CN113817623B - 一种提高那西肽发酵效价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高那西肽发酵效价的方法，优化了那西肽发酵的最佳培养条件，通过控制种子培养和发酵培养中pH、氨水加量和总糖的用量，使得菌体处理有利于产素的代谢环境，在补料过程中添加了小分子多肽类物质，促进了菌体吸收利用，解除了氮源阻遏，还增强菌丝发酵后期产素能力；能够提高那西肽发酵单位，降低发酵成本，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高那西肽发酵效价的方法。
背景技术
那西肽(Nosiheptide)又称诺西肽、诺肽菌素或诺肽霉素，是法国科学家于1961年在活跃链霉菌Streptomycesactuosus40037(NRRL2954)发酵液中分离得到的一种含硫多肽类抗生素。那西肽含有2个组分：A和B，其中A组分为主组分。那西肽对革兰氏阳性菌有明显抑制作用，特别是对葡萄球菌、枯草杆菌有较高的活性，能够有效抑制肠内有害细菌的生长，使肠道管壁吸收机能正常，并间接使肠黏膜形态结构发生变化，增加了消化吸收面积，提高饲料转化率。由于其毒性小、动物体内无残留、无耐药性、对人畜安全、对环境污染小等特点，属环保型饲料添加剂。
那西肽的生产方法主要为微生物发酵法。长期以来，国内传统工艺中加入高浓度的缓效氮源来促进那西肽多肽前体的合成，由于活跃链霉菌菌体对培养基成分和培养条件耐受性较差，高浓度的培养基成分不仅使发酵液流变特性差，传氧和传质效果差，对氮源的利用不充分导致中后期菌体衰亡较早，不利于菌体代谢和那西肽合成，发酵效价长期处于2000U/mL的水平。
近年来国内在提高那西肽效价的研究上开展了大量工作：
中国专利1CN103898181B-一种发酵生产那西肽的方法，将发酵代谢的步骤中pH值范围限定在6.8-7.3之间，溶氧范围限定在25-60％之间，在此条件下，发酵过程能够正常进行，菌体产素能力提高，发酵效价2500U/mL左右。
中国专利2CN104388506A-一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的方法，优化了活跃链霉菌的活化，通过不同阶段培养活跃链霉菌，提高其生物活性，针对不同阶段，配置了更加专一的培养基，为菌体生长提供更加合理的碳源、氮源、金属离子，保证菌体正常生产和代谢，发酵效价2600U/mL。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种提高那西肽发酵效价的方法，通过确定发酵过程中培养条件，其中包括：pH控制、氨水加量和总糖的最佳控制范围；确定了活跃链霉菌发酵生产那西肽的种子培养基、发酵培养基营养物质最佳配比，同时在合适的发酵时机以一定速率补加小分子肽类物质，有利于平衡初级代谢和次级代谢之间的转化，解除了氮源阻遏，增强了菌丝发酵后期产素能力，显著提高了那西肽发酵单位，发酵效价3000U/mL以上。
本发明采用的具体技术方案是：一种提高那西肽发酵效价的方法，关键是，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵种子液按0.2％的接种量接种于种子培养基中进行培养，培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％；当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7-6.9时移种，培养周期30h左右。
(2)二级种子培养：将培养好的一级种子液按10％的接种量接种于二级种子培养基中进行培养，培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％；当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7-6.9时移种，培养周期18h左右。
(3)发酵培养：将培养好的二级种子液按15％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为25％-35％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.06-0.08L/m3/h，控制pH6.8-7.0，同时降温至29℃；过程中通过维持pH、糖点、氨水补加量和补加小分子肽类物质等，使菌浓维持在45-55％，培养周期为210h，发酵结束，得到那西肽发酵液。
所述一级种子培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉2-4％，高温豆粉2-4％，玉米浆0.4-0.6％，硫酸铵0.4-0.6％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.15-0.35％，液体消泡剂0.03-0.05％，豆油0.1-0.3％，pH自然。
所述二级种子培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉2-4％，高温豆粉2-4％，酵母粉0.5-1.5％，玉米浆0.4-0.6％，硫酸铵0.4-0.6％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.15-0.35％，液体消泡剂0.03-0.05％，豆油0.1-0.3％，pH自然。
所述发酵培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉5-7％，高温豆粉2-4％，玉米浆0.3-0.5％，硫酸铵0.3-0.5％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.1-0.3％，七水硫酸锌0.005-0.015％，七水硫酸亚铁0.004-0.006％，硝酸钠0.1-0.3％，硫酸钠0.1-0.3％，淀粉酶0.1-0.3％，液体消泡剂0.03-0.05％，豆油0.1-0.3％，pH6.6-6.8。
所述发酵过程中采用流加法进行补料一(补料一：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠)，其中，总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖的范围至1.5-2.5g/100mL。
所述发酵过程中补料二中小分子肽类物质包括，大豆肽、鱼肽、玉米肽等其中的一种或至少两种。
所述发酵过程中小分子肽类物质的补加方式为：浓度为3-5％，发酵80h开始补加，80h-180h流加速率2-4L/m3/h。
本发明的有益效果是：本发明确定了那西肽发酵的最佳培养条件，其中包括pH、氨水加量和总糖控制等，使得菌体处理有利于产素的代谢环境；本发明在补料过程中添加了小分子多肽类物质，促进了菌体吸收利用，解除了氮源阻遏。还增强菌丝发酵后期产素能力；本发明的技术方案能够提高那西肽发酵单位，降低发酵成本，方法控制性强，标准化程度高，有利于那西肽的工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
一、实施例
实施例1
一级种子培养：培养基体积20L。
一级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制一级种子培养基，125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在50％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7时移种，培养周期30h左右。
二级种子培养：培养基体积20L。
二级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油
0.2％，pH自然。
按比例配制二级种子培养基，125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好培养好的一级种子发酵液按10％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在50％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7时移种，培养周期18h左右。
发酵培养：培养基体积60L。
发酵培养基：淀粉5％，高温豆粉2％，玉米浆0.3％，硫酸铵0.3％，碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，七水硫酸锌0.005％，七水硫酸亚铁0.004％，硝酸钠0.1％，硫酸钠0.1％，淀粉酶0.1％，液体消泡剂0.03％，豆油0.1％，pH6.6。
按比例配制发酵培养基，125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量15％，发酵过程中菌浓维持在45-55％，培养周期为210h，发酵结束，即得到那西肽发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为25％-35％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.06L/m3/h，控制pH6.8，同时降温至29℃。
补料工艺控制：
采用流加法进行补料一(补料一：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠)：总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖1.5g/100mL。
采用流加法进行补料二(5％大豆肽)：发酵80h开始补加，80h-180h流加速率2-4L/m3/h。
发酵培养结束，菌浓50.7％，发酵周期为210h，检测那西肽效价为3168U/mL。
实施例2
一级种子培养：培养基体积20L。
一级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制一级种子培养基，121℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.9时移种，培养周期30h左右。
二级种子培养：培养基体积20L。
二级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制二级种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好培养好的一级种子发酵液按10％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7时移种，培养周期18h左右。
发酵培养：培养基体积60L。
发酵培养基：淀粉6％，高温豆粉3％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.2％，七水硫酸锌0.01％，七水硫酸亚铁0.005％，硝酸钠0.2％，硫酸钠0.2％，淀粉酶0.2％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH6.7。
按比例配制发酵培养基，121℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量15％，发酵过程中菌浓维持在45-55％，培养周期为210h，发酵结束，即得到那西肽发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为25％％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.07L/m3/h，控制pH6.9，同时降温至29℃。
补料工艺控制：
采用流加法进行补料一(补料一：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠)：总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖2.0g/100mL。
采用流加法进行补料二(3-5％鱼肽)：发酵80h开始补加，80h-180h流加速率2-4L/m3/h。
发酵培养结束，菌浓51.5％，发酵周期为210h，检测那西肽效价为3222U/mL。
实施例3
一级种子培养：培养基体积20L。
一级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制一级种子培养基，122℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在40％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.8时移种，培养周期30h左右。
二级种子培养：培养基体积20L。
二级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制二级种子培养基，122℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好培养好的一级种子发酵液按10％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.8时移种，培养周期18h左右。
发酵培养：培养基体积60L。
发酵培养基：淀粉7％，高温豆粉4％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，七水硫酸锌0.015％，七水硫酸亚铁0.006％，硝酸钠0.3％，硫酸钠0.3％，淀粉酶0.3％，液体消泡剂0.05％，豆油0.3％，pH6.8。
按比例配制发酵培养基，123℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量15％，发酵过程中菌浓维持在50％，培养周期为210h，发酵结束，即得到那西肽发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为35％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.08L/m3/h，控制pH7.0，同时降温至29℃。
补料工艺控制：
采用流加法进行补料一(补料一：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠)：总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖2.5g/100mL。
采用流加法进行补料二(3-5％玉米肽)：发酵80h开始补加，80h-180h流加速率2-4L/m3/h。
发酵培养结束，菌浓52.8％，发酵周期为210h，检测那西肽效价为3189U/mL。
对比实施例1
一级种子培养：培养基体积20L。
一级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制一级种子培养基，125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.9时移种，培养周期30h左右。
二级种子培养：培养基体积20L。
二级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制二级种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好培养好的一级种子发酵液按10％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在50％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.9时移种，培养周期18h左右。
发酵培养：培养基体积60L。
发酵培养基：淀粉6％，高温豆粉3％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.2％，七水硫酸锌0.01％，七水硫酸亚铁0.005％，硝酸钠0.2％，硫酸钠0.2％，淀粉酶0.2％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH6.7。
按比例配制发酵培养基，125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量15％，发酵过程中菌浓维持在45％，培养周期为210h，发酵结束，即得到那西肽发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为25％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.07L/m3/h，控制pH6.9，同时降温至29℃。
补料工艺控制：
采用流加法进行补料一(补料一：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠)：总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖2.0g/100mL。
发酵培养结束，菌浓50.5％，发酵周期为210h，检测那西肽效价为2452U/mL。
对比实施例2
一级种子培养：培养基体积20L。
一级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制一级种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵液按0.2％接种量接种于种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7时移种，培养周期30h左右。
二级种子培养：培养基体积20L。
二级种子培养基：淀粉3％，高温豆粉3％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.25％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH自然。
按比例配制二级种子培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。将培养好培养好的一级种子发酵液按10％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，种子培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在40％，当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7-6.9时移种，培养周期18h左右。
发酵培养：培养基体积60L。
发酵培养基：淀粉6％，高温豆粉3％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.3％，氯化钠0.2％，七水硫酸锌0.01％，七水硫酸亚铁0.005％，硝酸钠0.2％，硫酸钠0.2％，淀粉酶0.2％，液体消泡剂0.04％，豆油0.2％，pH6.7。
按比例配制发酵培养基，121-125℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。
将培养好的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量15％，发酵过程中菌浓维持在55％，培养周期为210h，发酵结束，即得到那西肽发酵液；
发酵培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为30％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.07L/m3/h，控制pH6.9，同时降温至29℃。
补料工艺控制：
采用流加法进行补料一(补料一：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠)：总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖2.0g/100mL。
采用流加法进行补料二(3％高温豆粉)：发酵80h开始补加，80h-180h流加速率3L/m3/h。
发酵培养结束，菌浓52.1％，发酵周期为210h，检测那西肽效价为2638U/mL。
二、实验效果
| 放罐效价U/mL | 效价高出比％ | |
| 实施例1 | 3168 | 29.20 |
| 实施例2 | 3222 | 31.40 |
| 实施例3 | 3189 | 30.06 |
| 对比实施例1 | 2452 | —— |
| 对比实施例2 | 2618 | 7.59 |
由上述数据可见，对比实施例1-2所述提高那西肽发酵效价的方法对那西肽效价在(2400U/mL-2600U/mL)之间，其水平提高的程度远远低于本发明实施例1-3的数据(3100U/mL-3200U/mL)。那西肽为多肽类抗生素，分子结构由多种氨基酸组成，菌体合成代谢过程中需要丰富的氨基酸物质，而发酵培养基中大多数氨基酸来自于有机氮源，氮源添加量过低容易造成代谢不足，添加过量则容易造成阻遏抑制，从而导致效价偏低。与对比实施例中不添加或其他缓效氮源，本发明的优点为在补料过程中添加了小分子多肽类物质，容易被菌体吸收利用，解除了氮源阻遏，避免菌体向初级代谢转化，有效增强了菌体产素能力；本发明的技术方案能够提高那西肽发酵单位，降低发酵成本，有利于那西肽的工业化生产。
Claims (1)
1.一种提高那西肽发酵效价的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：将培养好的活跃链霉菌种瓶发酵种子液按0.2％的接种量接种于种子培养基中进行培养，培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％；当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7-6.9时移种，培养周期30h左右；
(2)二级种子培养：将培养好的一级种子液按10％的接种量接种于二级种子培养基中进行培养，培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度29℃，通气比1.0vvm，溶氧控制在30-50％；当菌浓达到28％以上，菌丝密网状，pH值6.7-6.9时移种，培养周期18h左右；
(3)发酵培养：将培养好的二级种子液按15％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.04Mp，培养温度30℃，通气比0.8vvm，溶氧的范围为25％-35％，8h开始补加20％的氨水，补加量为0.06-0.08L/m3/h，控制pH6.8-7.0，同时降温至29℃；过程中通过维持pH、糖点、氨水补加量和补加小分子肽类物质，使菌浓维持在45-55％，培养周期为210h，发酵结束，得到那西肽发酵液；
所述一级种子培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉2-4％，高温豆粉2-4％，玉米浆0.4-0.6％，硫酸铵0.4-0.6％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.15-0.35％，液体消泡剂0.03-0.05％，豆油0.1-0.3％，pH自然；
所述二级种子培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉2-4％，高温豆粉2-4％，酵母粉0.5-1.5％，玉米浆0.4-0.6％，硫酸铵0.4-0.6％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.15-0.35％，液体消泡剂0.03-0.05％，豆油0.1-0.3％，pH自然；
所述发酵培养基的各组分的质量百分含量为：淀粉5-7％，高温豆粉2-4％，玉米浆0.3-0.5％，硫酸铵0.3-0.5％，碳酸钙0.2-0.4％，氯化钠0.1-0.3％，七水硫酸锌0.005-0.015％，七水硫酸亚铁0.004-0.006％，硝酸钠0.1-0.3％，硫酸钠0.1-0.3％，淀粉酶0.1-0.3％，液体消泡剂0.03-0.05％，豆油0.1-0.3％，pH6.6-6.8；
发酵过程中采用流加法进行补料一，总糖降至2.5g/100mL开始补料，控制总糖的范围至1.5-2.5g/100mL，补料一培养基组成为：50％淀粉，0.1％淀粉酶，0.2％硝酸钠；
发酵过程中补料二中小分子肽类物质包括，大豆肽、鱼肽、玉米肽其中的一种或至少两种；
发酵过程中小分子肽类物质的补加方式为：浓度为3-5％，发酵80h开始补加，80h-180h流加速率2-4L/m3/h。
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