CN115181774A - 一种提高多粘菌素b有效组分含量的发酵液制备方法 - Google Patents

一种提高多粘菌素b有效组分含量的发酵液制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物制药技术领域，具体公开了一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，本发明通过补加关键物质肌肽，补加葡萄糖、进行培养基配方设计、分阶段控制温度与pH的控制，对发酵工艺进行精确调控，有效提升了发酵单位、提升有效组分含量，从而提升了发酵液质量。与对照例相比，发酵单位与有效组分含量均有明显提升，发酵单位最高提高了29.42％，有效组分提高了12.32％。

Description

一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法
技术领域
本发明涉及微生物制药技术领域，特别是一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法。
背景技术
多粘菌素B是一类相对分子量较大的脂肽类分子，由B1、B2、B3和B1-I四个主要组分组成。多粘菌素B为抗革兰阴性杆菌多肽类抗生素，可以改变膜结构使小分子物质泄漏而抑制革兰氏阴性菌的生长，结合到细菌脂多糖类的脂质部分，在外皮细胞膜诱发小孔。其几乎对所有革兰氏阴性菌均有较强的抑制和杀菌作用，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等，尤其对绿脓杆菌有显著作用。由于多粘菌素B对革兰氏阴性耐药菌良好的抗菌活力，近年来成为抗耐药菌药物领域的研究热点。
因多粘菌素B产物为多组分，各组分含量控制是发酵控制过程的难点。其中要求有效组分含量达到(B1、B2、B3、B1-I总含量)80％以上，且要求B3≤6％，BI-I≤18％，最大单杂≤3％，总杂≤17％。发酵液质量是影响最终成品的关键因素，其中发酵液中各组分含量满足要求，且有效组分含量之和高、发酵单位高，在此基础上进行提取纯化的难度小、收率更高，为清洁生产提供数据支持。
目前我国多粘菌素B发酵水平较低，行业发酵单位约2g/L左右，而国外2007年发酵单位即可达到2.8g/L，有较大的差距。另外，多粘菌素B在提高有效组分含量、降低杂质含量的研究相对较少，影响有效组分总含量的因素不明确，发酵液中的含量偏低。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，以提高发酵液中的多粘菌素B发酵单位和有效组分含量。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，包括以下步骤：
S1、将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液按照发酵罐接后体积10％的量接种到发酵培养基中，接种前通气为0.6vvm，罐压为0.04MPa-0.06MPa，转速为200-500rpm，30≤溶氧≤40％；
S2、发酵0h-12h期间，控制发酵罐内温度为30-32℃，通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.5-6.7；发酵13h-60h期间，控制发酵罐内温度为27-29℃，每小时补入0.0001-0.0003倍的发酵液体积的补料二，同时通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.1-6.3。
进一步地，还包括：
S3、发酵30h后每小时恒速补入0.002-0.004倍的发酵体积的补料三，培养至60h。
进一步地，所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉6.0g-8.0g，α淀粉酶0.01g-0.02g，葡萄糖0.3g-0.5g，低温豆粉1.5g-2.5g，玉米浆0.4g-0.6g，硫酸铵0.6g-0.8g，磷酸二氢钾0.025g-0.035g，大豆卵磷脂0.05g-0.15g，碳酸钙0.3g-0.5g，消泡剂0.1g-0.2g，其余为水。
进一步地，所述补料一是浓度为20％的氨水。
进一步地，所述补料二是灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液。
进一步地，所述补料三为灭菌后浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液。
优选地，所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水。
优选地，所述发酵0h-12h期间，控制发酵罐内温度为31℃；发酵13h-60h期间，控制发酵罐内温度为28℃。
优选地，发酵0h-12h期间，控制发酵罐内pH为6.6；发酵13h-60h期间，控制发酵罐内pH为6.2。
与现有技术相比，本发明通过补加关键物质肌肽，补加葡萄糖、进行培养基配方设计、分阶段控制温度与pH的控制，对发酵工艺进行精确调控，有效提升了发酵单位、提升有效组分含量，从而提升了发酵液质量。与对照例相比，发酵单位与有效组分含量均有明显提升，发酵单位最高提高了29.42％，有效组分提高了12.32％。
附图说明
图1为对照例1发酵液高效液相色谱图；
图2为实施例4发酵液高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
步骤(1)
配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水；
步骤(2)
将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到上述发酵培养基中，接种前控制发酵罐内：通气比为0.6vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-500rpm，通过调整转速控制溶氧30％-40％；
步骤(3)
发酵周期在0h-12h：控制温度30℃，通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.7。发酵周期13h-60h控制温度29℃，补加灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液(每小时补入0.0001倍的发酵体积)、同时通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.3；培养至60h，即得到最终发酵液，最终发酵液经高效液相色谱检测，结果如下表所示：
Figure BDA0003782067660000041
实施例2
步骤(1)
配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水；
步骤(2)
将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到上述发酵培养基中，接种前控制发酵罐内：通气比为0.6vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-500rpm，通过调整转速控制溶氧30％-40％；
步骤(3)
发酵周期在0h-12h：控制温度31℃，通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.6。发酵周期13h-60h控制温度28℃，补加灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液(每小时补入0.0002倍的发酵体积)、同时通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.2；培养至60h，即得到最终发酵液，最终发酵液经高效液相色谱检测，结果如下表所示：
Figure BDA0003782067660000051
实施例3
步骤(1)
配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水；
步骤(2)
将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到上述发酵培养基中，接种前控制发酵罐内：通气比为0.6vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-500rpm，通过调整转速控制溶氧30％-40％；
步骤(3)
发酵周期在0h-12h：控制温度31℃，通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.6。发酵周期13h-60h控制温度28℃，补加灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液(每小时补入0.0002倍的发酵体积)、同时通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.2；
步骤(4)
发酵周期30h后，恒速补入灭菌后浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液(每小时补入0.002倍的发酵体积)，培养至60h，即得到最终发酵液，最终发酵液经高效液相色谱检测，结果如下表所示：
Figure BDA0003782067660000061
实施例4
步骤(1)
配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水；
步骤(2)
将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到上述发酵培养基中，接种前控制发酵罐内：通气比为0.6vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-500rpm，通过调整转速控制溶氧30％-40％；
步骤(3)
发酵周期在0h-12h：控制温度31℃，通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.6。发酵周期13h-60h控制温度28℃，补加灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液(每小时补入0.0002倍的发酵体积)、同时通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.2；
步骤(4)
发酵周期30h后，恒速补入灭菌后浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液(每小时补入0.003倍的发酵体积)，培养至60h，即得到最终发酵液，最终发酵液经高效液相色谱检测，多粘菌素B出峰及产量如图1和表1所示：
表1
Figure BDA0003782067660000071
本发明的原理：是在发酵培养前期0-12h控制较高的温度30-32℃，有利于前菌量快速增长，快速生长过程pH逐渐下降，补加氨水控制pH在6.5-6.7，适合菌量快速增长；13h-60h通过流加补料二、pH自控补加补料一，控制pH到6.1-6.3，适合合成多粘菌素B，有效提升有效组分B1和B2含量，并将温度下调到27-29℃，能够降低菌体的代谢速度，减少营养物质的过度消耗；使菌体在较合适合成多粘菌素B的pH和温度，可明显提高多粘菌素B单位；在发酵周期30h后发酵单位增长速率开始下降，恒速补入葡萄糖，补充和适量的碳源，能够有效延长高单位发酵周期，最终放罐单位、有效组分含量明显提高。
进一步，为了验证本发明通过pH、温度以及补料的控制对发酵液质量的影响，设置以下对照例。
对照例1
步骤(1)
配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水；
步骤(2)
将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到上述发酵培养基中，接种前控制发酵罐内：通气比为0.6vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-500rpm，通过调整转速控制溶氧30％-40％；
步骤(3)
全程控制温度30℃，pH自然(发酵罐培养基接种后，在上述条件下培养，不干预pH变化)，培养至60h，得到多粘菌素B发酵液；最终发酵液经高效液相色谱检测，多粘菌素B出峰及产量如图2和表2所示：
表2
Figure BDA0003782067660000081
由表1、表2、图1和图2可知：实施例4与对照例进行对比，经过配方补料调整、分阶段控制温度和pH，补加补料，对发酵过程进行精准调控，发酵单位由对照例2.057g/L，提高到2.662g/L，提高了29.42％。其中补加补料二，明显提高了有效组分B1含量，有效组分含量得到明显提升至75.28％，与对照例相比，最终发酵液有效物质含量提高了12.32％，最终发酵液质量得到明显的提升。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液按照发酵罐接后体积10％的量接种到发酵培养基中，接种前通气为0.6vvm，罐压为0.04MPa-0.06MPa，转速为200-500rpm，30≤溶氧≤40％；
S2、发酵0h-12h期间，控制发酵罐内温度为30-32℃，通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.5-6.7；发酵13h-60h期间，控制发酵罐内温度为27-29℃，每小时补入0.0001-0.0003倍的发酵液体积的补料二，同时通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.1-6.3。
2.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于，还包括：
S3、发酵30h后每小时恒速补入0.002-0.004倍的发酵体积的补料三，培养至60h。
3.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于，所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉6.0g-8.0g，α淀粉酶0.01g-0.02g，葡萄糖0.3g-0.5g，低温豆粉1.5g-2.5g，玉米浆0.4g-0.6g，硫酸铵0.6g-0.8g，磷酸二氢钾0.025g-0.035g，大豆卵磷脂0.05g-0.15g，碳酸钙0.3g-0.5g，消泡剂0.1g-0.2g，其余为水。
4.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于：所述补料一是浓度为20％的氨水。
5.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于：所述补料二是灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液。
6.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于：所述补料三为灭菌后浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液。
7.根据权利要求3所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水。
8.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于：所述发酵0h-12h期间，控制发酵罐内温度为31℃；发酵13h-60h期间，控制发酵罐内温度为28℃。
9.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于：发酵0h-12h期间，控制发酵罐内pH为6.6；发酵13h-60h期间，控制发酵罐内pH为6.2。
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