CN114381418B

CN114381418B - 一种提高安普霉素发酵单位的发酵培养基及其应用

Info

Publication number: CN114381418B
Application number: CN202011137293.XA
Authority: CN
Inventors: 李继安; 林惠敏; 郭瑞玲; 孟宪纬; 张建斌; 李亚军; 詹佳弘; 杨子艳; 赵明芳; 袁笑端
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN114381418A

Abstract

本发明公开了一种发酵培养基及其应用。所述发酵培养基包括：(1)7％碳源，所述碳源除包括豆油外，还包括葡萄糖、麦芽糖精和玉米粉中的一种或多种；(2)5.5％氮源，所述氮源选自冷豆粉、花生粉、海豚蛋白胨和酵母粉YP600中的一种或多种；和，(3)0.9～1.1％无机盐，所述无机盐选自氯化铵、硫酸镁、氯化锰、硫酸锌、硫酸亚铁和碳酸钙中的一种或多种；且余量为水，所述％为占发酵培养基的质量体积百分比g/100mL。该发酵培养基可提高安普霉素发酵单位，从现有技术的5.3g/L提高为至少6.25g/L，提高了18％。

Description

一种提高安普霉素发酵单位的发酵培养基及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种提高安普霉素发酵单位的发酵培养基及其应用。

背景技术

安普霉素是一种广泛应用的广谱抗生素，目前提高安普霉素的方法主要是进行菌种的基因工程改造及菌种选育，但效果并不明显，本发明通过对发酵培养基进行优化使安普霉素发酵效价得到显著提升。

田威等(田威.安普霉素产生菌的研究[D].沈阳药科大学,2002)利用均匀设计实验优化了安普霉素发酵培养基，最终确定安普霉素最佳发酵条件为：葡萄糖4.5g/L、水解淀粉3.0g/L、黄豆饼粉2.0g/L、甘油0.3g/L、硫酸铵0.15g/L、酵母粉0.1g/L、花生饼粉3.5g/L、NA 0.4g/L、碳酸钙0.6g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸锌0.16g/L，pH 6.8，并进行了摇瓶种子的二级培养及发酵过程中补加葡萄糖，最终发酵单位也仅为5.3g/L。

孙桂梅等(孙桂梅.安普霉素的菌种选育[D].吉林大学,2006)使用的基础培养基为：G 2.0％、G10 0.5％、WS 4.0％、SBP 5.0％、PCP 2.0％、SA 0.2％、MgSO₄ 0.2％、CaCO₃0.5％、DCA 0.03％，摇瓶种子采用二级种子摇瓶的方式进行培养，通过菌种选育使安普霉素最终效价达到4.9g/L。然而，现有技术中的安普霉素的效价较低，仍不能满足本领域的生产需求。

发明内容

为解决现有技术中生产安普霉素的效价较低的技术问题，本发明提供了一种发酵培养基及其应用。所述发酵培养基可提高菌株生产发酵安普霉素的效价。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种发酵培养基，其中所述发酵培养基包括：

(1)7％碳源，所述碳源除包括豆油外，还包括葡萄糖、麦芽糖精和玉米粉中的一种或多种；

(2)5.5％氮源，所述氮源选自冷豆粉、花生粉、海豚蛋白胨和酵母粉YP600中的一种或多种；和，

(3)0.9～1.1％无机盐，所述无机盐选自氯化铵、硫酸镁、氯化锰、硫酸锌、硫酸亚铁和碳酸钙中的一种或多种；

且余量为水，所述％为占发酵培养基的质量体积百分比g/100mL。

优选地，所述碳源除包括1％豆油外，还包括总量为6％的葡萄糖、麦芽糖精和玉米粉；优选地，所述碳源为1％豆油、3％葡萄糖、2％麦芽糖精和1％玉米粉；更优选地，所述发酵培养基的pH为7.0～7.1。

更优选地，所述氮源选自以下组：

(1)冷豆粉和海豚蛋白胨；

(2)冷豆粉、花生粉和海豚蛋白胨；或，

(3)冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600。

在优选的实施例中，当所述氮源为冷豆粉和海豚蛋白胨时，所述冷豆粉和海豚蛋白胨的含量分别为4.5％和1％，安普霉素的效价为6.25g/L。当所述氮源为冷豆粉、花生粉和海豚蛋白胨时，所述冷豆粉、花生粉和海豚蛋白胨的含量分别为3.5％、1％和1％，安普霉素的效价为7.05g/L。当所述氮源为冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600时，所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3～4％、1～1.5％和0.5～1.5％。

在一更优选的实施例中，所述氮源为冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600，且所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3～3.5％、0.5～1.5％和0.5～1.5％。

优选地，所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3.5％、1.0％和1.0％，安普霉素的效价为7.97g/L。所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3.5％、1.5％和0.5％，安普霉素的效价为12.43g/L。或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3％、1.5％和1％，安普霉素的效价为10.53g/L。或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3％、1％和1.5％，安普霉素的效价为10.21g/L。或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3.5％、0.5和1％，安普霉素的效价为9.95g/L。或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为4％、1和0.5％，安普霉素的效价为9.46g/L。或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为4％、0.5和1％，安普霉素的效价为8.76g/L。

优选地，在上述发酵培养基中，所述无机盐含量为0.988％，更优选包括0.5％氯化铵、0.4％硫酸镁、0.03％氯化锰、0.003％硫酸锌、0.005％硫酸亚铁和0.5％碳酸钙。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种发酵生产安普霉素的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)将黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)优选保藏编号为ATCC17920的菌株在种子培养基中培养，得种子液；

(2)将(1)制得的种子液按5～20％优选10％比例加入如权利要求1～6任一项所述的发酵培养基中进行发酵，离心即得含安普霉素的发酵液；所述％为种子液占发酵培养基的体积百分比。

优选地，所述种子培养基包括1.0％葡萄糖、0.5％玉米粉、1.0％冷豆粉、0.1％酵母膏、0.3％蛋白胨和0.1％碳酸钙，pH为7.0～7.4，余量为水；所述％为质量体积百分比g/100mL。

更优选地，(1)中所述培养的条件为：37℃、200～240rpm震荡培养22～24个小时；和/或，(2)中所述发酵的条件为37℃、200～240rpm震荡培养6～7天，所述离心优选12000rpm。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种如上任一项所述的发酵培养基在生产安普霉素中的用途。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

通过对发酵培养基中碳氮源的替代及添加使安普霉素的产量有了显著的提高，发酵单位提高到至少6.25g/L，提高至现有技术的118％；优选的技术方案则可提高至12.43g/L，提高至出发产量的311.6％，极大的降低了企业生产成本，具有重要的工业价值。

附图说明

图1发酵培养基优化前后发酵144h的菌丝形态对比图。左：发酵培养基优化前，右：发酵培养基优化后。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

一.实验材料

1.仪器

2.试剂

3.菌种

本发明可采用菌种黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)的菌株，例如保藏编号为ATCC 17920菌株，或其阻断突变株(武慧渊，安普霉素产生菌的研究，学位论文，沈阳药科大学，1998)。以下实施例使用了ATCC 17920菌株。

4.培养基

培养基一：斜面培养基(g/100mL)：可溶性淀粉2.0，牛肉膏0.1，磷酸氢二钾0.05，氯化钠0.05，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.001，硝酸钾0.1，琼脂粉1.4，余量为水，灭菌前pH7.2-7.4。

培养基二：优化种子培养基(g/100mL)：葡萄糖1.0，玉米淀粉2.0，热榨豆粉1.13、花生粉1.7，酵母粉YP200 0.57，碳酸钙0.1，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.08，余量为水，pH自然(7.0-7.1)。

培养基三：基础发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖4.0，冷豆粉4.0，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，余量为水，灭菌前pH调至7.0-7.1。

二.方法

1.培养方法

灭菌条件：121℃，20min；文中所指含量均为重量百分比。

在无菌条件下，用已灭菌的接种针将保存有黑暗链霉菌的冻干管中接种到装有斜面培养基的茄子瓶中培养，斜面培养第四天可见表面白色菌体，第五天或者第六天，颜色加深，并看到白色孢子生成，继续培养直到可以看到培养基表面产生大量白色孢子，培养基基体本身由于黑暗链霉菌色素的产生变成灰褐色。此斜面可进行传代或者接种使用。

根据种子培养基配方配制种子培养基，无菌条件下，用灭菌接种铲轻轻划破长有孢子的斜面培养基，挖取尽量薄的1cm×2cm左右的长满孢子的斜面培养基，接种到已经灭好菌的种子培养基中，摇床37℃，240rpm，22-24个小时，摇瓶中培养物变成黄色浑浊物，摇之，有流动感，粘度较大，贴壁均匀滑下。镜检菌丝成团状，向四周发散，菌丝较长，无杂菌，pH 7.5-7.6。

2.检测方法

1)流动相：水相0.5％醋酸溶液，有机相纯乙腈

2)液相条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)；

流速1.0mL/min；进样2μL；检测波长350nm；柱温30℃；梯度洗脱。

三.结果

根据摇瓶发酵培养基配方，配制发酵培养基，调pH 7.0-7.1，250mL锥形瓶装量35mL，灭菌。无菌条件接种10％，置于摇床37℃，240rpm，培养6-7天。发酵液12000rpm离心，取上清进行柱前衍生化后用高效液相色谱仪测发酵单位。

实施例1发酵培养基中碳源含量实验

以基础发酵培养基配方为对照，在氮源、无机盐等成分保持不变的条件下，探索葡萄糖的用量。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

根据以上实验的结果，优化后的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖6.0，冷豆粉4.0，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

实施例2发酵培养基中碳源替代实验

以实施例1优化后的培养基配方为对照，在氮源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，以2％的其他碳源对葡萄糖进行部分替代。

碳源种类	葡萄糖	玉米粉	玉米淀粉	麦芽糊精	麦芽糖	蔗糖
							效价(g/L)	4.58	4.85	2.47	5.17	3.30	4.30

优化后的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖4.0，麦芽糊精2.0，冷豆粉4.0，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

实施例3

以实施例2优化后的培养基配方为对照，在氮源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，以1％的其他碳源对葡萄糖进行部分替代。

碳源种类	葡萄糖	玉米粉	玉米淀粉	麦芽糊精	麦芽糖	蔗糖
							效价(g/L)	5.17	5.58	3.46	5.27	4.29	4.65

优化后的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖3.0，麦芽糊精2.0，玉米粉1.0，冷豆粉4.0，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

实施例4冷豆粉的含量实验

以实施例3优化后的培养基配方为对照，在碳源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，对培养基中的冷豆粉的含量进行考察。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

根据以上实验的结果，优化后的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖3.0，麦芽糊精2.0，玉米粉1.0，冷豆粉4.5，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

实施例5冷豆粉的部分替代实验

以实施例4优化后的培养基配方为对照，在碳源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，以1％的其他氮源对冷豆粉进行部分替代。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

根据以上实验的结果，优化后的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖3.0，麦芽糊精2.0，玉米粉1.0，冷豆粉3.5，花生粉1.0，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

实施例6海豚蛋白胨的完全替代实验

以实施例5优化后的培养基配方为对照，在碳源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，对培养基中的海豚蛋白胨进行完全替代。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

优化后的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖3.0，麦芽糊精2.0，玉米粉1.0，冷豆粉3.5，花生粉1.0，酵母粉YP600 1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

实施例7氮源配比实验

以实施例6的培养基配方为对照，在碳源、无机盐等其他成分保持不变且保持总氮源为5.5％的的条件下，考察冷豆粉、花生粉、酵母粉YP600三者的配比。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

本实施例中最优的配方为(添加量为g/100mL)：葡萄糖3.0，麦芽糊精2.0，玉米粉1.0，冷豆粉3.5，花生粉1.5，酵母粉YP600 0.5，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，自来水100ml，灭菌前pH调至7.0-7.1。

总结：综合上述实施例，由安普霉素的生产效价可知，本发明最优的发酵培养基及其组分含量(g/100ml)为：葡萄糖3.0，麦芽糊精2.0，玉米粉1.0，冷豆粉3.5，花生粉1.5，YP600 0.5，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，灭菌前pH 7.0-7.1，添加自来水至100ml。

Claims

1.一种发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括：

（1）7%碳源，所述碳源为1%豆油、3%葡萄糖、2%麦芽糊精和1%玉米粉；

（2）5.5%氮源，所述氮源为冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600，且所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3~3.5%、0.5~1.5%和0.5~1.5%；和，

（3）1.438%无机盐，所述无机盐包括0.5%氯化铵、0.4%硫酸镁、0.03%氯化锰、0.003%硫酸锌、0.005%硫酸亚铁和0.5%碳酸钙；

且余量为水，所述%为占发酵培养基的质量体积百分比g/100mL。

2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的pH为7.0~7.1。

3.如权利要求1或2所述的发酵培养基，其特征在于，所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3.5%、1.5%和0.5%，或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3%、1.5%和1%，或所述冷豆粉、花生粉和酵母粉YP600的含量分别为3%、1和1.5%。

4.一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）将黑暗链霉菌（Streptomycestenebrarius）在种子培养基中培养，得种子液；

（2）将（1）制得的种子液按5~20%比例加入如权利要求1-3任一项所述的发酵培养基中进行发酵，离心即得含安普霉素的发酵液；所述%为种子液占发酵培养基的体积百分比。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述黑暗链霉菌为保藏编号为ATCC 17920的菌株；和/或，

所述种子液按10%比例加入如权利要求1-3任一项所述的发酵培养基中进行发酵。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括1.0%葡萄糖、2.0%玉米淀粉、1.13%热榨豆粉、1.7%花生粉、0.57%酵母粉YP200、0.1%碳酸钙、0.1%磷酸氢二钾和0.08%硫酸镁，pH为7.0~7.4，余量为水；所述%为质量体积百分比g/100mL。

7. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，（1）中所述培养的条件为：37℃、200~240rpm震荡培养22~24个小时；和/或，（2）中所述发酵的条件为37℃、200~240 rpm震荡培养6~7天。

8.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述离心为12000rpm。

9.如权利要求1-3任一项所述的发酵培养基在生产安普霉素中的用途。