CN110184318B - 一种发酵生产卡那霉素的培养基及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵生产卡那霉素的培养基及其培养方法；本发明确定了卡那霉素链霉菌发酵生产卡那霉素的种子培养基、发酵培养基营养物质最佳配比；本发明通过在基础料中添加多种氨基酸的玉米浆以及有机氮源，有利于提高增强菌体代谢，提高发酵起步效价，发酵过程中调节氨水流加速率控制无机氮水平，同时补加有机氮源高温豆粉，解除了氮源阻遏，同时增强菌丝发酵后期产素能力，能够提高卡那霉素发酵单位，降低发酵成本，有利于卡那霉素的工业化生产。

Description

一种发酵生产卡那霉素的培养基及其培养方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种发酵生产卡那霉素的发酵培养基及其培养方法。
背景技术
卡那霉素是1957年从卡那霉素链霉菌(S.kanamyceticus)的代谢产物中分离出的一种氨基糖苷类抗生素。卡那霉素含有3个组分：A、B、C，其中A组分为主组分。卡那霉素对大多数革兰阴性杆菌如大肠杆菌、变形杆菌属、产气杆菌、肺炎克雷白菌、黏质沙雷菌等具有较强抗菌活性，对金黄色葡萄菌和结核杆菌也较敏感。卡那霉素主要与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制蛋白质合成，从而起到杀菌的作用。
卡那霉素的生产方法主要为微生物发酵法，长期以来，国内普遍采用不补料、不控pH的分批发酵工艺，基础料中加入高浓度的碳源、氮源，通过每天补水的方式维持菌浓，造成发酵液流变特性差，传氧和传质效果差，中后期氮源的分解和菌体衰亡较早，不利于菌体代谢和卡那霉素合成，发酵效价长期处于8000U/mL的水平。
近年来国内在提高卡那霉素效价的研究上开展了大量工作：
中国专利CN106498010A(申请号201610929968.1)公开了一种发酵生产卡那霉素的方法，在传统工艺的基础上进行优化，发酵30h后补加一定量玉米蛋白粉，120h发酵结束时效价达到12600U/mL。
方声等通过连续补料发酵工艺，144h发酵结束时效价达到13745U/mL。
发明内容
本发明的目的是提供了一种发酵生产卡那霉素的发酵培养基及其培养方法。
第一方面，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种发酵生产卡那霉素的发酵培养基，其组成的各组分的质量百分含量为：
淀粉3-5％，高温豆粉2-4％，玉米浆0.3-0.6％，硫酸铵0.3-0.5％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.1-0.3％，七水硫酸锌0.005-0.015％，七水硫酸亚铁0.004-0.008％，淀粉酶0.1-0.2％，液体消泡剂0.02-0.04％，豆油0.3-0.5％，余量水，pH6.8-7.2。
优选的，所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮60-80mg/100mL，总糖4.0-7.0g/100mL，pH6.5-7.0。
第二方面，本发明还涉及上述发酵培养基的发酵生产卡那霉素的培养方法，包括如下步骤：
步骤1，种子培养：将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.1-0.2％的接种量接种于种子培养基中进行培养，当菌浓达到20％以上，pH值降至6.5以下，培养时间42-48h时移种；
步骤2，发酵培养：将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液。
优选的，所述种子培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉2-4％，高温豆粉1.5-3％，玉米浆0.4-0.8％，硫酸铵0.2-0.4％，碳酸钙0.1-0.3％，氯化钠0.15-0.25％，液体消泡剂0.01-0.03％，豆油0.2-0.4％，余量水，pH自然。
优选的，所述种子培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮80-120mg/100mL，总糖3.0-5.0g/100mL，pH6.5-7.0。
优选的，所述培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液质量要求为：菌浓30-40％，镜检无杂菌。
优选的，所述种子培养条件为：罐压0.04±0.05Mp，培养温度27±1℃，通气比0.8-1.0vvm，溶氧控制在30-50％。
优选的，所述发酵培养条件为：罐压0.04±0.005Mp，培养温度27±1℃，通气比0.7-0.9vvm，溶氧的范围为25％-35％，全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平，无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水，同时温度降至26±1℃培养，调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL，全程pH值的变化范围为6.7-6.8，pH超过6.8补加硫铵。
优选的，所述发酵过程中采用流加法进行补料，其中：总糖降至3.0-3.5g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.2-0.3％。
优选的，所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料培养基组成为：淀粉30-50％，高温豆粉2.0-4.0％。
本发明主要针对现有技术的不足，提供一种发酵生产硫肽类抗生素那西肽的培养方法，旨在提供一个合适的发酵代谢环境。
针对现有技术，在本发明的方法有以下优点：
(1)本发明通过在基础料中添加多种氨基酸的玉米浆以及有机氮源，有利于提高增强菌体代谢，提高发酵起步效价；
(2)本发明在发酵过程中调节氨水流加速率控制无机氮水平，同时补加有机氮源高温豆粉，解除了氮源阻遏；
(3)本发明的技术方案在解除了氮源阻遏问题的同时，还增强菌丝发酵后期产素能力；
(4)本发明的技术方案能够提高卡那霉素发酵单位，降低发酵成本，有利于卡那霉素的工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
种子培养：培养基体积20L。
种子培养基：淀粉2％，高温豆粉1.5％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.1％，氯化钠0.15％，液体消泡剂0.01％，豆油0.2％，余量水，pH自然；
按比例配制种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量：氨基氮84mg/100mL，总糖3.1g/100mL，pH6.55。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.8vvm，溶氧控制在30-50％。当菌浓达到21.2％，pH值降至6.47时移种，培养时间46h。
发酵培养：培养基体积60L。
淀粉3％，高温豆粉2％，玉米浆0.3％，硫酸铵0.3％，碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，七水硫酸锌0.005％，七水硫酸亚铁0.004％，淀粉酶0.1％，液体消泡剂0.02％，豆油0.3％，余量水，pH6.8。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮63mg/100mL，总糖4.4g/100mL，pH6.82。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.7vvm，溶氧的范围为25％-35％，全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平，无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水，同时温度降至26℃培养，调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL，全程pH值的变化范围为6.7-6.8，pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制：
总糖降至3.3g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.2％。其中补料培养基组成为：淀粉30％，高温豆粉2.0％。
发酵培养结束，菌浓41.4％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为14388U/mL。
实施例2
种子培养：培养基体积20L
种子培养基：淀粉3％，高温豆粉2％，玉米浆0.6％，硫酸铵0.3％，碳酸钙0.2％，氯化钠0.2％，液体消泡剂0.02％，豆油0.3％，余量水，pH自然；
按比例配制种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量：氨基氮90mg/100mL，总糖3.55g/100mL，pH6.5。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.15％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.9vvm，溶氧控制在30-50％。当菌浓达到22.3％，pH值降至6.42时移种，培养时间45h。
发酵培养：培养基体积60L
淀粉4％，高温豆粉3％，玉米浆0.45％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.2％，七水硫酸锌0.01％，七水硫酸亚铁0.006％，淀粉酶0.15％，液体消泡剂0.03％，豆油0.4％，余量水，pH6.72。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮72mg/100mL，总糖5.5g/100mL，pH6.71。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为25％-35％，全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平，无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水，同时温度降至26℃培养，调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL，全程pH值的变化范围为6.7-6.8，pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制：
总糖降至3.4g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.25％。其中补料培养基组成为：淀粉35％，高温豆粉3.0％。
发酵培养结束，菌浓42.8％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为14932U/mL。
实施例3
种子培养：培养基体积20L
种子培养基：淀粉4％，高温豆粉3％，玉米浆0.8％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.03％，豆油0.4％，余量水，pH自然；
按比例配制种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量：氨基氮96mg/100mL，总糖4.3g/100mL，pH6.52。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％。当菌浓达到24％，pH值降至6.34时移种，培养时间44h。
发酵培养：培养基体积60L
淀粉5％，高温豆粉4％，玉米浆0.6％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，七水硫酸锌0.015％，七水硫酸亚铁0.008％，淀粉酶0.2％，液体消泡剂0.04％，豆油0.5％，余量水，pH6.53。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮79mg/100mL，总糖6.3g/100mL，pH6.56。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.9vvm，溶氧的范围为25％-35％，全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平，无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水，同时温度降至26℃培养，调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL，全程pH值的变化范围为6.7-6.8，pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制：
总糖降至3.4g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.25％。其中补料培养基组成为：淀粉40％，高温豆粉4.0％。
发酵培养结束，菌浓44.7％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为15647U/mL。
由上述实施例1-3得出的数据可现实：
实施例1，发酵培养结束，菌浓41.4％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为14388U/mL。
实施例2，发酵培养结束，菌浓42.8％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为14932U/mL。
实施例3，发酵培养结束，菌浓44.7％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为15647U/mL。
由上述数据可见，本发明所述发酵生产卡那霉素的培养基和培养方法对卡那霉素效价(14000U/mL-16000U/mL)之间，其水平提高的程度，发明人进行了对比试验。
对比实施例1
种子培养：培养基体积20L
种子培养基：淀粉2％，高温豆粉1.5％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.1％，氯化钠0.15％，液体消泡剂0.01％，豆油0.2％，余量水，pH自然；
按比例配制种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量：氨基氮92mg/100mL，总糖4.0g/100mL，pH6.43。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％。当菌浓达到23％，pH值降至6.44时移种，培养时间44h。
发酵培养：培养基体积60L
淀粉3％，高温豆粉2％，硫酸铵0.3％，碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，七水硫酸锌0.005％，七水硫酸亚铁0.004％，淀粉酶0.1％，液体消泡剂0.02％，豆油0.3％，余量水，pH6.8。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮70mg/100mL，总糖6.1g/100mL，pH6.66。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.9vvm，溶氧的范围为25％-35％，pH自控补加氨水，pH自控6.8，pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制：
总糖降至3.5g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.25％。其中补料培养基组成为：淀粉40％。
发酵培养结束，菌浓41.7％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为10532U/mL。
对比实施例2
种子培养：培养基体积20L
种子培养基：淀粉4％，高温豆粉3％，玉米浆0.8％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.03％，豆油0.4％，余量水，pH自然；
按比例配制种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量：氨基氮96mg/100mL，总糖4.3g/100mL，pH6.52。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％。当菌浓达到24％，pH值降至6.34时移种，培养时间44h。
发酵培养：培养基体积60L
淀粉5％，高温豆粉4％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，七水硫酸锌0.015％，七水硫酸亚铁0.008％，淀粉酶0.2％，液体消泡剂0.04％，豆油0.5％，余量水，pH6.53。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮79mg/100mL，总糖6.3g/100mL，pH6.56。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.9vvm，溶氧的范围为25％-35％，pH自控补加氨水，pH自控6.8，pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制：
总糖降至3.4g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.25％。其中补料培养基组成为：淀粉40％，高温豆粉2.0％。
发酵培养结束，菌浓45.3％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为12346U/mL。
对比实施例3
种子培养：培养基体积20L
种子培养基：淀粉4％，高温豆粉3％，玉米浆0.8％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.03％，豆油0.4％，余量水，pH自然；
按比例配制种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量：氨基氮96mg/100mL，总糖4.3g/100mL，pH6.52。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％。当菌浓达到24％，pH值降至6.34时移种，培养时间44h。
发酵培养：培养基体积60L
淀粉5％，高温豆粉4％，玉米浆0.6％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，七水硫酸锌0.015％，七水硫酸亚铁0.008％，淀粉酶0.2％，液体消泡剂0.04％，豆油0.5％，余量水，pH6.53。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮79mg/100mL，总糖6.3g/100mL，pH6.56。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度27℃，通气比0.9vvm，溶氧的范围为25％-35％，全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平，无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水，同时温度降至26℃培养，调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL，全程pH值的变化范围为6.7-6.8，pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制：
总糖降至3.3g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.25％。其中补料培养基组成为：淀粉40％，高温豆粉1.0％。
发酵培养结束，菌浓43.9％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为11938U/mL。
由上述对比对比例1-3得出的数据可现实：
对比例1，发酵培养结束，菌浓41.7％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为10532U/mL。。
对比例2，发酵培养结束，菌浓45.3％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为12346U/mL。
对比例3，发酵培养结束，菌浓43.9％，发酵周期为132h，检测卡那霉素效价为11938U/mL。
由上述数据可见，对比例1-3所述发酵生产卡那霉素的培养基和培养方法对卡那霉素效价(10000U/mL-13000U/mL)之间，其水平提高的程度远远低于本发明实施例1-3的数据(14000U/mL-16000U/mL)，发明人进行了对比试验。
综上所述：针对现有技术，在本发明的方法有以下优点：本发明通过在基础料中添加多种氨基酸的玉米浆以及有机氮源，有利于提高增强菌体代谢，提高发酵起步效价；本发明在发酵过程中调节氨水流加速率控制无机氮水平，同时补加有机氮源高温豆粉，解除了氮源阻遏；本发明的技术方案在解除了氮源阻遏问题的同时，还增强菌丝发酵后期产素能力；本发明的技术方案能够提高卡那霉素发酵单位，降低发酵成本，有利于卡那霉素的工业化生产。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (10)

1.一种发酵生产卡那霉素的发酵培养基，其组成的各组分的质量百分含量为：
淀粉3-5％，高温豆粉2-4％，玉米浆0.3-0.6％，硫酸铵0.3-0.5％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.1-0.3％，七水硫酸锌0.005-0.015％，七水硫酸亚铁0.004-0.008％，淀粉酶0.1-0.2％，液体消泡剂0.02-0.04％，豆油0.3-0.5％，余量水，pH 6.8-7.2。
2.如权利要求1所述的发酵生产卡那霉素的发酵 培养基，其特征在于，所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮60-80mg/100mL，总糖4.0-7.0g/100mL，pH 6.5-7.0。
3.利用权利要求1所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，种子培养：将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.1-0.2％的接种量接种于种子培养基中进行培养，当菌浓达到20％以上，pH值降至6.5以下，培养时间42-48h时移种；
步骤2，发酵培养：将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量10％，发酵过程中菌浓维持在38-45％，培养周期为132h，发酵结束，即得到卡那霉素发酵液。
4.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述种子培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉2-4％，高温豆粉1.5-3％，玉米浆0.4-0.8％，硫酸铵0.2-0.4％，碳酸钙0.1-0.3％，氯化钠0.15-0.25％，液体消泡剂0.01-0.03％，豆油0.2-0.4％，余量水，pH自然。
5.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述种子培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮80-120mg/100mL，总糖3.0-5.0g/100mL，pH6.5-7.0。
6.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液质量要求为：菌浓30-40％，镜检无杂菌。
7.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述种子培养条件为：罐压0.04±0.05Mp，培养温度27±1℃，通气比0.8-1.0vvm，溶氧控制在30-50％。
8.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：罐压0.04±0.005Mp，培养温度27±1℃，通气比0.7-0.9vvm，溶氧的范围为25％-35％，全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平，无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水，同时温度降至26±1℃培养，调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL，全程pH值的变化范围为6.7-6.8，pH超过6.8补加硫铵。
9.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述发酵过程中采用流加法进行补料，其中：总糖降至3.0-3.5g/100mL开始补料，流加量为发酵液体积的0.2-0.3％。
10.如权利要求3所述的发酵培养基发酵生产卡那霉素的方法，其特征在于，所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料培养基组成为：淀粉30-50％，高温豆粉2.0-4.0％。
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