CN116254200A - 一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法。以卡那霉素链霉菌作为出发菌,通过在种子培养基和发酵培养基中加入生物氮素作为氮源,确定了种子培养基和发酵培养基中营养物质的成分及最佳配比,有利于提高发酵起步效价并促进卡那霉素的积累。本发明通过在发酵培养基基础料中添加磷酸氢二钾和甘氨酸,对于发酵过程中pH及渗透压有明显的调节作用,为菌体生长提供了适宜的条件,且甘氨酸加入能刺激菌丝体分泌次级代谢产物卡那霉素;通过在补料液中添加硝酸钠,补充氮源的同时作为生理碱性物质参与到pH的调节,有利于卡那霉素的发酵生产。本发明适用于大规模稳定、高效地生产卡那霉素。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,涉及一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法。
背景技术
卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素,含三个组分:卡那霉素A、B和C,其中卡那霉素A为主要组分,卡那霉素于1957年从卡那霉素链霉菌(S.kanamyceticus)的代谢产物中分离得到。卡那霉素的抑菌机理主要是与细菌核糖体30S亚单位结合,抑制细菌蛋白质合成,从而达到杀菌的作用。卡那霉素的衍生物丁胺卡那霉素,是青霉素过敏者最佳的替代药品;卡那霉素制作成的单硫酸卡那霉素用于动物的杀菌,其对多数肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属等均有良好抗菌作用;用于治疗血液和组织感染等炎症。
卡那霉素的主要生产方法是微生物发酵法。因其抗菌谱广、毒副作用小的特点,近年来在国内外引起多年的提高卡那霉素发酵效价的研究。但是现有技术中仍未有一种能够有效提高卡那霉素发酵效价的培养方法。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足,本发明为了解决上述现有技术中存在的问题,提供了一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法。
其主要技术方案为:一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)种子培养:将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵种子液按0.1-0.2%的接种量接种于种子培养基中进行培养,培养条件为:罐压0.04±0.05Mp,培养温度27±1℃,通气比0.8-1.0vvm,溶氧控制在30-50%。种子罐移种标准为:当菌浓达到20%以上,pH值降至6.5以下,培养时间42-48h时移种;
(2)发酵培养:将培养好的种子液按照10%的接种量接种于发酵培养基中培养,培养条件为:罐压0.04±0.005Mp,培养温度27±1℃,通气比0.7-0.9vvm,溶氧的范围为25%-35%;通过调节氨水补加速率控制无机氮水平在0.05-0.15mg/mL,并通过流加氨水和硫铵控制pH水平在6.7-6.8;发酵过程中流加补料使总糖控制在2.5-3.0%。发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h。
进一步的,所述的种子培养基的各组分的质量百分含量为:淀粉2.0-4.0%,高温豆粉1.0-3.0%,生物氮素0.5-1.0%,玉米浆0.3-0.7%,硫酸铵0.2-0.4%,碳酸钙0.15-0.35%,氯化钠0.1-0.3%,液体消泡剂0.01-0.03%,豆油0.2-0.4%,余量水,pH自然。
进一步的,所述的发酵培养基的各组分的质量百分含量为:淀粉3.0-5.0%,高温豆粉1.0-3.0%,生物氮素1.0-2.0%,玉米浆0.3-0.6%,硫酸铵0.2-0.4%,碳酸钙0.2-0.4%,氯化钠0.1-0.3%,磷酸氢二钾0.10-0.15%,七水硫酸锌0.005-0.015%,七水硫酸亚铁0.004-0.008%,淀粉酶0.1-0.2%,甘氨酸0.2-0.5%,液体消泡剂0.02-0.04%,豆油0.3-0.5%,余量水,pH 6.8-7.2。
进一步的,所述种子培养基的灭菌后质量要求为:氨基氮70-100mg/100mL,总糖3.0-5.0g/100mL,pH6.5-7.0。
进一步的,所述发酵培养基的灭菌后质量要求为氨基氮90-120mg/100mL,总糖3.0-7.0g/100mL,pH 6.5-7.0。
进一步的,所述发酵过程中采用流加法进行补料,补料培养基组成为:淀粉25-45%,高温豆粉2.0-4.0%,硝酸钠2.0-4.0%。总糖降至3.0-3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2-0.4%。
本发明的有益效果是为卡那霉素发酵生产提供了适宜的营养物质和代谢环境,针对现有技术,本发明的方法有以下优点:
1.本发明通过在种子培养基和发酵培养基中加入生物氮素作为氮源,确定了种子培养基和发酵培养基中营养物质的成分及最佳配比,有利于提高发酵起步效价并促进卡那霉素的积累。
2.本发明通过在发酵培养基基础料中添加磷酸氢二钾和甘氨酸,对于发酵过程中pH及渗透压有明显的调节作用,为菌体生长提供了适宜的条件,且甘氨酸加入能刺激菌丝体分泌次级代谢产物卡那霉素。
3.本发明通过在补料液中添加硝酸钠,补充氮源的同时作为生理碱性物质参与到pH的调节,有利于卡那霉素的发酵生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是,以下的实施实例只是对本发明的进一步说明,但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
种子培养:培养基体积20L。
种子培养基:淀粉2.0%,高温豆粉2.0%,生物氮素0.5%,玉米浆0.4%,硫酸铵0.3%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,液体消泡剂0.02%,豆油0.2%,余量水,pH自然。
按比例配制种子培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,种子培养基灭菌后的质量:氨基氮79mg/100mL,总糖3.3g/100mL,pH6.61。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2%接种量接种于种子培养基中进行培养,种子培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧控制在30-50%。当菌浓达到22.3%,pH值降至6.43时移种,培养时间45h。
发酵培养:培养基体积60L。
发酵培养基:淀粉3.0%,高温豆粉2.0%,生物氮素1.5%,玉米浆0.3%,硫酸铵0.2%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,磷酸氢二钾0.10%,七水硫酸锌0.008%,七水硫酸亚铁0.005%,淀粉酶0.1%,甘氨酸0.2%,液体消泡剂0.03%,豆油0.3%,余量水,pH 6.87。
按比例配制发酵培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,发酵培养基灭菌后的质量:氨基氮103mg/100mL,总糖4.6g/100mL,pH6.82。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养,接种量10%,发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h,发酵结束,即得到卡那霉素发酵液;
发酵培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧的范围为25%-35%,全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平,无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水,同时温度降至26℃培养,调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL,全程pH值的变化范围为6.7-6.8,pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制:
总糖降至3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2%。其中补料培养基组成为:淀粉25%,高温豆粉2.0%,硝酸钠2.0%。
发酵培养结束,菌浓40.3%,发酵周期为132h,检测卡那霉素效价为15397U/mL。
实施例2
种子培养:培养基体积20L。
种子培养基:淀粉3.0%,高温豆粉2.0%,生物氮素1.0%,玉米浆0.4%,硫酸铵0.3%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,液体消泡剂0.03%,豆油0.2%,余量水,pH自然。
按比例配制种子培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,种子培养基灭菌后的质量:氨基氮87mg/100mL,总糖3.8g/100mL,pH6.73。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2%接种量接种于种子培养基中进行培养,种子培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧控制在30-50%。当菌浓达到23.8%,pH值降至6.83时移种,培养时间44h。
发酵培养:培养基体积60L。
发酵培养基:淀粉4.0%,高温豆粉2.0%,生物氮素2.0%,玉米浆0.3%,硫酸铵0.2%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,磷酸氢二钾0.15%,七水硫酸锌0.005%,七水硫酸亚铁0.005%,淀粉酶0.1%,甘氨酸0.3%,液体消泡剂0.03%,豆油0.3%,余量水,pH6.91。
按比例配制发酵培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,发酵培养基灭菌后的质量:氨基氮108mg/100mL,总糖4.3g/100mL,pH6.57。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养,接种量10%,发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h,发酵结束,即得到卡那霉素发酵液;
发酵培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧的范围为25%-35%,全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平,无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水,同时温度降至26℃培养,调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL,全程pH值的变化范围为6.7-6.8,pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制:
总糖降至3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2%。其中补料培养基组成为:淀粉30%,高温豆粉3.0%,硝酸钠2.0%。
发酵培养结束,菌浓42.7%,发酵周期为132h,检测卡那霉素效价为15788U/mL。
实施例3
种子培养:培养基体积20L。
种子培养基:淀粉3.0%,高温豆粉3.0%,生物氮素1.0%,玉米浆0.4%,硫酸铵0.4%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,液体消泡剂0.02%,豆油0.3%,余量水,pH自然。
按比例配制种子培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,种子培养基灭菌后的质量:氨基氮91mg/100mL,总糖3.6g/100mL,pH6.68。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2%接种量接种于种子培养基中进行培养,种子培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧控制在30-50%。当菌浓达到23.3%,pH值降至6.78时移种,培养时间45h。
发酵培养:培养基体积60L。
发酵培养基:淀粉4.0%,高温豆粉3.0%,生物氮素2.0%,玉米浆0.3%,硫酸铵0.3%,碳酸钙0.3%,氯化钠0.2%,磷酸氢二钾0.1%,七水硫酸锌0.005%,七水硫酸亚铁0.005%,淀粉酶0.1%,甘氨酸0.4%,液体消泡剂0.03%,豆油0.3%,余量水,pH6.81。
按比例配制发酵培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,发酵培养基灭菌后的质量:氨基氮113mg/100mL,总糖4.1g/100mL,pH6.67。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养,接种量10%,发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h,发酵结束,即得到卡那霉素发酵液;
发酵培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧的范围为25%-35%,全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平,无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水,同时温度降至26℃培养,调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL,全程pH值的变化范围为6.7-6.8,pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制:
总糖降至3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2%。其中补料培养基组成为:淀粉30%,高温豆粉3.0%,硝酸钠2.0%。
发酵培养结束,菌浓43.2%,发酵周期为132h,检测卡那霉素效价为15469U/mL。
由实施例可见,本发明所述的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其卡那霉素发酵产量较高,其水平提高的程度,发明人进行了对比试验。
对比例1
种子培养:培养基体积20L。
种子培养基:淀粉3.0%,高温豆粉3.0%,玉米浆0.4%,硫酸铵0.7%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,液体消泡剂0.02%,豆油0.3%,余量水,pH自然。
按比例配制种子培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,种子培养基灭菌后的质量:氨基氮80mg/100mL,总糖3.6g/100mL,pH6.53。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2%接种量接种于种子培养基中进行培养,种子培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧控制在30-50%。当菌浓达到22.5%,pH值降至6.73时移种,培养时间46h。
发酵培养:培养基体积60L。
发酵培养基:淀粉4.0%,高温豆粉3.0%,玉米浆0.6%,硫酸铵0.4%,碳酸钙0.3%,氯化钠0.2%,磷酸氢二钾0.1%,七水硫酸锌0.005%,七水硫酸亚铁0.005%,淀粉酶0.1%,甘氨酸0.4%,液体消泡剂0.03%,豆油0.3%,余量水,pH6.81。
按比例配制发酵培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,发酵培养基灭菌后的质量:氨基氮88mg/100mL,总糖4.0g/100mL,pH6.64。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养,接种量10%,发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h,发酵结束,即得到卡那霉素发酵液;
发酵培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧的范围为25%-35%,全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平,无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水,同时温度降至26℃培养,调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL,全程pH值的变化范围为6.7-6.8,pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制:
总糖降至3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2%。其中补料培养基组成为:淀粉30%,高温豆粉3.0%,硝酸钠2.0%。
发酵培养结束,菌浓43.0%,发酵周期为132h,检测卡那霉素效价为13569U/mL。
对比例2
种子培养:培养基体积20L。
种子培养基:淀粉3.0%,高温豆粉3.0%,生物氮素1.0%,玉米浆0.4%,硫酸铵0.4%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,液体消泡剂0.02%,豆油0.3%,余量水,pH自然。
按比例配制种子培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,种子培养基灭菌后的质量:氨基氮87mg/100mL,总糖3.5g/100mL,pH6.68。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2%接种量接种于种子培养基中进行培养,种子培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧控制在30-50%。当菌浓达到23.7%,pH值降至6.74时移种,培养时间44h。
发酵培养:培养基体积60L。
发酵培养基:淀粉4.0%,高温豆粉3.0%,生物氮素2.0%,玉米浆0.3%,硫酸铵0.3%,碳酸钙0.3%,氯化钠0.2%,七水硫酸锌0.005%,七水硫酸亚铁0.005%,淀粉酶0.1%,液体消泡剂0.03%,豆油0.3%,余量水,pH6.78。
按比例配制发酵培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,发酵培养基灭菌后的质量:氨基氮91mg/100mL,总糖3.9g/100mL,pH6.57。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养,接种量10%,发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h,发酵结束,即得到卡那霉素发酵液;
发酵培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧的范围为25%-35%,全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平,无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水,同时温度降至26℃培养,调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL,全程pH值的变化范围为6.7-6.8,pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制:
总糖降至3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2%。其中补料培养基组成为:淀粉30%,高温豆粉3.0%,硝酸钠2.0%。
发酵培养结束,菌浓43.0%,发酵周期为132h,检测卡那霉素效价为13861U/mL。
对比例3
种子培养:培养基体积20L。
种子培养基:淀粉3.0%,高温豆粉3.0%,生物氮素1.0%,玉米浆0.4%,硫酸铵0.4%,碳酸钙0.2%,氯化钠0.1%,液体消泡剂0.02%,豆油0.3%,余量水,pH自然。
按比例配制种子培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,种子培养基灭菌后的质量:氨基氮110mg/100mL,总糖4.0g/100mL,pH6.64。将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵液按0.2%接种量接种于种子培养基中进行培养,种子培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧控制在30-50%。当菌浓达到24.0%,pH值降至6.74时移种,培养时间45h。
发酵培养:培养基体积60L。
发酵培养基:淀粉4.0%,高温豆粉3.0%,生物氮素2.0%,玉米浆0.3%,硫酸铵0.3%,碳酸钙0.3%,氯化钠0.2%,磷酸氢二钾0.1%,七水硫酸锌0.005%,七水硫酸亚铁0.005%,淀粉酶0.1%,甘氨酸0.4%,液体消泡剂0.03%,豆油0.3%,余量水,pH6.81。
按比例配制发酵培养基,121-125℃灭菌30min后冷却至室温,并用无菌空气保压,发酵培养基灭菌后的质量:氨基氮110mg/100mL,总糖3.8g/100mL,pH6.72。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养,接种量10%,发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h,发酵结束,即得到卡那霉素发酵液;
发酵培养条件为:罐压0.04Mp,培养温度27℃,通气比0.8vvm,溶氧的范围为25%-35%,全程通过调节氨水流加速率控制无机氮水平,无机氮降至0.2mg/mL后补加氨水,同时温度降至26℃培养,调节氨水补加速率控制无机氮在0.05-0.15mg/mL,全程pH值的变化范围为6.7-6.8,pH超过6.8补加硫铵。
补料工艺控制:
总糖降至3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2%。其中补料培养基组成为:淀粉30%,高温豆粉4.0%。
发酵培养结束,菌浓43.5%,发酵周期为132h,检测卡那霉素效价为14530U/mL。
实施例中公开的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法较对比例,其卡那霉素发酵效价显著提升,达15500U/mL左右。
综上所述:本发明公开的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法。通过在种子培养基和发酵培养基中加入生物氮素作为氮源,确定了种子培养基和发酵培养基中营养物质的成分及最佳配比,有利于提高发酵起步效价并促进卡那霉素的积累;通过在发酵培养基基础料中添加磷酸氢二钾和甘氨酸,对于发酵过程中pH及渗透压有明显的调节作用,为菌体生长提供了适宜的条件,且甘氨酸加入能刺激菌丝体分泌次级代谢产物卡那霉素;通过在补料液中添加硝酸钠,补充氮源的同时作为生理碱性物质参与到pH的调节,有利于卡那霉素的发酵生产。本发明适用于大规模稳定、高效地生产卡那霉素。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解,本申请中所涉及的发明范围,并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案,同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下,由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (6)
1.一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)种子培养:将培养好的卡那霉素链霉菌种瓶发酵种子液按0.1-0.2%的接种量接种于种子培养基中进行培养,培养条件为:罐压0.04±0.05Mp,培养温度27±1℃,通气比0.8-1.0vvm,溶氧控制在30-50%。种子罐移种标准为:当菌浓达到20%以上,pH值降至6.5以下,培养时间42-48h时移种;
(2)发酵培养:将培养好的种子液按照10%的接种量接种于发酵培养基中培养,培养条件为:罐压0.04±0.005Mp,培养温度27±1℃,通气比0.7-0.9vvm,溶氧的范围为25%-35%;通过调节氨水补加速率控制无机氮水平在0.05-0.15mg/mL,并通过流加氨水和硫铵控制pH水平在6.7-6.8;发酵过程中流加补料使总糖控制在2.5-3.0%。发酵过程中菌浓维持在38-45%,培养周期为132h。
2.根据权利要求1所述的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:所述的种子培养基的各组分的质量百分含量为:淀粉2.0-4.0%,高温豆粉1.0-3.0%,生物氮素0.5-1.0%,玉米浆0.3-0.7%,硫酸铵0.2-0.4%,碳酸钙0.15-0.35%,氯化钠0.1-0.3%,液体消泡剂0.01-0.03%,豆油0.2-0.4%,余量水,pH自然。
3.根据权利要求1所述的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:所述的发酵培养基的各组分的质量百分含量为:淀粉3.0-5.0%,高温豆粉1.0-3.0%,生物氮素1.0-2.0%,玉米浆0.3-0.6%,硫酸铵0.2-0.4%,碳酸钙0.2-0.4%,氯化钠0.1-0.3%,磷酸氢二钾0.10-0.15%,七水硫酸锌0.005-0.015%,七水硫酸亚铁0.004-0.008%,淀粉酶0.1-0.2%,甘氨酸0.2-0.5%,液体消泡剂0.02-0.04%,豆油0.3-0.5%,余量水,pH 6.8-7.2。
4.根据权利要求1所述的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:所述种子培养基的灭菌后质量要求为:氨基氮70-100mg/100mL,总糖3.0-5.0g/100mL,pH6.5-7.0。
5.根据权利要求1所述的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:所述发酵培养基的灭菌后质量要求为氨基氮90-120mg/100mL,总糖3.0-7.0g/100mL,pH6.5-7.0。
6.根据权利要求1所述的一种提高卡那霉素发酵效价的培养基及培养方法,其特征在于:所述发酵过程中采用流加法进行补料,补料培养基组成为:淀粉25-45%,高温豆粉2.0-4.0%,硝酸钠2.0-4.0%。总糖降至3.0-3.5g/100mL开始补料,流加量为发酵液体积的0.2-0.4%。
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