CN109504729B - 一种万古霉素的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种万古霉素的发酵方法，该方法是在常规万古霉素发酵方法的基础上，在发酵过程中补加硫酸铵，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.1％‑0.5％，至发酵结束后，与没有补加硫酸铵的发酵方法相比，万古霉素的含量可提高15％以上。本发明方法操作简单，极大提高了万古霉素的产量，取得了良好的经济效益，值得推广使用。

Description

一种万古霉素的发酵方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体地说涉及一种万古霉素的发酵方法。
背景技术
万古霉素(Vancomycin)，是由东方链霉菌(Streptomyces Orientalis)菌株产生的一种糖肽类窄谱抗生素。主要对革兰氏阳性菌有效，如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株)以及链球菌(包括化脓性链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、草绿色链球菌)、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌(对难辨梭状芽孢杆菌高度敏感)、放线菌、链球菌属、牛链球菌、肠球菌、类白喉菌等。
在现有技术中，万古霉素的发酵生产方法都是采用常规发酵，没有发酵中补料的方式，发酵过程比较简单，但产量较低。
硫酸铵纯品为无色斜方晶体，工业品为白色至淡黄色结晶体，主要用作肥料，适用于各种土壤和作物。还可用于纺织、皮革、医药等方面。生物学上多用于蛋白纯化工艺方面，因为硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白活性，另外，硫酸铵的可溶性极好，能形成高盐环境，对于蛋白沉淀与后续的高盐纯化做准备。硫酸铵在零度与常温25℃的溶解度有较大区别。现有技术未见有硫酸铵用于发酵生产万古霉素的报道，也没有发酵过程中补加硫酸铵以提高万古霉素得率的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高万古霉素产量的发酵方法。
本发明提供的一种万古霉素的发酵方法是在发酵过程中，补加硫酸铵。
进一步地，是在发酵过程中，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。此处％是硫酸铵纯体占发酵液的体积比。
优选地，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.1％-0.4％。
优选地，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.1％-0.3％。
更优选地，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.2％-0.3％。
最优选地，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.3％。
更进一步地，本发明的发酵方法是将万古霉素生产菌种的成熟种子液接入发酵培养基中培养，从发酵第2天开始，补加硫酸铵溶液。万古霉素生产菌种为东方链霉菌。
所述发酵培养基的配方为：麦芽糊精6％，黄豆粉4％，酵母粉0.5％，轻质碳酸钙0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.05％，此培养基配方是在常规的万古霉素发酵培养基的基础上经过优化得到的。
进一步地，本发明提供了一种优化了的用于发酵生产万古霉素的培养基，其配方为：麦芽糊精6％，黄豆粉4％，酵母粉0.5％，轻质碳酸钙0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.05％，余量为水；所述％为质量百分比。
本发明提供了上述培养基在发酵生产万古霉素或提高万古霉素产量中的应用。
本发明提供了硫酸铵在提高万古霉素产量中的应用。通过在发酵的第2天开始，每天按照上述用量向发酵液中补加硫酸铵。
本发明是在常规万古霉素发酵方法的基础上，在发酵过程中补加硫酸铵，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.1％-0.5％，至发酵结束后，测得发酵液中万古霉素含量提高到9500μg/ml以上，最高可以达到10157μg/ml。与没有补加硫酸铵的发酵方法相比，万古霉素的含量可提高15％以上。本发明方法操作简单，极大提高了万古霉素的产量，取得了良好的经济效益，值得推广使用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1本发明的万古霉素发酵方法(1)
种子培养：用万古霉素生产菌种东方链霉菌(从北京凯特伟科技发展有限公司引进)，接入种瓶培养，30℃，24小时培养。发酵培养：将成熟种子液接入发酵罐培养。发酵培养基配方为：麦芽糊精6％，黄豆粉4％，酵母粉0.5％，轻质碳酸钙0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.05％，余量为水，32℃，7天发酵，从发酵的第2天开始补加硫酸铵溶液，每天补加的硫酸铵量为硫酸铵纯体占发酵液体积的0.1％。发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为9877μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量(实验组)与没有补加硫酸铵的对照组(发酵培养基和发酵方法均与实验组相同，不同在于没有补加硫酸铵)相比，万古霉素含量提高12.52％。
实施例2本发明的万古霉素发酵方法(2)
种子培养：用万古霉素生产菌种东方链霉菌(发酵使用的菌种是从北京凯特伟科技发展有限公司引进)，接入种瓶培养，30℃，24小时培养。发酵培养：将成熟种子液接入发酵罐培养，发酵罐配方为：麦芽糊精6％，黄豆粉4％，酵母粉0.5％，轻质碳酸钙0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.05％，余量为水。32℃，7天发酵，从发酵的第2天开始补加20％硫酸铵溶液，每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.3％。发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐，万古霉素含量为10157μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量(实验组)与没有补加硫酸铵的对照组(发酵方法、培养基与实验组均相同)相比，万古霉素含量提高15.71％。
实施例3本发明的万古霉素发酵方法(3)
种子培养：用万古霉素生产菌种东方链霉菌(发酵使用的菌种是从北京凯特伟科技发展有限公司引进)，接入种瓶培养，30℃，24小时培养。发酵培养：将成熟种子液接入发酵罐培养，发酵罐配方为：麦芽糊精6％，黄豆粉4％，酵母粉0.5％，轻质碳酸钙0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.05％，余量为水，32℃，7天发酵，从发酵的第2天开始补加20％硫酸铵溶液，每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.5％。发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为9626μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量(实验组)与没有补加硫酸铵的对照组(发酵方法、培养基与实验组均相同)相比，万古霉素含量提高9.66％。
实施例4每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.05％
菌种、发酵培养基、发酵方法均同实施例2，不同在于从发酵的第2天开始补加硫酸铵，每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.05％。发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为9004μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量与没有补加硫酸铵的对照组相比，万古霉素含量提高2.57％。
实施例5每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.8％
菌种、发酵培养基、发酵方法均同实施例2，不同在于从发酵的第2天开始补加硫酸铵，每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.8％。发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为8553μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量与没有补加硫酸铵的对照组相比，万古霉素含量降低2.56％。说明在万古霉素发酵过程中，补加硫酸铵的量多到硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.5％以上，会抑制万古霉素的得率。
实施例6采用现有技术已公开的发酵培养基且不补加硫酸铵
种子培养：用万古霉素生产菌种东方链霉菌(发酵使用的菌种是从北京凯特伟科技发展有限公司引进)，接入种瓶培养，30℃，24小时培养。发酵培养：将成熟种子液接入发酵罐培养，发酵罐配方为：葡萄糖2％，淀粉3％，豆粕1.8％，黄豆粉2.2％，轻质碳酸钙0.2％，余量为水(此发酵配方为已经公开报道的配方)。32℃，发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为5257μg/ml。
实施例7采用本发明优化后的发酵培养基但不补加硫酸铵
种子培养：用万古霉素生产菌种东方链霉菌(发酵使用的菌种是从北京凯特伟科技发展有限公司引进)，接入种瓶培养，30℃，24小时培养。发酵培养：将成熟种子液接入发酵罐培养，发酵罐配方为：麦芽糊精6％，黄豆粉4％，酵母粉0.5％，轻质碳酸钙0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.05％，余量为水(此配方为本申请优化后的配方)。32℃，发酵周期为7天，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为8778μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量与培养基优化之前(实施例6的培养基)的对照组相比，万古霉素含量提高66.98％。
实施例8采用现有技术已公开的发酵培养基且补加硫酸铵
种子培养：用万古霉素生产菌种东方链霉菌(发酵使用的菌种是从北京凯特伟科技发展有限公司引进)，接入种瓶培养，30℃，24小时培养。发酵培养：将成熟种子液接入发酵罐培养，发酵罐配方为：葡萄糖2％，淀粉3％，豆粕1.8％，黄豆粉2.2％，轻质碳酸钙0.2％，余量为水(此发酵培养基同实施例6)。32℃，发酵周期为7天，从发酵的第2天开始补加20％硫酸铵溶液，每天补加的硫酸铵纯体占发酵液体积比为0.3％，最后用高效液相色谱法检测万古霉素的含量，最后放罐万古霉素含量为6745μg/ml。
发酵结束后测得万古霉素含量与没有补加硫酸铵的对照组相比，万古霉素含量提高28.31％。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种万古霉素的发酵方法，其特征在于，将万古霉素生产菌种的成熟种子液接入发酵培养基中培养，从发酵第2天开始，补加硫酸铵溶液，所述发酵培养基的配方为：麦芽糊精6%，黄豆粉4%，酵母粉0.5%，轻质碳酸钙0.3%，氯化钠0.1%，磷酸氢二钾0.05%，余量为水；所述%为质量百分比；
每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.10%-0.50%，
所述万古霉素生产菌种为东方链霉菌，发酵周期为7天。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.10%-0.40%。
3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.10%-0.30%。
4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.20%-0.30%。
5.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.30%。
6.一种利用优化的培养基结合发酵过程中补加硫酸铵工艺的发酵生产万古霉素的方法，其特征在于，
所述方法为：将万古霉素生产菌种的成熟种子液接入发酵培养基中培养，从发酵第2天开始，补加硫酸铵溶液，每天补加硫酸铵的量为发酵液总体积的0.10%-0.50%；
所述优化的培养基配方为：麦芽糊精6%，黄豆粉4%，酵母粉0.5%，轻质碳酸钙0.3%，氯化钠0.1%，磷酸氢二钾0.05%，余量为水；所述%为质量百分比。
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CN105755077A (zh) * 2016-05-19 2016-07-13 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种利用东方链霉菌发酵生产万古霉素的发酵培养基和补料方法

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万古霉素发酵工艺优化;彭哲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;20110715(第07期);第1.2.7节，第三章 *

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