ：裏面色：Ａ＝気生菌糸Ｄ二拡散性色
素 表０ 株Ｃ６７７−９１の牛理学的反応 ＊印 Ｊ．Ｅ１ｉｓｈａＭｉｔｃｈｅｌＩＳｃｉ．Ｓｏ
ｃ．７９

【１１：５３−７０（１９６３）。 表ｍ 株０６７７‐９１の炭水化物利用 基礎寒天塔地：０．０１％酵母エキスを加えたプリトハ
ムおよびゴツトリーブ培地培養温度：３７０ 十十：利用度 強い陽性 ＋：利用度 腸性 ±：利用度 不明確 −：利用度 陰性 細胞一連組成 細胞整調製をＴ．ャマグチのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
８９：４４４−４５３（１９６５）に記載の方法で行な
った。 アミノ酸分析方法は次のとおりであった：精製細胞壁１
０雌を封管中洲Ｈｃｌｌ泌を用い１２０℃で１糊時間加
水分解した。分解液を蒸留水の等容量で稀め炉過した後
真空葵発乾団した。 生成物の半量を０．１Ｍの蒸留水に再溶解し２次元のＴ
ＬＣでしらべた。他の半量を２の【のくえん酸緩衝液（
ｐＨ２．２）にとかし液体クロマトグラフ法によって分
析した。加水分解液の５仏〆部分をシリカゲルＴＬＣ板
（６皿２５４，ドイツのＥ．メルク社）に付け−方向に
フェノール−水（４：１）で、次いで初めと直角にｎ−
ブタノールー酢酸−水（３：１：１）で展開した。スポ
ットを０．２％エタノール性ニンヒドリン試験をスプレ
イし、次いで１１０℃で５分間板を加熱して現像した。
比較標準試料、ジアミノーピメリン酸（ＤＡＰ）、グル
タミン酸、グリシン、アラニン・バリン、およびロイシ
ン（各２０Ｍｏ／の‘）の混合物を細胞壁試料と共に試
験した。ＬＬ−ＤＡＰからメゾおよび（又は）ＤＤ−Ｄ
ＡＰを区別する為に加水分解液５″そをセルロース粉末
ＴＬＣ板に付けた。この板を溶媒系メタノール−水−１
皿Ｈｃｌ−ピリジン（８０：１７．５：２．５：１０）
で２岬寿間展開した後０．２％ニンヒドリン試薬をスプ
レィした。このＴＬＣ系においてＬＬ−ＤＡＰは標準試
料として使ったメゾＤＡＰよりも遠く移動した。細胞壁
調整品のアミノ酸組成を上の方法によって株Ｃ６７７−
９１、２種の／カルジア、普通の胞子鎖をもつ２種のス
トレプトマィセス、代表的クラスターを生成する２種の
ストレプトマィセスおよびストレプトマイセステネブラ
リウスを含むアクチノマィセテスｌｑ蚤をしるべた。存
在するアミノ酸はＴＬＣ板上に現われたスポットの大き
さおよび強度によって相対量で表わした。その結果を表
Ｗに示している。表Ｗ 薄層クロマトグラフ法によって
検べた細胞壁のアミノ酸組成アラニンとグルタミン酸は
検べたアクチノマィセテス株すべてに存在した。 グリシンはＳ．テネブラリウス以外のすべてのストレブ
トマイセス株に存在したが、その存在は株Ｃ６７７‐９
１とＳ．テネブラリウスには不明確でノカルジア種には
なかった。メゾ−ＤＡＰは株Ｃ６７７−９１、／カルジ
アの２種およびＳ．テネプラリウスに存在したがＬＬ−
ＤＡＰは普通の胞子鎖生成型かクラスター生成型かに関
係なくストレプトマィセス株のすべてに発見された。株
Ｃ６７７‐９１の細胞壁調製品のアミノ酸組成はまたア
ミノ酸分析器を使って関連ある２種のアクチノマィセテ
ス株、Ｎ．ルチアおよびＳ．フラジイと比較して定量的
に検べた。 この結果を表Ｖに示しているが、ＴＬＣによる結果を確
認した。表Ｖ アミノ酸分析器による細胞壁の相対アミ
ノ酸組成 株や６７７−９１，Ｎコラリナ、Ｓ．フラジイ、Ｓ．ア
ンチーマイコチクスおよびＳ．テネプラリウスの細胞壁
の炭水化物組成を次のとおり検べた：粗細砲墜試料５０
岬、を封管中洲日２Ｓ０４３必中で１２０ｑｏで２時間
加水分解した。 分解液を飽和旧ａ（ＯＨ）２液で中和し沈澱した母Ｓ０
４を遠心分離除去し上燈液を凍結真空乾燥した。得た物
質をＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ＳＭ．８５：２４９７−２５
０７（１９６３）の方法によってトリメチルシリル化し
生成物をガスクロマトグラフ法にかけ種々の関聯糖類と
比較した。結果を表のに示している。アラビノースは１
カルジア種にのみ見出された。ガラクトースとマンノ−
スは株Ｃ６７７−９１、Ｎ．コラリナおよびＳ．テネプ
ラリウス中にあったが他のストレプトマィセス株にはな
かった。ラムノースは株や６７７−９１およびＳ．テネ
ブラリウス中にあったが、１カルジアおよび他の２種の
ストレプトマィセス株中にはなかった。表の 細胞壁の
炭水化物組成失印 ＴＲは痕跡の意 分類法 ァククチノマィセテス株Ｃ６７７−９１はストレプトマ
ィセス又はチェイニアのある種類にみられる形態学的に
代表的なクラスターおよび菌核を気生菌糸中に生成した
。 株℃６７７一９１の細胞整調製品のアミノ酸および糖組
成はしかしストレフ。トマィセティシ科のどの種のもの
とも全く異なっている。株Ｃ６７７−９１は更にアクチ
ノプラネィシー科の特性である生長する菌糸中に胞子嚢
を生成するのである。バ − ゲ イ のＭａｎ雌ｌ
ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉＭｔｉｖｅ舷ｃｔｅｒｉｏｌｏ期
（８版、１９７４）にァクチノプラネィシー料の胞子霧
生成性１０属、即ちアクチノプラネス、アンプラリア（
アンプラリエラ）、スピリロスポラ、ストレプトスポラ
ンジウムおよびアモルフオスポランジウム〔すべてコウ
チのＪ．Ｅ１ｊｓｈａＭｉｔｃｈｅｌＩＳｃｉ．Ｓｏｃ
．７９１｝：５３一７０（１９６３）に記載されている
〕、ピリメリア〔Ｊ．Ｅ１ｉｓｈａＭｉｔｃｈｅｌＩＳ
ｉｃ．ＳＭ．８２：２２０一２３０（１９６６）〕、プ
ラノモノスポラ〔Ｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：２７
−３８（１９６７）〕、ダクチロスポラソジウム〔Ａｒ
ｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．５８：４２−５２（１９６
７）〕およびキタサトア〔Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
２１：６１６一６２５（１９６８）〕が記載されている
。 株Ｃ６７７一９１を重要なアクチノプラネィシー属と比
較して表肌に記述する。機 三 Ｓ り 煙 Ｓ 鷲 ■ ン ′汽 １い 。 ト、 ふ へ ト 旨 船 き ・ 三 口 − アクチノプラネィシー料の種々の函において、アクチノ
プラネス属は７種を含むが胞子桑の形で株Ｃ６７７一９
１と似ているが鞄子嚢中の胞子の配列と形および鞭毛の
型では異なる。 スピリロスポラ属と株Ｃ６７７‐９１は胞子嚢および胞
子姿胞子の形、鞭毛の型および気生菌糸生成の様な多く
の共通特性をもっているが、これらは、胞子桑中の胞子
の配列および数で異なる。ストレブトスポランジウム属
はＣ６７７−９１と気生菌糸生成で似ているが表肌に掲
げた他の多くの特性で後者と異なる。アモルフオスポラ
ンジウム属はＣ６７７一９１と胞子嚢胞子の形で似てい
るが鞭毛と気生菌糸生成で異なる。アンプラリェラ属は
胞子葵胞子の形においてＣ６７７−９１と似ているが胸
子嚢の形、胞子姿中の胞子の配列、鞭毛および気生菌糸
生成において異なる。ピリメリアは胞子嚢胞子および鞭
毛の形においてＣ６７７−９１と似ている胞子姿中の胞
子の配列と数および気生菌糸生成について異なる。ダク
チロスポランジウム属は胞子髪中の胞子の配列と数にお
いてＣ６７７−９１と似ているが気生菌糸生成と鞭毛の
型において異なる。キタサトア属は鞭毛と気生菌糸生成
においてＣ６７７−９１と似ているが胞子髪の形、胞子
桑中の胞子の配列および形において異なる。株Ｃ６７７
−９１は細胞壁の主要明瞭成分としてメゾ−ＤＡＰ、ガ
ラクトース、マンノ−スおよびラムノースを含むがＬＬ
−ＤＡＰ、グリシンおよびアラビノースを含まない。ア
クチノプラネィシー料のスピリロスポラとストレプトポ
ランジウム以外の属は１特徴細胞壁成分としてグリシン
を含む。株Ｃ６７７−９１の細胞壁成分はガラクトース
を含む点でスピリロスプラおよびストレプトスポランジ
ウム（いづれも細胞壁皿型）と異なる。ストレプトマイ
セス スクレログラヌラトス〔Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃｓ２２：５９０−５９６（１９６９）〕はクラスター
および菌核双方の生成において株Ｃ６７７−９１に似て
いる。この細胞壁組成と胞子髪生成に関して何の文献も
ないが、Ｓ．スクレログラヌラトスは多くの培地上の白
色がかった気生菌糸生成、耐熱性のない点およびそのキ
シロース、ラフィノース、マンニトールおよびイノシト
ールの腸性利用型において株Ｃ６７７−９１と区別され
る。株Ｃ６７７−９１に最も似た種はストレプトマイセ
ステネプラリウスＡＴ．Ｃ．Ｃ．１７９２０（Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅ山ｓａｎｄＣｈｅｍａｔｈｅ
ねｐｙ（１９６７）３２４一３３１）であると思われる
。 両者はクラスターおよび菌核の生成、ィノシトールを除
く炭水化物利用型など多くの重要特性が共演している。
耐熱性と生成された抗生物質も同じである。Ｓ．テネプ
ラリウスＡＴ．Ｃ．Ｃ．１７９２０の細胞壁成分は株Ｃ
６７７−９１と比較分析してストレプトマィセテスとし
て全く特異であるので株Ｃ６７７一９１と非常によく似
た独特の細胞壁組成であるとわかった。Ｓ．テネブラリ
ウスＡＴ．Ｃ．Ｃ．１７９２０はその種の名の意味する
とおり感光性であり蛍光ランプのもとで気生菌糸を生成
しない。株Ｃ６７７−９１は他の株Ｃ８０１−１０４お
よびＤ２５１−１と共に同じ条件のもとでよく豊富な気
生菌糸を生成した。株や６７７−９１も赤色可溶性色素
がなくィノシトールの利用陰性である点でＳ．テネブラ
リウスと異なっている。ヒギンスとカストナ−（Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓＡｇｅｎｔｓ ａｎｄＣｈｅｍｏｔｈ
ｅｒａｐｙ一１９６７：３２４一３３１）はＳ．テネブ
ラリウス（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．１７９２１）の胞子非形成
変異株について栄養菌糸の分裂を示して形態学的に／カ
ルジアに似ていると報告し故に変異株ＡＴ．Ｃ．Ｃ．１
７９２１も株Ｃ６７７−９１とは異なっている。更にＮ
ａＣＩ耐性についても差異が認められた：即ち株Ｃ６７
７一９１は７％ＮａＣ】において生育しないが、Ｓ．テ
ネブラリウスの２株（ＡＴ．Ｃ．Ｃ．１７班０およびＡ
．Ｔ．Ｃ．Ｃ．１７９２１）はわれわれの実験において
８％ＮａＣＩ（１０％においてではない）で生育した。
更に胞子嚢はＳ．テネブラリウスの２株に発見されなか
ったのでそれらは分類学上株Ｃ６７７一９１と区別され
るべきである。株Ｃ６７７−９１の細胞壁組組成と共に
形態学的、培養的および生理学的特性を考えて、ストレ
プトマイセスに似た形態である株Ｃ６７７−９１型の特
異な細胞壁組成：主アミノ酸としてメゾ−ＤＡＰ、アラ
ニンおよびグルタミン酸を含むかつ判定に役立つ中性糖
類としてガラクトース、マンノースおよびラムノースを
もつので胞子髪生成性アクチノマィセテ株と区別する為
アクチノプラネイシー料のもとに新ストレプトァロティ
クス属を創ることを提案する。属名ストレプトアロティ
クスはストレプトマィセスに似ているが特異の細胞壁を
もつ微生物であることを意味する。（ギリシャ語でａｌ
ｌｏ＝変わった、にｉｃｈｕｓ＝壁）また株Ｃ６７７−
９１はこの微生物がインド北部から採取された土壌から
単離されたのでＳｕｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓｈ
ｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ｇｅｎ ｎｏｖ．ａｎｄ ｓｐ
．皿ｖ．と名づけることが提案された。 株Ｃ６７７−９１の他にストレプトアロティクスヒンズ
スタヌス２株Ｃ８０１−１０４とＤ２５１−１もインド
の土壌試料から得られており株Ｃ６７７−９１と同じア
ミノ配糖体抗生物質を生成することが発見されている。 株Ｃ６７７一９１、Ｃ８０１−１０４およびＤ２５１‐
１は細胞壁組成、炭水化物利用型、抗生物質生成および
実質的にすべての培養的および形態学的性質において同
一特性を示す。これらの株は下記するとおりチロシン寒
天（ＩＳＰＮｏ．７）上で培養した時気生菌糸特性の間
に僅かの差異が認められた。株
気生菌糸特性Ｃ６７７− ９孫高状、白色後に明
るいピンクがかった黄色Ｃ８０１−１０４ビロード状、
明るいピンクがかったベイジュ色Ｄ２５１一 １ビロ
ード状、白色後に淡黄ベイジュ色分類法の点から３株の
間の差異は殆んどないのでこれらの株はすべて同一種ス
トレプトアロテイクス ヒンズスタヌスｇｅｎ．ｎｏＶ
．およびＳｐ．ｎｏｖ．に入れるべきである。 本発明は新規発見微生物ストレプトアロティクス ヒ
ンズスタヌス株Ｃ６７７一９１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１
２１７）、株Ｃ８０１一１０４（ＡＴ．Ｃ．Ｃ．３１２
１８）および株Ｄ２５１‐１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２
１９）に関し特に詳細記載したが本発明の方法は上記特
性によって記載された特定微生物に限定するものではな
いのである。 本発明はまた同じアミノ配糖体抗生物質の複合体又は混
合物を生成する上記微生物の他株又は突然変異株をも包
含すると考えている。この様な他株又は突然変異株はこ
の分野でよく知られた方法、例えば新規微生物を×−線
又は紫外線照射、窒素マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、
フェイジ（ｐｈａ鉾）露出等によって生成出来る。抗生
物質の製法 本発明によればアプラマイシンおよびネブラマィシン因
子Ｖ′（併産されたアミノ配糖体ネアミン、ネブラミン
およびネブラマイシン因子Ｗと混在している）を含むア
ミノ配糖体温合物は炭素と窒素の同化性源を含む水性栄
養塔地中の好気性条件においてＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２
１７、３１２１８又は３１２１９の同定特性をもつスト
レプトーアロテイクス ヒンズスタヌスの株を深部培養
して培養液中に生産される。 この微生物は同化性炭素源、例えば同化性炭水化物を含
む栄養培地中で生育する。 適当する炭素源の例にはグルコース、ガラクトース、フ
ルクトース、マンノース、麦芽糖およびグリセロールが
ある。栄養塔地は例えば魚粉、大豆粉、コーン浸糟液、
ベプトン類、肉エキス、ピーナッツ粉、酵母ヱキス又は
アンモニウム塩類の様な同化性窒素も含む必要がある。
栄養無機塩類も培養塔地中に混合してもよくこの塩類は
ナトリウム、カリウム・アンモニウム、カルシウム、り
ん酸塩、硫酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩又は
同様イオンを供艶給しうる普通のどんな塩類を含んでも
よい。銅、マンガン、鉄、亜鉛等の痕跡元素を必要なら
ば培地に加えてもよく又は培地の他成分の不純物として
供Ｖ給されてもよい。ァミ／配糖体温合物の製造は微生
物が満足に成長出釆るどんな温度でも、例えば２５−５
０℃で行ない得るが、約２８−３０午０で有利に行ない
得る。 普通抗生物質の最適製造は約２一５日で得られる。例え
ば母６一７の様な中性又は中性に近いｐＨの培地を使う
のがよい。好気性深部培養条件は抗生物質混合物製造の
選択条件である。 比較的少量製造にはフラスコ振とう又は表面培養が使用
出来るが大量生産には無菌タンク中の好気性培養が好ま
しい。タンク発酵を行なう場合その微生物からの胞子を
培養液に接種し、微生物の若い活力のある時期にそれを
発酵タンク塔地に無菌状態で移して培養するのが好まし
い。接種菌用の培養塔地はこの抗生物質の大規模生産に
使用する培地と同一でも異なっていてもどちらでもよい
。望む抗生物質混合物の生産は培養工程中に試験菌とし
てバチルス、スブチリスＰＣＩ−２１９をまた検定標準
品としてネブラマィシン因子Ｖ′を使って紙ジスクー寒
天拡散分析法によって容易に監視出来る。 抗生物質混合物の分離 培養液の最高力価が得られた後に（上記検定法によって
測定した場合）菌体と不溶解残燈を培養液から炉過又は
遠心分離の様な普通の方法で分離する。 次いで発酵中に得た抗生物質混合物はィオン交擬樹脂又
は他の固体吸着剤上のクロマトグラフ法の様な標準分離
法によって水性培養液から分離出釆る。好ましい回収方
法は培養液をｐＨ２で炉過し、炉液解７に調整した後腸
イオン交換樹脂、好ましくは“アンバーライトＩＲＣ一
５０”又は“ＣＧ−５０’’商標で市販されている型の
弱酸性陽イオン交モ奥樹脂、最も好ましいのはアンモニ
ウム型のアンバーライトｍＣ−５頂型弱酸性陽イオン交
換樹脂上に中和した炉液を吸着させるのである。抗生物
質混合物を０．州Ｎ比ＯＨの様な稀塩基で樹脂から溶離
し清性溶離液を併せて真空濃縮し凍結真空乾燥して望む
アプラマイシンおよびネブラマィシン因子Ｖ′成分およ
びネアミン、ネプラミンおよびネブラマィシン因子Ｗを
含む固体抗生物質混合物を得る。次いで得られた抗生物
質混合物を常法に従い特にアプラマィシンおよびネブラ
マィシン因子Ｖ′を含むアミノ配糖体成分に分離するか
又は混合物を分離する前に先づ塩基性加水分解によって
ネブラマィシン因子Ｖ′成分をトブラマィシンに変換さ
せる。トブラマイシンの製法 既知のネブラマィシン生産菌ストレプトマィセス テネ
プラリウスと同じ様に本発明の新規微生物も培養液中に
直接トブラマィシンを生成しない。 しかしトブラマイシンはＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ２
６（１２）：７４５−７５１（１９７３）に記載の様な
方法で発酵生成されたネブラマイシン因子Ｖ′成分から
生成出来る。トブラマィシンへの変換は発酵生成された
アミノ配糖体混合物を個々の抗生物質成分に分離する前
でも後でも行なうことができる。本発明によるトブラマ
ィシンのよい製造方法はへＴ．Ｃ．Ｃ．３１２１７、３
１２１８又は３１２１９の同定特性をもつストレブトア
ロテイクスヒンズスタヌスのネブラマイシン因子Ｖ′生
産株を上記のとおり発酵してネブラマイシン因子Ｖ′を
含むアミノ配糖体混合物を生成し、かく生成したアミノ
配糖体温合物を培養液から得、アミノ配糖体温合物をア
ルカリ金属水酸化物と処理するか又は強塩基性陰イオン
交換樹脂上でクロマトグラフ法にかけるかして塩基性加
水分解によってそのネブラマィシン因子Ｖ′成分をトブ
ラマィシンに変換した後普通の方法、例えば下記するク
ロマトグラフ分離法によって得たアミノ配糠体混合物か
ら分離回収するのである。ネブラマイシン因子Ｖ′のト
ブラマイシンへの加水分解は強塩基性陰イオン交換樹脂
、成るべくはＯＨ型の強塩基性陰イオン交換樹脂、最も
好ましくは“ダウェツクス１×２（ＯＨ‐）”商標のも
とで市販されている型の樹脂上で抗生物質混合物（培養
液から回収した後の）水溶液をクロマトグラフ法にかけ
て行わせるのが最もよい。樹脂からの蒲性溶離液を併せ
真空濃縮し凍結真空乾燥してアプラマイシン ネアミン
、ネブラミンおよびネプラマイシン因子ＮとＶ′を含む
トブラマイシン混合物である抗生物質固体を得る。本発
明によるトブラマィシン製造別法は上記のとおりＡ．Ｔ
．Ｃ．Ｃ．３１２１７、３１２１８又は３１２１９の同
定特性をもつストレプトァロティクス ヒンズスタヌス
のネブラマィシン因子Ｖ′生産株を培養してネブラマイ
シン因子Ｖ′を含むアミノ配糖体混合物を製造し、これ
を培養液から回収し、ネブラマィシン因子Ｖ′を抗生物
質混合物から例えば下記するクロマトグラフ分離法によ
って分離しかつネブラマィシン因子Ｖ′を塩基性加水分
解によってトブラマィシンに変換するのである。 ネプラマィシン因子Ｖ′の加水分解は既知法、例えば１
００℃でアルカリ金属水酸化物との処理又はネブラマイ
シン因子Ｖ′の水溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例
えばＯＨ型ダウェックス１×２型の樹脂上でクロマトグ
ラフ法により行なうことが出来る。抗生物質の分離発酵
法によって又は発酵法によって生成した抗生物質混合物
の塩基性加水分解によって得た）抗生物質混合物からア
ミノ配糖体抗生物質の分離はこの分野で知られた種々の
方法で行ない得る。 好ましい分離法はアミノ配糖体抗生物質混合物水溶液を
陽イオン交≠鰯樹脂、好ましくは商標“アンバーライト
ＩＲＣ−５び又は“ＣＧ−５０’’の名で市販されてい
る型の弱酸性陽イオン交換樹脂、最も好ましくはアンモ
ニウム型のアンバーライトＣＧ−５０の弱酸性腸イオン
交換樹脂上でクロマトグラフ法を用いる方法である。次
いで吸着された抗生物質混合物を溶離剤として弱塩基を
使って段階的溶離をする。特によい方法は発酵堵地から
回収した抗生物質混合物水溶液をアンバーライトＣＧ−
５０（ＮＨ４十）上に吸着させ水酸化アンモニウム濃度
をＮ／２０からＮ／４に順次変えながら溶離することで
ある。この方法を使えばアプラマィシンは溶離液の初期
分別部分に現われて次いで順次ネブラマイシン因子Ｖ′
、ネアミン、トブラマィシン（塩基性加水分解が既に行
なわれていれば）およびネブラミンが含まれる。同一成
分を含む溶雛分別部分を併せ濃縮し凍結真空乾燥して個
々のアミノ配糖体抗生物質が得られる。本発明によって
生成したアミノ配導体抗生物質成分は又はこの成分の誘
導体の物理化学的分析によりこれらが実際に既知の抗生
物質ァプラマィシソ、ネブラマイシン因子Ｖ′、トブラ
マイシン、ネアミン、ネブラミンおよびネブラマイシン
因子Ｗであると確認された。 （下記実験部分参照）本発明によって製造されたアプラ
マィシン、トプラマィシンおよびネブラマイシン因子Ｖ
′抗生物質は米国特許第３６９１２７ｙ号と３８５３７
０叫号‘こ記載の普通の方法で製薬上許容される酸付加
塩類に転化母釆る。次に実施例では本発明を例証する目
的にのみ記述するもので如何なる観点からも本発明を限
定するものではない。 “アンバーライト”はペンシルバニア州フィラデルフィ
ア市のロームアンドハース社の商標である。アンバーラ
イトＩＲＣ一５０とＣＧ−５０はカルボキシルーポリメ
タアクリル型の弱酸性腸イオン交≠劉樹脂の商品名であ
る。“ダウェックスＩＸ２（ＯＨ−）”はミシガン州ミ
ルドランド市のダウケミカル社のスチレンージビニル−
ベンゼン共重合体からつくった強塩基性陰イオン交去勢
樹脂の商品名である。実施例 １ 培養 Ａストレブトアロティクス ヒンズスタヌス株Ｃ６７７
−９１のよく生育した寒天斜面培養物を次の組成：グリ
セロール ２ ％ ＊フアーマメジア １ ％ コーン浸漬液 １ ％（Ｎ技）２Ｓ
０４ ０．３ ％ＺｎＳ０４・
７日２０ ０．００３％ＣａＣ
０３ ０．４ ％をもつ
栄養培地（無菌化前掛７．０）に接種した。 種培養は２５仇ｐｍの回転振とう器上で２８ｏｏで２８
間培養した。種培養液約２のＺを５００の‘ェルレンマ
ィャーフラスコ中の発酵猪地（無菌化前掛７．０）１０
０の‘中に移した。発酵培地の組成は次のとおりであっ
た。可溶性澱粉 ２ ％コーン
粉末 ２ ％＊フアーマメデイ
ア １ ％ＮａＣＩ
Ｏ．３％ＮａＣ０３
０．２％＊テキサス州フオートワース市トレ
イダースオイルミル社製工業用綿実粉末。 ２洋０で３乃至５８間振とうして抗生物質生産は最高に
達した。 ４日で約２０皿ｃｇ′の‘の最高力価に達した。 Ｂ．株Ｃ６７７−９１を使っての発酵も１０メジャー発
酵器中で行なった。 使った菌と発酵塔地は上記猿とうフラスコ法のものと同
じであった。接種菌量は１一２％で発酵器は２００一２
５仇ｐｍで潰辞し３０℃で行なった。約６０‐７０時間
で１５０‐３０肌ｃｇ／の‘の最大力価が得られた。Ｃ
．ストレプトアロティクス ヒンズスタヌス株Ｃ８０１
−１０４を使っての発酵を工程Ａの振とうフラスコ法で
行なった。 但し種塔地と発酵塔地は次の組成をもつものであった：
グリセロール ２ ％ フアーマメデイア １ ％ コーン浸糟液 １ ％（ＮＡ）２
Ｓ０４ ０．３ ％ＺｎＳ０４・
７日２０ ０．００３％ＣａＣ
０３ ０．４４日後
に２２卸ｃｇ／の‘の最大力価が得られた。 Ｄ．ストレプトアロティクス ヒンズスタヌス株Ｄ２５
１−１を使っての発酵を工程Ａの振とうフラスコ法で行
なった、但し種塔地と発酵培地は次の組成をもつもので
あった：グリセロール ２ ％ フアーマメデイア １ ％ コーン浸溝液 １ ％（Ｎ比）２
Ｓ０４ ０．３ ％ＺｎＳ０４・
７日２０ ０．００３％ＣａＣ０
３ ０．４ ％３日後に
２０位ｈｃｇ′似の最大力価が得られた。 実施例 ２抗生物質混合物の分離 実施例１の方法によって得た培養液を炉過助村を使って
ｐＨ２で涼遇した。 炉液約４夕を柑７．０に調節しアンバーライトＩＲＣ−
５０（ＮＨ４十）のカラムにとおした。次いで力ラムを
水洗しＮ／が日４０日で溶離した。活性溶離液を併せ真
空濃縮して凍結真空乾燥して粗抗生物質固体（１．９夕
、１５仇ｈｃ夕／ｍｇ）を得た。これを次にクロマトグ
ラフ法にかけてそれがアプラマィシン、ネブラマイシン
因子Ｖ′、ネアミン、ネブラミンおよびネブラマイシン
因子Ｗの混合物であるとわかった。実施例 ３トブラマ
ィシン含有混合物の製法 実施例２で得た固体混合物を水に溶解しダウェックス１
×２（ＯＨ‐）のカラムにとおした。 活性溶離液を併せ真空濃縮し凍結真空乾燥して白色粉末
（０．４夕、６０仇ｈｃタ′の‘）を得た。この粉末を
更にクロマトグラフ分離した処アプラマィシン、ネブラ
マィシン因子Ｖ′、トブラマイシン、ツアミン、ネブラ
ミンおよびネブラマイシン因子Ｗの混合物とわかった。
実施例 ４ 抗生物質成分の分離 実施例３で得た抗生物質混合物水溶液をアンバーライト
ＣＧ−５０（ＮＨ４十）のカラムにとおした後カラムを
順次Ｎ／２止Ｎ／ＩＱＮ／８およびＮ／州比ＯＨで溶離
した。 溶離液は各１５肌部分をフラクションコレクタ一に集め
ニンヒドリン試薬と抗菌力で検べた。成分Ｂ，（アプラ
マイシン）が先づ溶離し次いで順次＆（ネブラマィシン
因子Ｗ）、Ａ，（ネブラマイシン因子Ｖ′）、Ａ２（ネ
アミン）、ん（トプラマィシン）およびＡ４（ネブラマ
ィシン）であった。各成分をァンバ−ライトＣＧ５ｑ篤
脂（ＮＨ４十）上で再びクロマトグラフ法により精製し
た。カラムからの抗生物質の分布は次のとおりであった
：渋実施例３Ｋ記載のダゥェックス１×２樹脂法を抗生
物質混合物の製造において省略した場合Ａ３成分は得ら
れなかった。 各成分の性質と既知抗生物質との同定 実施例４において得られた成分Ａ，を炭酸塩として単離
しＣ，９日３８Ｎ６０，。 ・日２Ｃ０３として分析した：計算値：Ｃ，４１．９５
；日，７．０４；Ｎ’１４．６＆測定値：Ｃ，４１．９
６：日，７．１１：Ｎ’１４．５＆成分Ａ，のＵＶスペ
クトルは末端吸収のみを示しまたＩＲスペクトルは１７
１０弧‐１に特徴的な強い吸収バンドを示した。 ＤＣＩ／Ｄ２０におけるＮＭＲスペクトルは６１．７一
２７ｐｐｍに２メチレン基と６５．１８‘ｄ｝および５
．８６‘ｄ｝ｐｐｍに２個のアノメリツク・（ａ肌ｍｅ
ｒｉｃ）プロトンの存在を示した。０．印ＮａＯＨ中の
成分Ａ，のアルカリ性加水分解（１００℃、１時間）は
トブラマイシンと同定された成分んを与えた。 Ｂａ（ＯＨ）２液中での成分Ａ，の処理（１００ｑｏ、
４時間）は殆んど等モル量のアンモニアと炭酸バリウム
を与え成分Ａ，が６″ー○ーカルバモイルトブラマイシ
ン（ネブラマイシン因子Ｖ′）であることを示した。成
分んとＡ４は既知の試料と直接比較してそれぞれネアミ
ンおよびネブラミンと同定された。 成分ＢはＣ２，比，Ｎ５０，．として分析した。計算値
：Ｃ，４６．７４；日，７．６６：Ｎ，１２．９３。測
定値：Ｃ，４６．２２：日，７．６０：Ｎ，１２．７９
。成分ＢのＮＭ旧スペクトルは６２．９（Ｓ）ｐｐｍに
おいてＩＮ−ＣＨ３基と８５．３０ｄｌ、６５．５鰍ｄ
）および６５．８９ｄーｐｐｍ‘こ３個のアノメリツク
プロトンの存在を示した。成分ＢはＴＬＣ、ＩＲおよび
ＮＭ旧スペクトルによってアプラマィシンと同定された
。成分＆の０．州ＮａＯＨのアルカリ性加水分解は力ナ
マィシソＢと同定された生物活性をもつ分解生成物を与
えた。成分Ｂ２をＢａ（ＯＨ）２中で加熱すると殆んど
定量的量のアンモニアと炭酸バリウムとなった。成分Ｂ
は標準試料と比較してパブラマイシン因子Ｗ（６″ー○
ーカルバモイルカナマイシンＢ）と同定された。各成分
のＲｆ値（シリカゲル薄層クロマトグラフ法によって検
べた）は標準試料のそれと共に次の表に示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトアロテイクス属に属するアプラマイシン
   および／またはネブラマイシン因子Ｖ′生産菌を培養し
   、培養物からアプラマイシンおよび／またはネブラマイ
   シン因子Ｖ′からなるアミノ酸糖体抗生物質を採取する
   ことを特徴とするアプラマイシンおよび／またはネブラ
   マイシン因子Ｖ′からなるアミノ酸糖体抗生物質の製造
   法。 ２ 微生物がストレプトアロテイクスヒンズスタヌスＡ
   ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２１７である特許請求の範囲第１項
   に記載方法。 ３ 微生物がストレプトアロテイクスヒンズスタヌスＡ
   ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２１８である特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ４ 微生物がストレプトアロテイクスヒンズスタヌスＡ
   ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２１９である特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ５ ストレプトアロテイクス属に属するネブラマイシン
   因子Ｖ′生産菌を培養し、培養物からネブラマイシン因
   子Ｖ′からなるアミノ酸糖体抗生物質を採取しこれを塩
   基性加水分解によつてトプラマイシンに転化することを
   特徴とするトプラマイシンの製造法。 ６ 微生物がストレプトアロテイクスヒンズスタヌスＡ
   ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２１７である特許請求の範囲第５項
   に記載の方法。 ７ ８ 微生物がストレプトアロテイクスヒンズスタヌスＡ
   ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．３１２１９である特許請求の範囲第５項
   に記載の方法。