CN116536384A - 一种提高卡那霉素发酵水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物发酵技术领域,特别涉及一种提高卡那霉素发酵水平的方法。所述方法包括采用玉米蛋白粉作为发酵有机氮源,在补料分批发酵的发酵方式下,在发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸以连续补料的方式补加到发酵液中。本发明所提供的方法可有效降低发酵产物卡那霉素中卡那霉素B的含量,可提高卡那霉素发酵水平及其发酵产物的质量。

Description

一种提高卡那霉素发酵水平的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,特别涉及一种提高卡那霉素发酵水平的方法。
背景技术
卡那霉素(Kanamycin)是一种氨基糖苷类抗生素,于1957年从卡那链霉菌(S.Kanamyceticus)培养液中分离得到。卡那霉素被应用于治疗大肠杆菌、变形杆菌属(吲哚阳性与吲哚阴性)、产气杆菌、肺炎杆菌、粘质沙雷菌、不动杆菌属和葡萄球菌属等所致的严重感染。卡那霉素的化学结构如下通式(1)和表1所示:
表1
R R’
卡那霉素A OH NH2
卡那霉素B NH2 NH2
卡那霉素C NH2 OH
如表1所示,根据分子结构中R和R’基团的不同,卡那霉素分为卡那霉素A、B、C三个组分。其中卡那霉素A为主要组分,由于卡那霉素B毒性较高,其成分被严格控制在5%以下,卡那霉素C含量极微。中国药典规定卡那霉素A产品中卡那霉素B的含量应小于1.5%,但现有的发酵方法往往不能有效控制发酵组分,卡那霉素B的含量偏高(大于2.5%)。
目前工业上生产卡那霉素的主要方法为微生物发酵法,提高卡那霉素发酵水平的研究主要针对菌种选育和发酵工艺控制。但仍然存在卡那霉素发酵效价低、卡那霉素B含量过高以及产量低的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷,本发明所要解决的技术问题是:提供一种可有效控制卡那霉素B含量,以及提高卡那霉素发酵水平的方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种提高卡那霉素发酵水平的方法,采用玉米蛋白粉作为发酵有机氮源,在补料分批发酵的发酵方式下,在发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸以连续补料的方式补加到发酵液中。
本发明的有益效果在于:本发明所提供的一种提高卡那霉素发酵水平的方法,采用玉米蛋白粉作为发酵有机氮源,在补料分批发酵的发酵方式下,在发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸溶液以连续补料的方式补加到发酵液中,卡那霉素发酵水平大幅提高。所得发酵液的卡那霉素效价在10500~11500U/mL之间,卡那霉素B含量控制在1.3%以下,产量最高可达498.8225g。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式予以说明。
一种提高卡那霉素发酵水平的方法,采用玉米蛋白粉作为发酵有机氮源,在补料分批发酵的发酵方式下,在发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸以连续补料的方式补加到发酵液中。
其中,所述玉米蛋白粉作为发酵底料添加到发酵培养基中,降低在发酵过程中卡那霉素B的生成。
所述补料甲硫氨酸在培养至少20h后以连续补料的方式被加入到发酵液中,优选在培养20~89h时以流加的方式补加入发酵液中,以通过补料甲硫氨酸的补加提高卡那霉素发酵的水平。所述补料甲硫氨酸可以以任意形式补加入发酵液中,优选以溶液形式补加入发酵液中。
在一种实施方式中,所述补料甲硫氨酸的添加量为0.05~0.1(m/v)%(以发酵液体积计)。
在一种实施方式中,所述补料分批发酵的发酵菌种为卡那链霉菌。
在一种实施方式中,所述提高卡那霉素发酵水平的方法包括如下步骤:
S1、将发酵菌种接种在一级种子培养基中培养至种子成熟,获得成熟的一级种子液;
S2、将所述成熟的一级种子液移种在二级种子培养基中培养至种子成熟,获得成熟的二级种子液;
S3、将所述成熟的二级种子液进行发酵培养,发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸加入发酵液,继续发酵112~137h后结束发酵。
在一种实施方式中,S1为:配制一级种子培养基,以接种量为0.06%接种所述发酵菌种,以培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min培养27h至菌丝舒展,培养基pH为7.2~7.3,发酵菌浓度为10~14%,获得成熟的一级种子液。优选地,所述一级种子培养基以120℃~122℃灭菌30min。
在一种实施方式中,所述一级种子培养基包括如下质量百分比的组分:黄豆饼粉1.5~2.5%、葡萄糖0.2~0.3%、玉米淀粉1.3~1.8%、玉米粉0.6~0.9%、酵母粉0.05~0.1%、氯化钠0.25~0.4%、碳酸钙0.05~0.2%、硝酸钠0.07~0.09%、GPE消泡剂0.04~0.25%,余量为水。
在一种优选的实施方式中,所述一级种子培养基由如下质量百分比的组分制备得到:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
在一种实施方式中,S2为:配制二级种子培养基,以移种量为25%接种所述成熟的一级种子液,以培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min培养25h至培养基pH为7.9~8.1,发酵菌浓度为20~25%,获得成熟的二级种子液。优选地,所述二级种子培养基以120℃~122℃灭菌30min。
在一种实施方式中,所述二级种子培养基包括如下质量百分比的组分:黄豆饼粉1.5~2.5%、葡萄糖0.2~0.3%、玉米淀粉1.3~1.8%、玉米粉0.6~0.9%、氯化钠0.25~0.4%、碳酸钙0.05~0.2%、硝酸钠0.07~0.09%、GPE消泡剂0.04~0.25%,余量为水。
在一种优选的实施方式中,所述二级种子培养基由如下质量百分比的组分制备得到:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
在一种实施方式中,所述发酵培养为:配制发酵培养基,在所述发酵培养基灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,高温灭菌后用碱水调pH至6.3,以移种量为15%接种所述成熟的第二种子液,以培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养17小时发酵菌浓度50%以上进行补水,每次补充进料体积的6.7%体积的水,之后每12小时补水一次,77小时以后看液面情况补水,在培养20~89h时以流加的方式将补料甲硫氨酸补加入发酵液中,培养周期112~137h。优选地,所述发酵培养基的灭菌条件为:以120~122℃灭菌30min,所述甲硫氨酸的补料量为0.05~0.1%,甲硫氨酸溶液的浓度为0.014~0.03g/mL,补料速度为0.5~0.7mL/h/L。
在一种实施方式中,所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分:豆粕5~6%、硝酸钠1.0~1.5%、玉米淀粉8~12%、硫酸锌0.02~0.04%、玉米蛋白粉0.8~1.2%、磷酸二氢钾0.002~0.003%、豆油0.04~0.05%、GPE消泡剂0.03~0.05%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.2~0.3mL,余量为水。
在一种优选的实施方式中,所述发酵培养基由如下质量百分比的组分制备得到:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉1.2%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
实施例1
一种提高卡那霉素发酵水平的方法,包括如下步骤:
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.2,发酵菌浓度14%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h,培养至培养基pH为7.9,发酵菌浓度20%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共25L。在培养20~89h时以流加的方式将甲硫氨酸补加入发酵液中,甲硫氨酸补料量为1.0%,培养周期112h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉1.2%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为10810U/mL,卡那霉素B含量为1.28%,产量469.608g。
需要说明的是,在实施例1和下述实施例2和3以及对比实施例1至5发酵培养的过程中,转速和流量是不固定的,均以控制溶氧>30%为条件进行适应性调整。对于其他转速的限定,均以其对应的培养终点作适应性调整。
实施例2
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.2,发酵菌浓度10%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为7.9,发酵菌浓度20%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共25L。在培养20~69h时以流加的方式将甲硫氨酸补加入发酵液中,甲硫氨酸补料量为0.067%,培养周期113h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉1.2%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为10787U/mL,卡那霉素B含量为0.73%,产量469.776g。
实施例3
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.3,发酵菌浓度14%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为8.1,发酵菌浓度25%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共15L。在培养20~72h时以流加的方式将甲硫氨酸补加入发酵液中,甲硫氨酸补料量为0.05%,培养周期112h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉1.2%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为11237U/mL,卡那霉素B含量为1.23%,产量498.8225g。
对比实施例1
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.2,发酵菌浓度14%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为7.9,发酵菌浓度20%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共15L。培养周期136h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、棉籽精粉0.73%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为9612U/mL,卡那霉素B含量为2.51%,产量421.0056g。
对比实施例2
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.2,发酵菌浓度10%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为7.9,发酵菌浓度20%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共15L。培养周期136h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、棉籽精粉1.0%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为9426U/mL,卡那霉素B含量为2.23%,产量405.318g。
对比实施例3
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.3,发酵菌浓度14%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为8.1,发酵菌浓度25%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共15L。培养周期114h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉0.8%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为9507U/mL,卡那霉素B含量为0.67%,产量414.0475g。
对比实施例4
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.3,发酵菌浓度12%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为8.0,发酵菌浓度23%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共15L。培养周期114h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉1.0%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为9126U/mL,卡那霉素B含量为1.04%,产量399.7805g。
对比实施例5
S1、一级种子培养:配制一级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,接种量为0.06%,培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min,培养周期27h至培养基中菌丝舒展,培养基pH为7.2,发酵菌浓度12%,获得成熟的一级种子液。
所用一级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉1.67%、葡萄糖0.33%、玉米淀粉1.33%、玉米粉0.67%、酵母粉0.07%、氯化钠0.27%、碳酸钙0.07%、硝酸钠0.07%、GPE消泡剂0.25%,余量为水。
S2、二级种子培养:配制二级种子培养基,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,一级种子液接种在二级种子培养基中,移种量为25%,培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min,培养周期25h。培养至培养基pH为7.9,发酵菌浓度21%,获得成熟的二级种子液。
所用二级种子培养基原料按质量百分比包括:黄豆饼粉2.25%、葡萄糖0.22%、玉米淀粉1.8%、玉米粉0.9%、氯化钠0.36%、碳酸钙0.18%、硝酸钠0.09%、GPE消泡剂0.04%,余量为水。
S3、发酵培养:配制发酵培养基,灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,在120℃~122℃的温度下灭菌30min,灭菌后用碱水调pH至6.3。移种量为15%,培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵菌浓度和液面情况补水共15L。培养周期114h。
所用发酵培养基原料按质量百分比包括:豆粕5.5%、硝酸钠1.33%、玉米淀粉10.3%、硫酸锌0.032%、玉米蛋白粉1.2%、磷酸二氢钾0.0023%、豆油0.0455%、GPE消泡剂0.037%、高温淀粉酶(诺维信,酶活160000)0.23mL,余量为水。
经检测,所得发酵液的卡那霉素效价为10129U/mL,卡那霉素B含量为1.03%,产量435.2245g。
由上述数据可见,本发明所述一种提高卡那霉素发酵水平的方法所得卡那霉素效价在10500~11500U/mL之间,卡那霉素B含量在1.3%以下,产量在469~500g之间。而对比实施例1~5所述发酵生产卡那霉素的方法,由于缺乏甲硫氨酸的补入,因此其所得卡那霉素效价在9000~10200U/mL之间,卡那霉素B含量在0.67~2.51%之间,产量在400~440g之间,可以看出通过甲硫氨酸的补加能够有效提高卡那霉素的发酵水平,发酵水平相较于对比实施例而言有明显提高。对比实施例1、2有机氮源为棉籽精粉,对比实施例3~5为玉米蛋白粉,结果表明采用玉米蛋白粉使卡那霉素B含量的明显减少,实施例1~3证明在添加玉米蛋白粉和补加甲硫氨酸的共同作用下能有效控制卡那霉素B含量。
综上所述,实验证明采用玉米蛋白粉作为发酵有机氮源,在补料分批发酵的发酵方式下,在发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸溶液以连续补料的方式补加到发酵液中,能够有效提高卡那霉素的发酵水平,效价和产量明显提升,卡那霉素B含量得到了有效控制。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种提高卡那霉素发酵水平的方法,其特征在于,采用玉米蛋白粉作为发酵有机氮源,在补料分批发酵的发酵方式下,在发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸以连续补料的方式补加到发酵液中。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述补料甲硫氨酸的添加量为0.05~0.1(m/v)%。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述补料分批发酵的发酵菌种为卡那链霉菌。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将发酵菌种接种在一级种子培养基中培养至种子成熟,获得成熟的一级种子液;
S2、将所述成熟的一级种子液移种在二级种子培养基中培养至种子成熟,获得成熟的二级种子液;
S3、将所述成熟的二级种子液进行发酵培养,发酵培养至少20h后将补料甲硫氨酸加入发酵液,继续发酵112~137h后结束发酵。
5.根据权利要求4所述方法,其特征在于,S1为:配制一级种子培养基,以接种量为0.06%接种所述发酵菌种,以培养温度24.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速200~400rpm,流量60L/min培养27h至菌丝舒展,培养基pH为7.2~7.3,发酵菌浓度为10~14%,获得成熟的一级种子液。
6.根据权利要求5所述方法,其特征在于,所述一级种子培养基包括如下质量百分比的组分:黄豆饼粉1.5~2.5%、葡萄糖0.2~0.3%、玉米淀粉1.3~1.8%、玉米粉0.6~0.9%、酵母粉0.05~0.1%、氯化钠0.25~0.4%、碳酸钙0.05~0.2%、硝酸钠0.07~0.09%、消泡剂0.04~0.25%,余量为水。
7.根据权利要求4所述方法,其特征在于,S2为:配制二级种子培养基,以移种量为25%接种所述成熟的一级种子液,以培养温度23.5±0.5℃,罐压0.03Mpa,转速0~400rpm,流量60L/min培养25h至培养基pH为7.9~8.1,发酵菌浓度为20~25%,获得成熟的二级种子液。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述二级种子培养基包括如下质量百分比的组分:黄豆饼粉1.5~2.5%、葡萄糖0.2~0.3%、玉米淀粉1.3~1.8%、玉米粉0.6~0.9%、氯化钠0.25~0.4%、碳酸钙0.05~0.2%、硝酸钠0.07~0.09%、消泡剂0.04~0.25%,余量为水。
9.根据权利要求4所述方法,其特征在于,所述发酵培养为:配制发酵培养基,在所述发酵培养基灭菌前加入淀粉酶90℃液化10min,高温灭菌后用碱水调pH至6.3,以移种量为15%接种所述成熟的第二种子液,以培养温度26.5±0.5℃,罐压0.02Mpa,转速0~450rpm,流量1.2~2.5m3/h,控制溶氧>30%,培养过程中根据发酵发酵菌浓度度和液面情况补水,在培养20~89h时以流加的方式将补料甲硫氨酸补加入发酵液中,培养周期112~137h。
10.根据权利要求9所述方法,其特征在于,所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分:豆粕5~6%、硝酸钠1.0~1.5%、玉米淀粉8~12%、硫酸锌0.02~0.04%、玉米蛋白粉0.8~1.2%、磷酸二氢钾0.002~0.003%、豆油0.04~0.05%、消泡剂0.03~0.05%、高温淀粉酶0.2~0.3mL,余量为水。
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