CN108277243B - 一种假单胞菌酸a的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种假单胞菌酸A的制备方法，其包括以下步骤：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌种在液体发酵培养基中深层发酵至菌体浓度达5g/L；按1.0‑3.0g/L浓度补加亚油酸和亮氨酸的混合物，然后流加氨水和柠檬酸钠的混合物，控制pH在5.5‑5.8；继续深层发酵至所需假单胞菌酸A浓度后终止发酵。本发明微生物生产方法可显著提高荧光假单胞菌发酵液中假单胞菌酸A的产量，其产量高达3462mg/L，高于已有文献报道的产量。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种假单胞菌酸A的制备方法。
背景技术
假单胞菌酸A(Pseudomonic acid A)，分子结构如(I)，化学名称为9-{4-[5S(2S,3S-环氧-5S-羟基-4S-甲基已基)-3R,4R-二羟基-四氢吡喃-2S-基]-3-甲基丁-2(E)-烯酰氧基}壬酸，由假单胞菌(Pseudomonas sp.)发酵生产，是一种具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤活性的新型强效免疫抑制剂。对革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有很强的抗菌活性。对一些革兰氏阴性菌，如流感嗜血杆菌，淋球菌等也有抗菌效果。由于假单胞菌酸A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的治疗显示出了独特的疗效，具有重要的临床应用前景。
假单胞菌酸A可以通过液体发酵培养荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)进行生产，近年来，假单胞菌酸A液体发酵技术取得了很大进展，CN1203184C提出了一种利用微生物发酵制备假单胞菌酸A抗生素的方法；CN101591333B提出了一种从发酵液提纯假单胞菌酸A的方法。但假单胞菌酸A发酵生产水平较低，而且假单胞菌的培养过程除了会产生主产物假单胞菌酸A外，还有产生大量的结构类如假单胞菌酸B、C、D组份，假单胞菌酸B在C8位置有额外的羟基，假单胞菌酸C在C10和C11间有一个替代PA-A的环氧化物的双键，假单胞菌酸D在9-羟基-壬酸部分的C4'和C5'具有双键。这些副产物导致假单胞菌酸A产量低以及目标产物的纯度低，生产成本较高，但如何进一步提高假单胞菌酸A的产量以降低生产成本、提高经济效益，已成为假单胞菌酸A工业化推广亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中假单胞菌酸A发酵的产量低、纯度低，生产成本较高的不足，本发明提供一种能显著提高荧光假单胞菌发酵液中假单胞菌酸A产量、且生产工艺简单、添加物成本低廉、发酵时间相对较短的假单胞菌酸A的制备方法。
本发明人通过发酵菌株的选育、发酵基质和发酵过程的优化，如优化培养基组成、优化发酵过程参数，或采用补料-分批发酵等策略可以提高假单胞菌酸A的产量；另一方面在高产菌株选育和发酵工艺优化的基础上，通过添加外源物质促进假单胞菌酸A的生物合成也是提高假单胞菌酸A产量的重要手段。本发明人通过大量的筛选实验，找到了一种能显著提高假单胞菌酸A产量的外源添加物质，同时对发酵策略进行了优化设计，形成了一种能显著提高荧光假单胞菌发酵液中假单胞菌酸A产量、且生产工艺简单的假单胞菌酸A生产工艺。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案之一是：
提供一种假单胞菌酸A的制备方法，其依次包括以下步骤：
(1)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌种在液体发酵培养基中深层发酵至菌体浓度达5g/L；
(2)按1.0-3.0g/L浓度补加亚油酸和亮氨酸的混合物，然后流加氨水和柠檬酸钠的混合物，控制pH在5.6-5.8；
(3)继续深层发酵至所需假单胞菌酸A浓度后终止发酵。
本发明中，深层发酵是指菌种接入液体发酵培养基，持续通入无菌空气并搅拌的一种发酵方式。补料为现在工业发酵常用的方式，是指发酵过程中补加物料。所需假单胞菌酸A浓度是根据其产量和发酵时间平衡来选择的，通常指其与现有技术相比的更高的假单胞菌酸A浓度。
本发明人通过诸多试验和研究发现，亚油酸有利于改善菌体对营养物的吸收，而亮氨酸可以促进假单胞菌酸A的合成。进一步地，亚油酸/亮氨酸混合物浓度太低促进假单胞菌酸A合成的效果不显著，太高成本增加而且假单胞菌酸A的产量达到一定程度后也不再增加；而pH低于5.6则可能会抑制菌体的生长，高于5.8则反而会抑制产物的合成。
本发明制备方法适用于现有产假单胞菌酸A的荧光假单胞菌。优选地，所述荧光假单胞菌为保藏号为CGMCC No.7147的荧光假单胞菌株(参见CN103820369A)；通常地，步骤(3)可以根据假单胞菌酸A产量和发酵时间平衡选择发酵终止，当荧光假单胞菌选择CGMCCNo.7147菌株时，一般所述假单胞菌酸A产量不低于2850mg/L；较佳地不低于2900mg/L；更佳地不低于3000mg/L。
优选地，上述制备方法使用的发酵培养基为荧光假单胞菌现有常规的液体发酵培养基，例如参考CN103820369A。优选地，所述荧光假单胞菌液体发酵培养基为LB培养基；或组成为：甘油50g/L、黄豆饼粉10g/L、蛋白胨10g/L、(NH4)2SO4 5g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO43g/L、余量为水，pH7.0-7.2的培养基。
进一步更优选地，上述的制备方法中，所述的深层发酵在温度为26-32℃、通气量1:0.5-1:1.5vvm、搅拌速度180-220rpm的发酵罐中进行；优选地，所述发酵温度为30℃，通气量1:1vvm，所述搅拌速度200rpm。
优选地，上述的制备方法中，所述的步骤(1)之前还包括常规的种子培养步骤，例如参照CN103820369A，具体包括以下步骤：
(01)将所述菌种接种到种子培养基中，所述种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 1g/L，余量为水，pH7.0-7.2；然后在温度为26-32℃、转速为180-220rpm的摇瓶中发酵16-32小时，获得种子液；优选地，在发酵温度为30℃、转速为200rpm的回转式摇瓶柜中发酵24小时；
(02)将步骤(01)中获得的种子液制备成0.5-1.5g/L的菌液，按体积比1-1.5％的比例接种到所述发酵培养基中；优选地，种子液制备成1.0g/L的菌液，按体积比1％的比例接种。
更优选地，上述的制备方法，所述补加的亚油酸和亮氨酸混合物其质量比为1:3-3:1。在本发明中，亚油酸和亮氨酸的质量比太低，促进假单胞菌酸A合成的效果不显著，质量比太高则增加成本。优选地，所述补加的亚油酸和亮氨酸混合物其质量比为1:2-2:1；更优选为1:1。
更优选地，控制pH的氨水和柠檬酸钠混合物的质量比为3:1-1:1。氨水是发酵工业中常用的pH调节剂，添加时易造成局部pH波动，进而影响菌种的生长代谢；柠檬酸钠为弱酸强碱盐，其提高pH的能力较氨水弱，但较氨水更温和，不会导致局部pH太大的波动，本发明采用3:1-1:1的比例，可起到扬长避短的作用，更好地调节发酵过程中的pH。进一步更优先地，氨水和柠檬酸钠混合物的质量比为2:1。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
与现有假单胞菌酸A的发酵技术相比，本发明具有以下优势：
通过在荧光假单胞菌发酵一段时间后补加适量的亚油酸和亮氨酸，同时通过补加氨水和柠檬酸钠混合物调控pH，可显著提高荧光假单胞菌发酵液中假单胞菌酸A的产量，其产量高达3462mg/L，高于已有文献报道产量(CN 103820369 A，2650-2850mg/L)；且副产物如假单胞菌酸B、C和D的比例降低了。本发明添加的可食用的亚油酸和亮氨酸无毒副作用，且添加量很少，成本较低。本发明的发酵工艺简单，且假单胞菌酸A总的发酵时间较短，生产效率明显提高，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl l g/L，琼脂20g/L，余量为水，pH7.0-7.2；
种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，余量为水，pH7.0-7.2；
发酵培养基：甘油50g/L，黄豆饼粉10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L,MgSO4 3g/L,K2PO4 1g/L，余量为水，pH7.0-7.2。
种子液的配制：采用CN103820369B中的荧光假单胞菌株(Pseudomonasfluorescens)，其于2013年01月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的菌株名称是：RB-MP-1；分类命名是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)；保藏编号为：CGMCC No.71470。将保存在斜面上的菌种接种于含0.7L种子培养基的1L摇瓶中，在发酵温度为30℃、转速为200rpm的回转式摇瓶柜中发酵24小时，获得种子液。
假单胞菌酸A、B、C、D含量的HPLC分析(标准品购自USP ROCKVILLE)：取发酵液，12,000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析。HPLC分析条件为：
HPLC柱：C18，250*4.6mm；
流动相：50mmol/L磷酸二氢钠(pH6.3):乙腈＝75:25；
流速：1ml/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
检测波长：229nm。
本发明以下实施例中的种子液浓度指的是接种时种子液的初始浓度，发酵后菌体的浓度以及流加亚油酸、亮氨酸的浓度指的是其在发酵液中的终浓度。
实施例1
种子液以无菌水调成1.0g/L的浓度(以菌体干重计)，然后体积比1.0％的比例接种到装有60L液体发酵培养基的100L发酵罐中。发酵温度为30℃、通气量1:1vvm、搅拌200rpm，先发酵至菌体浓度达5g/L，然后一次性补加2.0g/L的亚油酸和亮氨酸混合物(两者质量比为1:2)于发酵液中，并流加氨水和柠檬酸钠的混合物(两者质量比为2:1)控制pH在5.6左右，相同条件下继续发酵72小时，结束发酵，收获发酵物。
经HPLC分析，假单胞菌酸A含量为3147mg/L。
实施例2
种子液以无菌水调成1.0g/L的浓度(以菌体干重计)，然后体积比1.0％的比例接种到装有60L液体发酵培养基的100L发酵罐中。发酵温度为30℃、通气量1:1vvm、搅拌200rpm，先发酵至菌体浓度达5g/L，然后一次性补加2.0g/L的亚油酸和亮氨酸混合物(两者质量比为1.5:1)于发酵液中，并流加氨水和柠檬酸钠的混合物(两者质量比为2:1)控制pH在5.6左右，相同条件下继续发酵84小时，结束发酵，收获发酵物。经HPLC分析，假单胞菌酸A含量为3249mg/L。
实施例3
种子液以无菌水调成1.0g/L的浓度(以菌体干重计)，然后体积比1.0％的比例接种到装有60L液体发酵培养基的100L发酵罐中。发酵温度为30℃、通气量1:1vvm、搅拌200rpm，先发酵至菌体浓度达5g/L，然后一次性补加2.0g/L的亚油酸和亮氨酸混合物(两者质量比为1:1)于发酵液中，并流加氨水和柠檬酸钠的混合物(两者质量比为2:1)控制pH在5.7左右，相同条件下继续发酵90小时，结束发酵，收获发酵物。经HPLC分析，假单胞菌酸A含量为3462mg/L。
实施例4
种子液接种量、发酵温度、通气量和搅拌转速同实施例5。接入种子液后，先发酵至菌体浓度达5g/L，然后一次性补加2.5g/L亚油酸和亮氨酸混合物(两者质量比为2:1)于发酵液中，并流加氨水和柠檬酸钠的混合物(两者质量比为2:1)控制pH在5.6左右，相同条件下继续发酵96小时，结束发酵，收获发酵物。经HPLC分析，假单胞菌酸A的产量为3317mg/L。
实施例5
种子液接种量、发酵温度、通气量和搅拌转速同实施例5。接入种子液后，先发酵至菌体浓度达5g/L，然后一次性补加3.0g/L亚油酸和亮氨酸混合物(两者质量比为,1:1)于发酵液中，并流加氨水和柠檬酸钠的混合物(两者质量比为2:1)控制pH在5.8左右，相同条件下继续发酵96小时，结束发酵，收获发酵物。经HPLC分析，假单胞菌酸A的产量为3407mg/L。
实施例6
种子液接种量、发酵温度、通气量和搅拌转速同实施例5。接入种子液后，先发酵至菌体浓度达5g/L，然后一次性补加2.5g/L亚油酸和亮氨酸混合物(两者质量比为1.5:1)于发酵液中，并流加氨水和柠檬酸钠的混合物(两者质量比为2:1)控制pH在5.6左右，继续发酵96小时，结束发酵。经HPLC分析，假单胞菌酸A的产量为3426mg/L。
对比例
种子液以无菌水调成1.0g/L的浓度(以菌体干重计)，然后体积比1.0％的比例接种到装有60L液体发酵培养基的100L发酵罐中。发酵温度为30℃、通气量1:1vvm、搅拌200rpm，发酵120小时后结束发酵。经HPLC分析，假单胞菌酸A的产量为2814mg/L。
除假单胞菌酸A的产量以外，下表还显示了实施例1-6和对比例发酵产物的其余数据，并对各实施例与对比例的数据进行统计学检验。
表1假单胞菌酸A的产量(mg/L)及其在产物中的含量(w/w％)
*：产量低于检测限，无法测得；#：p<0.05；##：p<0.01。
由表1可知，经显著性检验，实施例中假单胞菌酸A的含量显著高于对比例，提高量在11.83-23.02％。同时实施例中假单胞菌酸B、C、D的含量显著低于对比例，在实施例3和实施例6中，假单胞菌酸D的含量为未检出，说明本发明的假单胞菌酸A发酵生产方法可以显著提高发酵液中目标产物的含量，并减少其副产物的含量。
Claims (12)
1.一种假单胞菌酸A的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
（1）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌种在液体发酵培养基中深层发酵至菌体浓度达5 g/L，所述荧光假单胞菌为保藏号为CGMCCNo.7147的荧光假单胞菌株；
（2）按1.0-3.0 g/L浓度补加亚油酸和亮氨酸的混合物，然后流加氨水和柠檬酸钠的混合物，控制pH在5.6-5.8，所述亚油酸和亮氨酸的质量比为1:3-3:1，所述氨水和柠檬酸钠的质量比为3:1-1:1；
（3）继续深层发酵至所需假单胞菌酸A浓度后终止发酵，所述的深层发酵在温度为26-32℃、通气量为1:0.5-1:1.5 vvm、搅拌速度为180-220 rpm的发酵罐中进行。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所需假单胞菌酸A浓度不低于2850 mg/L。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述假单胞菌酸A浓度不低于2900 mg/L。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述假单胞菌酸A浓度不低于3000 mg/L。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其使用的液体发酵培养基为LB培养基。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基的组成为：甘油50 g/L、黄豆饼粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、K2HPO4 1.0 g/L、MgSO4 3 g/L、余量为水，pH7.0-7.2。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述温度为30℃，所述通气量为1:1vvm，和/或所述搅拌速度为200 rpm。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）之前还包括以下步骤：
（01）将所述菌种接种到种子培养基中，所述种子培养基组成为：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 1 g/L，余量为水，pH7.0-7.2；然后在温度为26-32℃、转速为180-220 rpm的摇瓶中发酵16-32小时，获得种子液；
（02）将步骤（01）中获得的种子液制备成0.5-1.5 g/L的菌液，按体积比1-1.5%的比例接种到所述发酵培养基中。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述菌种在温度为30℃、转速为200 rpm的回转式摇瓶柜中发酵24小时；
所述种子液制备成1.0 g/L的菌液，按体积比1%的比例接种。
10.如权利要求1~9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述亚油酸和亮氨酸的质量比为1:2-2:1。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述亚油酸和亮氨酸的质量比为1:1。
12.如权利要求1~9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氨水和柠檬酸钠的质量比为2:1。
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