CN113528405A - 利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法，属于发酵工程技术领域。本发明公开一种利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法，包括菌种多级驯化、棉籽粕预处理以及固体浅盘发酵；其中，所述棉籽粕预处理是将棉籽粕与水混合，调节pH后，添加复合酶和无机盐，得到预处理棉籽粕；所述固体浅盘发酵，是向所述预处理棉籽粕中接种经过多级驯化的凝结芽孢杆菌，固体发酵培养，得到凝结芽孢杆菌发酵物，干燥后得到成品。本发明利用预处理棉籽粕固体发酵凝结芽孢杆菌，可以大幅度提高凝结芽孢杆菌的发酵菌数，实现了凝结芽孢杆菌的高密度发酵，扩展了棉籽粕资源的利用途径，提升了资源的利用效率。

Description

利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，特别是涉及一种利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法。
背景技术
随着微生物生态学研究的不断深入以及抗生素大范围使用所带来的抗药性问题，无毒、无抗药性、对环境无污染且能调节肠道微生态平衡的绿色环保的微生态制剂已越来越受到人们的关注，其中以益生菌—乳酸菌为代表，被广泛应用于食品、医疗、保健、畜牧业和水产等行业。但是乳酸菌普遍存在对环境的抗逆性差(不耐热、稳定性差等)的缺点，尤其进入肠道后对胃酸、胆盐的耐受能力不强，易失活导致保存期短的问题给微生态制剂的保藏、运输都带来了较大困难。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一类能形成芽孢的产乳酸细菌，被美国食品药品监督管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全微生物菌种名单。它除了具有一般乳酸菌维持肠道微生态平衡、刺激免疫、提高机体健康水平、提高人和动物消化功能等作用外，同时由于能产生芽孢，具有抗逆性强、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压和易贮存等独特的生物特性，已成为益生菌菌株研发的热点。
目前，关于高密度发酵凝结芽孢杆菌的研究大部分集中在液态发酵工艺，少有固态发酵的报到。相比于液态发酵，固态发酵具有操作简单、成本低、绿色无污染的优势。在固态发酵凝结芽孢杆菌的报道中，大部分采用麸皮、米糠等混合物作为发酵载体，未发现以棉籽粕为单一载体进行凝结芽孢杆菌纯培养的报道。
棉籽粕是棉籽榨油后的副产物，产量丰富，蛋白含量高，是一种十分优质的植物源蛋白，具有很高的利用价值。但棉籽粕存在以下几点问题：1.棉籽粕中粗纤维≥10％、含量高；淀粉≤2％、含量低，同时含有大量的非淀粉多糖，比如棉籽糖≥6％，阻碍了微生物利用碳源快速增值；2.棉籽粕蛋白质含量高，但是可消化利用率低，不能为微生物提供充足的有效氮源；3.棉籽粕中含有大量游离棉酚，游离棉酚作为一种有毒物质能够抑制微生物的繁殖。通过对棉籽粕进行预处理，能够改变棉籽粕的营养组成，提高能量和蛋白的利用率，降低棉酚含量，实现益生菌的大量增殖，对进一步挖掘棉籽粕资源利用途径，提高棉籽粕利用效率具有积极作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法，以解决上述现有技术存在的问题，利用预处理棉籽粕固体发酵凝结芽孢杆菌，可以大幅度提高凝结芽孢杆菌的发酵菌数，实现了凝结芽孢杆菌的高密度发酵，扩展了棉籽粕资源的利用途径，提升了资源的利用效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法，包括菌种多级驯化、棉籽粕预处理以及固体浅盘发酵；
其中，所述棉籽粕预处理是将棉籽粕与水混合，调节pH后，添加复合酶和无机盐，得到预处理棉籽粕；
所述固体浅盘发酵，是向所述预处理棉籽粕中接种经过多级驯化的凝结芽孢杆菌，固体发酵培养，得到凝结芽孢杆菌发酵物，干燥后得到成品。
优选的是，具体包括以下步骤：
(1)菌种多级驯化：将凝结芽孢杆菌接种于驯化培养基中，40-55℃振荡培养24h，制备一级驯化种子液；将所得一级驯化种子液再次接种到所述驯化培养基中，与一级驯化相同条件下培养得到二级驯化种子液；之后依次经过5-10级驯化制备生产菌种；
(2)棉籽粕预处理：将棉籽粕与水按照质量比1:0.6-1:2混合，调节pH为6.0-10.0后，添加复合酶和无机盐反应，得到预处理棉籽粕；
(3)固体浅盘发酵：向所述预处理棉籽粕中接种3-20％所述生产菌种，控制所述预处理棉籽粕5-15cm，固体发酵培养24-72h，得到凝结芽孢杆菌发酵物，干燥制得成品。
优选的是，步骤(1)中，所述驯化培养基包括以下组分：棉籽粕浸提液20-60％，葡萄糖5-10％，磷酸氢二钾2-5％，氯化钠2-5％，硫酸锰0.2-1％，硫酸镁0.1-0.5％，其余为水。
优选的是，所述棉籽粕浸提液的制备方法包括：
将棉籽粕和质量分数50％的酒精按照质量比1:4-1:6混合均匀，调节pH到5.0-6.0，室温静置；
静置后再离心，收集上清液并浓缩蒸发50％液体，所得浓缩液即为棉籽粕浸提液。
优选的是，步骤(1)中，所述凝结芽孢杆菌按照0.5-5％接种于所述驯化培养基。
优选的是，步骤(2)中，所述复合酶是α-半乳糖苷酶：甘露聚糖酶：角蛋白酶按照质量比4:3:3混合而成；
所述无机盐为硫酸亚铁。
优选的是，步骤(2)中，反应条件为：50-60℃反应3-24h。
优选的是，步骤(3)中，发酵温度为40-55℃，发酵过程中不进行翻料，发酵结束后控制环境温度80-100℃低温烘干，粉碎包装。
本发明还提供一种由所述的方法制备的凝结芽孢杆菌。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的凝结芽孢杆菌驯化工艺能够快速筛选适应棉籽粕的菌种，提升菌种的适应能力。同时，本发明提供的棉籽粕预处理工艺能够高效降解棉籽粕，改变棉籽粕营养组分，解决了以棉籽粕为主要原料发酵中存在的菌数低的问题，结合本发明提供的固态浅盘发酵工艺，可以改变现有技术采用固态发酵设备控制发酵所带来的高成本、高能耗的缺陷，另外本发明公开的固态发酵工艺大幅度提升了凝结芽孢杆菌的发酵菌数，总菌数≥12×109cfu/g，总芽孢数≥11×109cfu/g，芽孢率≥90％。实现了凝结芽孢杆菌的高密度发酵，扩展了棉籽粕资源的利用途径，提升了资源的利用效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1不同驯化次数对驯化后凝结芽孢杆菌菌体生物量的影响；
图2为凝结芽孢杆菌YSF17的菌落形态；
图3为凝结芽孢杆菌YSF17的营养体形态；
图4为凝结芽孢杆菌YSF17的芽孢形态；
图5为基于16S rDNA序列构建的凝结芽孢杆菌YSF17系统进化树。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用的凝结芽孢杆菌是通过如下方法获得的：
采集河北省保定市健康农场羊。以无菌棉签和镊子采集新鲜动物粪便于无菌离心管中，每种动物样品取三份。称取采集的新鲜粪便样品10g，用90mL无菌水稀释并于室温下震荡30min。准备无菌纱布将上述震荡处理的粪便样品过滤取滤液，重复过滤三次。将得到的滤液置于80℃水浴锅中热处理处理15min除去非芽孢菌体。将上述热处理后的粪便过滤液梯度稀释适当梯度后涂布于含有溴甲酚紫的YPD固体平板上各一份，并于50℃培养箱中培养24h。挑取YPD固体平板上周围有黄色变色圈的菌落于YPD液体培养基中，50℃静止培养24h。将上述菌液以稀释涂布法用含溴甲酚紫指示剂的YPD培养基进行产酸筛选，挑取产黄色变色圈较大的单菌落进行多次分离纯化，得到单菌落，命名为YSF17。
上述分离的凝结芽孢杆菌YSF17的菌种培养方法如下：
YPD平板纯化分离：无菌条件下用接种环挑取凝结芽孢杆菌YSF17，在YPD平板上划线，平板置于50℃培养箱中倒置培养24h，挑取单菌落到液体YPD中进行下一步活化，活化过后进行实验。
YPD培养基组成(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，水1000；115℃灭菌20min。固体培养基额外添加1.5％的琼脂粉。
菌数量的检测方法：准确称取10g样品加入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，震荡30min使其完全溶解制成待测液悬液。准确吸取1.0mL上述待测液，加入到9mL无菌水中，充分震荡，以此梯度稀释，分别得到10-2、10-3、10-4、……的稀释液，稀释到适当梯度后，使用移液器准确吸取100μL用于平板涂布。芽孢计数在稀释之前将待测液悬液放于80℃水浴锅热处理15min，然后再进行之后步骤。菌落计数标准参考GB4789-2-2010《食品安全国家标准》。
对凝结芽孢杆菌YSF17进行形态学以及生长特性分析，如图2-4所示，凝结芽孢杆菌YSF17的生物学特性如下：
1.菌落形态呈圆形，直径约为2-3mm，不透明，呈乳白色，整体微微隆起，中心微微凸起，表面粗糙有光泽，边缘呈轻微的发散锯齿状。
2.菌体形态呈短杆状，两端钝圆，单个、成对或链状排列生长，形成芽孢，芽孢端生，革兰氏染色阳性。
3.能专性分解糖，主要代谢产物为乳酸。
本发明的凝结芽孢杆菌YSF17的16S rDNA碱基序列，如SEQ ID No.1所示，其16SrDNA序列的系统进化树如图5所示。结果显示该菌为芽孢杆菌属。
SEQ ID No.1：
gcggctggctccgtaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgcaggcgggttgcagcctgcaatccgaactgggaatggttttctgggattggcttaacctcgcggtctcgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaaggtcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaaggccctgtctccagggaggtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagccgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagcctcccagtttccaatgaccgcttgcggttgagccgcaagatttcacatcagacttaagaagccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggccgggtaccgtcaaggcgccgccctgttcgaacggcacttgttcttccccggcaacagagttttacgacccgaaggccttcttcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttaccccaccaactagctaatgcgccgcgggcccatctgtaagtgacagccgaagccgtctttcctttttcctccatgcggaggaaaaaactatccggtattagccccggtttcccggcgttatcccgatcttacaggcaggttgcccacgtgtt
上述分离的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)YSF17，已于2021年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021965，保藏地点为中国武汉武汉大学。
实施例1
1、凝结芽孢杆菌的多级驯化
将凝结芽孢杆菌从-80℃冰箱中取出复溶，按照0.5％接种量接种到100ml的驯化培养基中，40℃，250rpm/min振荡培养24h制得一级驯化种子菌。以一级驯化种子菌作为种子液，再次按照0.5％接种量接种到100ml的驯化培养基中，相同条件制得二级种子液，重复5次得到五级种子液。
所述驯化培养基组分包括：棉籽粕浸提液40％,葡萄糖5％，磷酸氢二钾2％，氯化钠3％，硫酸锰0.2％，硫酸镁0.2％。所述棉籽粕浸提液是将棉籽粕和与质量分数50％的酒精按照质量比1:4混合均匀，调节pH到5.5，25℃条件下，静置2h，混合物5000rpm/min离心10min保留上清液，然后将上清液在65℃条件下浓缩蒸发50％液体，最后得到浓缩液制备的。
以每级驯化菌种在棉籽粕中培养的生物量为监测指标，如图1所示，5次驯化后的菌体生物量最高，通过对比可以发现，经过5次驯化的菌种在进行棉籽粕固态发酵时菌数生物量为11×109cfu/g，驯化过程能够提高菌种对棉籽粕的适应性，提升发酵生物量。
2、棉籽粕的预处理
将棉籽粕与水按照质量比1:1混合均匀，用生石灰调节棉籽粕pH到9.0，添加5％复合酶和0.02％的硫酸亚铁，控制温度为60℃，预处理时间为12h。所述复合酶组分包括：α-半乳糖苷酶∶甘露聚糖酶∶角蛋白酶＝4:3:3。
经过预处理后棉籽粕的棉酚含量由最初的1173mg/kg降至311.3mg/kg，减少了棉酚对凝结芽孢杆菌的生长抑制作用。此外，相比于棉籽粕原料，预处理棉粕中棉籽糖含量从61g/kg降低至13g/kg，粗纤维从10.7％降低至8.3％，半乳糖含量从0g/kg提升到16g/kg，蔗糖含量从5g/kg提升到30g/kg，提升了棉籽粕中可利用速效碳源的比例。
3、固态浅盘发酵凝结芽孢杆菌
向预处理棉籽粕中直接接种10％的5级驯化菌种，控制物料厚度为5cm，温度为50℃，发酵过程中不需要进行翻料，物料表面覆盖透气的滤布，培养48h，发酵结束后控制环境温度80℃，物料烘干后即得到凝结芽孢杆菌发酵物，粉碎包装制得成品。
实施例2
1、凝结芽孢杆菌的多级驯化
将凝结芽孢杆菌从-80℃冰箱中取出复溶，按照1％接种量接种到100ml的驯化培养基中，45℃，200rpm/min振荡培养24h制得一级驯化种子菌。以一级驯化种子菌作为种子液，再次按照0.5％接种量接种到100ml的驯化培养基中，相同条件制得二级种子液，重复5次得到五级种子液。
所述驯化培养基组分包括：棉籽粕浸提液20％，葡萄糖5％，磷酸氢二钾2％，氯化钠2％，硫酸锰0.2％，硫酸镁0.1％。所述棉籽粕浸提液是将棉籽粕和与质量分数50％的酒精按照质量比1:5混合均匀，调节pH到5.0，25℃条件下，静置2h，混合物5000rpm/min离心10min保留上清液，然后将上清液在60℃条件下浓缩蒸发50％液体，最后得到浓缩液制备的。
以每级驯化菌种在棉籽粕中培养的生物量为监测指标，通过对比可以发现，经过5次驯化的菌种在进行棉籽粕固态发酵时菌数生物量为10.5×109cfu/g，驯化过程能够提高菌种对棉籽粕的适应性，提升发酵生物量。
2、棉籽粕的预处理
将棉籽粕与水按照质量比0.6：1混合均匀，用生石灰调节棉籽粕pH到6.0，添加1％复合酶和0.02％的硫酸亚铁，控制温度为60℃，预处理时间为12h。所述复合酶组分包括：α-半乳糖苷酶：甘露聚糖酶：角蛋白酶＝4:3:3。
经过预处理后棉籽粕的棉酚含量由最初的1173mg/kg降至320.5mg/kg，减少了棉酚对凝结芽孢杆菌的生长抑制作用。此外，相比于棉籽粕原料，预处理棉粕中棉籽糖含量从61g/kg降低至19g/kg，粗纤维从10.7％降低至9.0％，半乳糖含量从0g/kg提升到12.4g/kg，蔗糖含量从5g/kg提升到23.4g/kg，提升了棉籽粕中可利用速效碳源的比例。
3、固态浅盘发酵凝结芽孢杆菌
向预处理棉籽粕中直接接种3％的5级驯化菌种，控制物料厚度为10cm，温度为40℃，发酵过程中不需要进行翻料，物料表面覆盖透气的滤布，培养24h，发酵结束后控制环境温度80℃，物料烘干后即得到凝结芽孢杆菌发酵物，粉碎包装制得成品。
实施例3
1、凝结芽孢杆菌的多级驯化
将凝结芽孢杆菌从-80℃冰箱中取出复溶，按照5％接种量接种到100ml的驯化培养基中，55℃，300rpm/min振荡培养24h制得一级驯化种子菌。以一级驯化种子菌作为种子液，再次按照5％接种量接种到100ml的驯化培养基中，相同条件制得二级种子液，重复5次得到五级种子液。
所述驯化培养基组分包括：棉籽粕浸提液60％,葡萄糖10％，磷酸氢二钾5％，氯化钠5％，硫酸锰1％，硫酸镁0.5％。所述棉籽粕浸提液是将棉籽粕和与质量分数50％的酒精按照质量比1:6混合均匀，调节pH到6.0，25℃条件下，静置2h，混合物5000rpm/min离心10min保留上清液，然后将上清液在80℃条件下浓缩蒸发50％液体，最后得到浓缩液制备的。
以每级驯化菌种在棉籽粕中培养的生物量为监测指标，通过对比可以发现，经过5次驯化的菌种在进行棉籽粕固态发酵时菌数生物量为10.9×109cfu/g，驯化过程能够提高菌种对棉籽粕的适应性，提升发酵生物量。
2、棉籽粕的预处理
将棉籽粕与水按照质量比1:2混合均匀，用生石灰调节棉籽粕pH到10.0，添加10％复合酶和0.02％的硫酸亚铁，控制温度为60℃，预处理时间为12h。所述复合酶组分包括：α-半乳糖苷酶：甘露聚糖酶：角蛋白酶＝4:3:3。
经过预处理后棉籽粕的棉酚含量由最初的1173mg/kg降至316.3mg/kg，减少了棉酚对凝结芽孢杆菌的生长抑制作用。此外，相比于棉籽粕原料，预处理棉粕中棉籽糖含量从61g/kg降低至15g/kg，粗纤维从10.7％降低至8.6％，半乳糖含量从0g/kg提升到14.2g/kg，蔗糖含量从5g/kg提升到26g/kg，提升了棉籽粕中可利用速效碳源的比例。
3、固态浅盘发酵凝结芽孢杆菌
向预处理棉籽粕中直接接种20％的5级驯化菌种，控制物料厚度为15cm，温度为55℃，发酵过程中不需要进行翻料，物料表面覆盖透气的滤布，培养72h，发酵结束后控制环境温度100℃，物料烘干后即得到凝结芽孢杆菌发酵物，粉碎包装制得成品。
实施例4
选取6080只225日龄的罗曼粉壳蛋鸡，随机分到3个处理组，各处理组4个重复，每个重复500只，试验期2个月。其中2个处理组在对照组饲粮基础上分别添加100万cfu/g和500万cfu/g实施例1制备的凝结芽孢杆菌。试验结果表明，在产蛋期的基础日粮中添加100万cfu/g和500万cfu/g凝结芽孢杆菌，可以显著提高产蛋率1.87％(P<0.05)和2.39％(P<0.05)，显著降低破蛋率15.93％(P<0.05)和19.97％(P<0.05)，显著降低腹泻率30.79％(P<0.05)和42.63％(P<0.05)，同时对降低死淘率具有一定作用。从试验结果看，产蛋高峰期在基础日粮中添加500万cfu/g凝结芽孢杆菌能够有效提高蛋鸡的生产性能，同时经济效益也比较显著。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 四川润格生物科技有限公司
<120> 利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggctggct ccgtaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60
cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120
agcgattccg gcttcatgca ggcgggttgc agcctgcaat ccgaactggg aatggttttc 180
tgggattggc ttaacctcgc ggtctcgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg 240
tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300
accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaaggtcaa gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420
tcactctgtc ccccgaaggg gaaggccctg tctccaggga ggtcagagga tgtcaagacc 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600
gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660
tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720
acagaccaga gagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780
tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagcct cccagtttcc aatgaccgct 840
tgcggttgag ccgcaagatt tcacatcaga cttaagaagc cgcctgcgcg cgctttacgc 900
ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960
gccgtggctt tctggccggg taccgtcaag gcgccgccct gttcgaacgg cacttgttct 1020
tccccggcaa cagagtttta cgacccgaag gccttcttca ctcacgcggc gttgctccgt 1080
cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 1140
gtctcagtcc caatgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt tgccttggtg 1200
agccgttacc ccaccaacta gctaatgcgc cgcgggccca tctgtaagtg acagccgaag 1260
ccgtctttcc tttttcctcc atgcggagga aaaaactatc cggtattagc cccggtttcc 1320
cggcgttatc ccgatcttac aggcaggttg cccacgtgtt 1360

Claims (9)

1.一种利用预处理棉籽粕固态发酵制备凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括菌种多级驯化、棉籽粕预处理以及固体浅盘发酵；
其中，所述棉籽粕预处理是将棉籽粕与水混合，调节pH后，添加复合酶和无机盐，得到预处理棉籽粕；
所述固体浅盘发酵，是向所述预处理棉籽粕中接种经过多级驯化的凝结芽孢杆菌，固体发酵培养，得到凝结芽孢杆菌发酵物，干燥后得到成品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)菌种多级驯化：将凝结芽孢杆菌接种于驯化培养基中，40-55℃振荡培养24h，制备一级驯化种子液；将所得一级驯化种子液再次接种到所述驯化培养基中，与一级驯化相同条件下培养得到二级驯化种子液；之后依次经过5-10级驯化制备生产菌种；
(2)棉籽粕预处理：将棉籽粕与水按照质量比1:0.6-1:2混合，调节pH为6.0-10.0后，添加复合酶和无机盐反应，得到预处理棉籽粕；
(3)固体浅盘发酵：向所述预处理棉籽粕中接种3-20％所述生产菌种，控制所述预处理棉籽粕5-15cm，固体发酵培养24-72h，得到凝结芽孢杆菌发酵物，干燥制得成品。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述驯化培养基包括以下组分：棉籽粕浸提液20-60％，葡萄糖5-10％，磷酸氢二钾2-5％，氯化钠2-5％，硫酸锰0.2-1％，硫酸镁0.1-0.5％，其余为水。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述棉籽粕浸提液的制备方法包括：
将棉籽粕和质量分数50％的酒精按照质量比1:4-1:6混合均匀，调节pH到5.0-6.0，室温静置；
静置后再离心，收集上清液并浓缩蒸发50％液体，所得浓缩液即为棉籽粕浸提液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述凝结芽孢杆菌按照0.5-5％接种于所述驯化培养基。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复合酶是α-半乳糖苷酶：甘露聚糖酶：角蛋白酶按照质量比4:3:3混合而成；
所述无机盐为硫酸亚铁。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应条件为：50-60℃反应3-24h。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，发酵温度为40-55℃，发酵过程中不进行翻料，发酵结束后控制环境温度80-100℃低温烘干，粉碎包装。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的方法制备的凝结芽孢杆菌。
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