CN112852680A - 一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，公开了一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，包括如下步骤：S1将凝结芽孢杆菌在选择性培养基中进行划线活化，得到单菌落；S2将S1中的单菌落经活化培养后转接到种子培养基中进行扩大培养，得到发酵种子液；S3将S2中的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分段式分批补料发酵。本申请的液体发酵方法，通过对发酵过程进行优化，得到高芽孢数的发酵菌液，其芽孢形成速率快且芽孢率高，便于后续的离心浓缩干燥工序，从而得到高芽孢数的凝结芽孢杆菌产品，降低生产成本，便于产品推广。

Description

一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法。
背景技术
传统的乳酸菌虽具有很强的产乳酸的特点，但是其在耐热、耐胆盐、耐胃酸这方面的能力却很差，因此凝结芽孢杆菌既有芽孢又产乳酸的特点极大的弥补了这一缺点。凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂应用于动物养殖中在动物肠道产生的一系列的生物正效应是通过在动物肠道中生长时分泌多种有益的代谢产物并且与肠道中的其他益生菌相互作用从而起到提高动物的生长效率的作用。
研究表明，凝结芽孢杆菌因其具备强大的产酶系统，可以产生诸多的酶类，当凝结芽孢杆菌在动物肠道中定植后，在其生长繁殖过程中会分泌淀粉酶和蛋白酶，可以帮助动物机体对营养物质的吸收，从而动物的生长的速率并且提高营养物质的利用率。凝结芽孢杆菌在动物肠道中进行生长繁殖会代谢出多种小分子的营养物质，比如维生素、氨基酸，从而与肠道中的其他益生菌产生协同作用，促进肠道的蠕动，提高动物肠道的消化功能，促进动物对饲料的利用率从而提高动物的机体性能。
然而，目前市场上所售的凝结芽孢杆菌产品大多数存在菌数低、芽孢率低、活性差等普遍现象，甚至于有些产品以次充好，以其他芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌混合后用以提高凝结芽孢杆菌的检测活菌数。究其原因，还是凝结芽孢杆菌发酵水平较低以及高性能菌种未能实现高水平发酵。
发明内容
<本发明解决的技术问题>
当前的凝结芽孢杆菌存在菌数低、芽孢率低、活性差的问题。
<本发明采用的技术方案>
针对上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种高芽孢数凝结芽孢杆菌液体发酵方法。
具体内容如下：
本发明提供了一种高芽孢数凝结芽孢杆菌液体发酵方法，包括如下步骤：
S1将凝结芽孢杆菌在选择性培养基中进行划线活化，得到单菌落；
S2将S1中的单菌落经活化培养后转接到种子培养基中进行扩大培养，得到发酵种子液；
S3将S2中的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分段式分批补料发酵。
<本发明达到的有益效果>
本发明的提供的液体发酵方法，通过对发酵过程进行优化，得到高芽孢数的发酵菌液，其芽孢形成速率快且芽孢率高，便于后续的离心浓缩干燥工序，从而得到高芽孢数的凝结芽孢杆菌产品，降低生产成本，便于产品推广。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，包括如下步骤：
S1将凝结芽孢杆菌在选择性培养基中进行划线活化，得到单菌落；
S2将S1中的单菌落经活化培养后转接到种子培养基中进行扩大培养，得到发酵种子液；
S3将S2中的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分段式分批补料发酵。
本发明通过甘油管藏方式进行凝结芽孢杆菌的长期保藏，再采用平板划线的方式进行活化。在上述操作方法中，省去了斜面培养，这是由于凝结芽孢杆菌若经斜面保藏后再进行挑取活化会使其活性有所降低。
本发明中，S1中，选择性培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖0.5～3％、蛋白胨0.5～2％、酵母粉0.1～1％、牛肉浸取物0.5～2％、三水合乙酸钠0.1～1％、三水合磷酸氢二钾0.1～1％、一水合硫酸锰0.01～0.1％、七水合硫酸镁0.005～0.01％、碳酸钙0.1～0.5％和柠檬酸钠0.05～0.5％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5～7.5之间，再加入琼脂粉1.5～2％，121℃灭菌20min制备得到。选择性培养基中添加了碳酸钙，固体培养基划线培养凝结芽孢杆菌时，其能够利用葡萄糖代谢产生乳酸等，使菌落周围环境pH下降，会出现透明圈，在活化菌种时能够通过透明圈的大小初步判断单菌落的活性，有利于挑取性能良好的单菌落。
本发明中，S1中，选择性培养基培养条件为在35～45℃恒温培养箱培养，培养时间为24～48h。
本发明中，S2中，种子培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，蔗糖1～3％、酵母粉0.5～1.5％、蛋白粉1～3％、磷酸氢二钾0.3～1％和氯化钠0.5～1.5％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5～7.5之间，121℃灭菌30min制备得到。种子培养基中的碳源选择蔗糖，一方面凝结芽孢杆菌能够很好利用蔗糖，另一方面凝结芽孢杆菌以蔗糖为碳源发酵产乳酸等代谢产物比以葡萄糖为碳源效果差，在以蔗糖为碳源发酵时发酵液pH下降较慢，较晚或者不会出现酸抑制现象，能够保证种子液中凝结芽孢杆菌的菌数以及活性。
本发明中，蛋白粉的制备方法为，羽毛粉经酶解后喷雾干燥处理，再与蛋白胨混合得到，羽毛粉与蛋白胨的添加比例为1:1～3:1(w/w)；羽毛粉的酶解工艺为，按每克羽毛粉添加10～20单位的中性角蛋白酶，在pH6.0～7.0条件下处理48h，再按每克羽毛粉添加20～30单位碱性角蛋白酶在pH 8.0～9.0条件下处理48h即可。羽毛粉采用液态酶解方法，处理温度为40～60℃。
本发明中，S2中，种子培养基的培养条件为35～40℃，150～250r/min震荡培养24～48h。
本发明中，S3中，发酵培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，发酵豆粕2～5％、蔗糖1～3％、蛋白粉1～3％、磷酸氢二钾0.1～05％、七水合硫酸镁0.01～0.05％、一水合硫酸锰0.01～0.05％、碳酸钙0.5～1.5％和氯化钠0.5～2％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至5.0～7.0之间，121℃灭菌30min制备得到。
本发明中，发酵豆粕的制备方法为，生豆粕经混合菌包发酵后烘干粉碎得到；混合菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、或乳酸菌中的至少一种。
本发明中，S3中，分段式分批补料发酵包括三个发酵阶段，第一个阶段为菌体快速生长阶段，第二阶段为补料阶段，第三阶段为芽孢形成阶段。
本发明的第三阶段为芽孢形成阶段，首先通过降低发酵温度，有利于诱导芽孢的形成；其次，通气量以及搅拌的参数设置都是保证发酵液中的溶氧充足，从而有利于芽孢的形成。
本发明中，第一阶段的发酵罐控制条件如下：接种量3～10％，培养温度40～50℃，pH控制为5.5～6.5，通气量0.5～1.0m3/h，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，搅拌转速100～150r/min，该阶段持续培养时间为12～18h。对于第一阶段，在此范围内的温度以及通气量，有助于凝结芽孢杆菌前期的快速生长，同时能够适当地缩短延滞期。
本发明中，第二阶段的补料培养基组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖0.5～2％、蛋白粉0.5～2％和酵母粉0.5～1％，余量为水，121℃灭菌20min制备得到；第二阶段的补料时间为发酵液的pH开始由下降转变为上升时开始补料，补料周期为12～24h。
本发明在pH由下降转为上升时，及时地进行补料操作。这是由于pH开始转为上升时表明发酵液中碳源剩余不多，此时及时进行连续补料能够保证菌体持续增殖，提前补料不能很好判断补料时间，延迟补料会对菌体增殖造成影响，当发酵液pH由下降刚转为上升时为补料的最佳时期。
本发明中，第三阶段的发酵罐控制条件如下：培养温度35～45℃，pH控制为7.0～8.0，通气量1.0～1.5m3/h，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，搅拌转速200～300r/min，溶氧维持10％～30％，该阶段持续培养时间为12～24h。第三阶段为芽孢形成阶段，通过降低发酵温度，有利于诱导芽孢的形成，通气量以及转速的设置，作用在于保证发酵液的溶氧充足，利于芽孢的形成。
综上所述：
(1)本发明根据凝结芽孢杆菌的生长过程中对环境条件需求不同，将其发酵过程分为三个阶段进行，每个阶段都将发酵条件控制在最适，芽孢形成速率快并且芽孢率高，能够制成纯度高且菌数高的凝结芽孢杆菌产品。
(2)本发明通过对发酵培养基以及发酵条件优化，得到了一种可实现高芽孢数的凝结芽孢杆菌液体发酵方法，同时发酵培养基成分简单且价格低廉，有效的降低了生产成本，有利于凝结芽孢杆菌发酵产品的推广。
<实施例>
实施例1
本实施例以100L发酵罐为例，提供一种高芽孢数凝结芽孢杆菌液体发酵方法，包括如下步骤：
S1将凝结芽孢杆菌在选择性固体培养基中进行划线活化，并得到单菌落；
具体的，固体选择培养基的成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、牛肉浸取物1％、三水合乙酸钠0.5％、三水合磷酸氢二钾0.5％、一水合硫酸锰0.05％、七水合硫酸镁0.005％、碳酸钙0.3％和柠檬酸钠0.1％，其余为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5±0.1，再加入琼脂粉2％，121℃灭菌20min制备得到。
S2将S1得到的单菌落活化培养后转接到种子培养基中进行扩大培养得到发酵种子液；
具体的，种子培养基组成成分如下：按质量百分比计算，蔗糖2％、酵母粉1％、蛋白粉2％、磷酸氢二钾0.3％和氯化钠0.5％，余量为水，以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5±0.1，121℃灭菌30min制备得到。
蛋白粉的制备方法为，(1)首先按每克羽毛粉添加15单位中性角蛋白酶，在pH6.0～7.0条件下处理48h，然后再按每克羽毛粉添加25单位碱性角蛋白酶在Ph8.0～9.0条件下处理48h，得到处理后的蛋白粉；处理后的蛋白粉再经常规的液态酶解处理，处理温度为50℃，得到酶解羽毛粉；(2)酶解蛋白粉干燥后，与蛋白胨按重量比为1:1混合得到蛋白粉。
S3将S2中经扩大培养得到的种子液按3％接种量接入装有发酵培养基的100L发酵罐中进行分批补料发酵。
具体的，发酵培养基组成成分如下：按质量百分比计算，发酵豆粕3％、蔗糖3％、蛋白粉2％、磷酸氢二钾0.3％、七水合硫酸镁0.05％、一水合硫酸锰0.05％、碳酸钙1.5％和氯化钠0.5％，余量为水，以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5±0.1，121℃灭菌30min制备得到。
发酵豆粕的制备方法为，生豆粕经混合菌发酵烘干粉碎得到，混合菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和乳酸菌的混合物，枯草芽孢杆菌的添加狼为1亿cfu/g豆粕，地衣芽孢杆菌的添加量为1亿cfu/g豆粕，乳酸菌的添加量为5000万cfu/g豆粕，合计：混合菌添加总量为2.5亿cfu/g生豆粕。发酵豆粕的发酵工艺为常规技术。
S3中发酵罐第一阶段控制条件如下：接种量5％，培养温度45℃，初始pH值6.5，发酵罐罐压0.05Mpa，通气量1.0m3/h，搅拌转速100r/min，维持控制条件12h。
S3中第二阶段分批补料的补料培养基组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖1％、蛋白粉1％和酵母粉0.5％，余量为水，121℃灭菌20min。分批补料的时间为发酵过程中发酵液的pH开始由下降转变为上升时开始补料，补料周期为12h。
S3中第三阶段发酵罐控制条件如下：培养温度40℃，pH控制为7.5±0.1，通气量1.5m3/h，发酵罐罐压0.03Mpa，搅拌转速300r/min，溶氧维持20％，维持控制条件12h，当镜检发酵液中凝结芽孢杆菌大多数形成芽孢时即发酵结束。
使用凝结芽孢杆菌选择培养基检测上述发酵条件下凝结芽孢杆菌总菌数为180×108cfu/mL，芽孢数为170×108cfu/mL，芽孢形成率约为94％。
将本实例中发酵液经碟片离心机离心后，发酵液浓缩4～5倍，添加15％麦芽糊精混合均匀后经喷雾干燥，进风温度180℃，出口温度80℃，得到高芽孢数的凝结芽孢杆菌菌粉产品，经检测菌粉产品中总菌数为2000×108cfu/mL，芽孢数约为1800×108cfu/mL，菌粉收率为90％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，
种子培养基组成成分如下：按质量百分比计算，蔗糖3％、酵母粉1.5％、蛋白粉3％、磷酸氢二钾0.5％和氯化钠1％，余量为水，以氢氧化钠和盐酸调节pH至7.0之间，121℃灭菌30min。
发酵培养基组成成分如下：按质量百分比计算，发酵豆粕4％、蔗糖3％、蛋白粉2％、磷酸氢二钾0.5％、七水合硫酸镁0.02％、一水合硫酸锰0.02％、碳酸钙1.5％和氯化钠1％，余量为水，以氢氧化钠和盐酸调节pH至7.0±0.1，121℃灭菌30min。
第一阶段控制条件如下：接种量10％，培养温度50℃，初始pH值6.0，发酵罐罐压0.05Mpa，通气量0.7m3/h，搅拌转速120r/min，维持控制条件16h。
第二阶段分批补料的补料培养基组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖1.5％、蛋白粉1％和酵母粉1％，余量为水，121℃灭菌20min。分批补料的时间为发酵过程中发酵液的pH开始由下降转变为上升时开始补料，补料周期为18h。
第三阶段发酵罐控制条件如下：培养温度37℃，pH控制为8.0±0.1，通气量1.3m3/h，发酵罐罐压0.03Mpa，搅拌转速200r/min，溶氧维持25％，维持控制条件20h，当镜检发酵液中凝结芽孢杆菌大多数形成芽孢时即发酵结束。
使用凝结芽孢杆菌选择培养基检测上述发酵条件下凝结芽孢杆菌总菌数为230×108cfu/mL，芽孢数为210×108cfu/mL，芽孢形成率约为91.3％。
将本实例中发酵液经碟片离心机离心后，发酵液浓缩4～5倍，添加20％麦芽糊精混合均匀后经喷雾干燥，进风温度180℃，出口温度85℃，得到高芽孢数的凝结芽孢杆菌菌粉产品，经检测菌粉产品中总菌数为2500×108cfu/mL，芽孢数约为2200×108cfu/mL，菌粉收率为88％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，
发酵培养基组成成分如下：按质量百分比计算，发酵豆粕5％、蔗糖3％、蛋白粉1％、磷酸氢二钾0.3％、七水合硫酸镁0.03％、一水合硫酸锰0.02％、碳酸钙1％和氯化钠1％，余量为水，以氢氧化钠和盐酸调节pH至7.0±0.1，121℃灭菌30min。
第一阶段控制条件如下：接种量8％，培养温度47℃，初始pH值5.8，发酵罐罐压0.04Mpa，通气量0.5m3/h，搅拌转速130r/min，维持控制条件14h。
第二阶段分批补料的补料培养基组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖2％、蛋白粉2％和酵母粉1％，余量为水，121℃灭菌20min。分批补料的时间为发酵过程中发酵液的pH开始由下降转变为上升时开始补料，补料周期为24h。
第三阶段发酵罐控制条件如下：培养温度45℃，pH控制为7.5±0.1，通气量1.5m3/h，发酵罐罐压0.05Mpa，搅拌转速300r/min，溶氧维持30％，维持控制条件24h，当镜检发酵液中凝结芽孢杆菌大多数形成芽孢时即发酵结束。
使用凝结芽孢杆菌选择培养基检测上述发酵条件下凝结芽孢杆菌总菌数为270×108cfu/mL，芽孢数为240×108cfu/mL，芽孢形成率约为88.9％。
将本实例中发酵液经碟片离心机离心后，发酵液浓缩4～5倍，添加20％麦芽糊精混合均匀后经喷雾干燥，进风温度180℃，出口温度85℃，得到高芽孢数的凝结芽孢杆菌菌粉产品，经检测菌粉产品中总菌数为3000×108cfu/mL，芽孢数约为2700×108cfu/mL，菌粉收率为90％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将凝结芽孢杆菌在选择性培养基中进行划线活化，得到单菌落；
S2将S1中的单菌落经活化培养后转接到种子培养基中进行扩大培养，得到发酵种子液；
S3将S2中的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分段式分批补料发酵。
2.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S1中，选择性培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖0.5～3％、蛋白胨0.5～2％、酵母粉0.1～1％、牛肉浸取物0.5～2％、三水合乙酸钠0.1～1％、三水合磷酸氢二钾0.1～1％、一水合硫酸锰0.01～0.1％、七水合硫酸镁0.005～0.01％、碳酸钙0.1～0.5％和柠檬酸钠0.05～0.5％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5～7.5之间，再加入琼脂粉1.5～2％，121℃灭菌20min制备得到。
3.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S2中，种子培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，蔗糖1～3％、酵母粉0.5～1.5％、蛋白粉1～3％、磷酸氢二钾0.3～1％和氯化钠0.5～1.5％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5～7.5之间，121℃灭菌30min制备得到。
4.根据权利要求3所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，蛋白粉的制备方法为，羽毛粉经酶解后喷雾干燥处理，再与蛋白胨混合得到；羽毛粉的酶解工艺为，按每克羽毛粉添加10～20单位的中性角蛋白酶，在pH6.0～7.0条件下处理48h，再按每克羽毛粉添加20～30单位碱性角蛋白酶在pH8.0～9.0条件下处理48h即可。
5.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S3中，发酵培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，发酵豆粕2～5％、蔗糖1～3％、蛋白粉1～3％、磷酸氢二钾0.1～05％、七水合硫酸镁0.01～0.05％、一水合硫酸锰0.01～0.05％、碳酸钙0.5～1.5％和氯化钠0.5～2％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至5.0～7.0之间，121℃灭菌30min制备得到。
6.根据权利要求5所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，发酵豆粕的制备方法为，生豆粕经混合菌包发酵后烘干粉碎得到；混合菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、或乳酸菌中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S3中，分段式分批补料发酵包括三个发酵阶段，第一个阶段为菌体快速生长阶段，第二阶段为补料阶段，第三阶段为芽孢形成阶段。
8.根据权利要求7所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，第一阶段的发酵罐控制条件如下：接种量3～10％，培养温度40～50℃，pH控制为5.5～6.5，通气量0.5～1.0m3/h，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，搅拌转速100～150r/min，该阶段持续培养时间为12～18h。
9.根据权利要求7或8所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，第二阶段的补料培养基组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖0.5～2％、蛋白粉0.5～2％和酵母粉0.5～1％，余量为水，121℃灭菌20min制备得到；第二阶段的补料时间为发酵液的pH开始由下降转变为上升时开始补料，补料周期为12～24h。
10.根据权利要求7所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，第三阶段的发酵罐控制条件如下：培养温度35～45℃，pH控制为7.0～8.0，通气量1.0～1.5m3/h，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，搅拌转速200～300r/min，溶氧维持10％～30％，该阶段持续培养时间为12～24h。
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