JP5006986B1 - 芽胞形成能を有する新規菌株Bacilluscoagulanslilac−01 - Google Patents
芽胞形成能を有する新規菌株Bacilluscoagulanslilac−01 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 芽胞形成能を有する菌株Bacillus coagulans lilac−01(受託番号:NITE P−1102)。
【選択図】 図5
Description
(a)L−アラビノース、リボース、D−キシロース、ラムノース、α−メチル−D−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、D−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化する、
(b)マンニトールおよびD−アラビトールを資化しない。
(1)菌株の単離
北海道旭川市に生育しているライラックの花から、Bacillus coagulans(バチルスコアグランス)のコロニーおよび菌の形態を有する菌を単離し、これを試験菌株とした。具体的には、まず、ライラックの花を滅菌水に懸濁してライラック懸濁液を調製し、集積培養用培地に接種した後、55℃で2日間培養した。続いて、芽胞形成菌を選択するために、培養後の集積培養用培地を90℃で5分間加熱し、ブロモクレゾールパープル(BCP)を添加した標準寒天培地(日水製薬社)に前記加熱後の集積培養用培地を塗抹して、55℃で1日間培養した後、周囲が黄色を呈しているコロニーを選択して単離した。なお、BCPはpH5.2〜6.8の指示薬であり、pHが低下するにつれて、紫色から黄色へと呈色が変化することから、菌が酸を生成するか否かを確認することができる。
本実施例1(1)の試験菌株について、下記の試薬、装置およびプログラムを用いて、添付の仕様書に従い、16S rDNA塩基配列解析を行った。
使用プライマー;16S rDNAユニバーサルプライマー
フォワードプライマー;27F;5’−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3’(配列番号1)
リバースプライマー ;1492R;5’−GGTTACCTTGTTACGACTT−3’(配列番号2)
PCRに用いたDNAポリメラーゼ;EX TaqHS(TaKaRa社)
PCR産物の精製;SUREC−PCR(TaKaRa社)
シークエンス;3100Genetic Analyzer(Applied Biosystems社)
相同性検索;Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
市販の整腸薬であるパンラクミン錠(第一三共ヘルスケア社)から、バチルスコアグランスの一株であるラクボン菌を単離した。本実施例1(1)の試験菌株、ラクボン菌および標準株について、API50CH(bioMerieux社)を用いて各種の糖に対する資化性を確認して比較した。その結果を下記に示す。+は陽性を、−は陰性をそれぞれ示す。なお、試験菌株においては、下記に示すいずれの糖からもガスの産生は認められなかった。
コントロール − − −
グリセロール + + +
エリスリトール − − −
D−アラビノース − − −
L−アラビノース − + +
リボース − + +
D−キシロース − + +
L−キシロース − − −
アドニトール − − −
βメチルキシロシド − − −
ガラクトース + + +
D−グルコース + + +
D−フルクトース + + +
D−マンノース + + +
L−ソルボース − − −
ラムノース − + +
ダルシトール − − −
イノシトール − − −
マンニトール − − +
ソルビトール − − −
α−メチル−D−マンノシド − − −
α−メチル−D−グルコシド − + +
N−アセチルグルコサミン + + +
アミグダリン − + +
アルブチン − + +
エスクリン − + +
サリシン − + +
セロビオース − + +
マルトース + + +
ラクトース − + +
メリビオース − + +
スクロース − + +
トレハロース + + +
イヌリン − − −
メレジトース − − −
D−ラフィノース − + +
スターチ + + +
グリコーゲン − − −
キシリトール − − −
βゲンチオビオース − + +
D−チュラノース − − −
D−リキソース − − −
D−タガトース − − −
D−フコース − − −
D−アラビトール − − +
L−アラビトール − − −
グルコネート + + +
2ケト−グルコネート − − −
5ケト−グルコネート − − −
本実施例1(1)の試験菌株、本実施例1(3)のラクボン菌および標準株について、20℃〜70℃の間で5℃刻みの各温度において24時間培養した。培養条件は、試験用培地{ポリペプトン0.5%(w/w)、酵母エキス0.5%(w/w)、グルコース0.5%(w/w)、MgSO4・7H2O0.1%(w/w)}、好気条件下での静置培養とした。培養開始時、ならびに培養開始から2、4、6、8および24時間後に、分光光度計を用いて波長600nmにおける培地の吸光度(OD600)を測定した。測定した吸光度(濁度)を菌量の指標として増殖曲線のグラフを作成した。45℃、50℃、55℃および60℃における、培養開始から8時間後までの試験菌株の増殖曲線を図3に示す。また、50℃および55℃における増殖曲線を、試験菌株、ラクボン菌および標準株の間で比較した結果を図4に示す。
本実施例1(1)の試験菌株および本実施例1(3)の標準株について、芽胞形成能を比較した。具体的には、まず、試験菌株および標準株を、55℃、本実施例1(4)に記載の培養条件で前培養して前培養液を得た。また、本実施例1(4)の試験用培地にMnSO4を終濃度5ppmとなるよう添加して芽胞用培地を調製した。次に、芽胞用培地に試験菌株および標準株の前培養液を、1%(v/v)となるようそれぞれ添加して、本培養として40℃で5日間振盪培養した。本培養の培養日数が1日間、2日間および5日間の時点で、一定量の液を取って芽胞計測用液とし、芽胞数の計測を行った。その結果を図5に示す。なお、芽胞数の計測は、芽胞計測用液を90℃で5分間加熱した後、滅菌生理食塩水を用いて希釈し、これを標準寒天培地(日水製薬社)で混釈して、好気条件下、55℃で1日間培養して、出現したコロニー数を計測することにより行った。
2.運動性 あり
3.グラム染色 陽性
4.カタラーゼ 陽性
5.通性嫌気性
6.生育可能pH(最適pH) pH5.0〜9.0(pH5.0〜7.0)
(1)芽胞の発芽性試験
lilac−01株を、55℃、実施例1(4)に記載の培養条件で前培養し、前培養液を得た後、標準寒天培地(日水製薬社)のプレートに塗抹し、37℃で2日間培養した。出現したコロニーを掻き取って、実施例1(4)の試験用培地に懸濁することにより、芽胞液を調製した。続いて、芽胞液500μLをエッペンドルフチューブに入れたものを2つ用意し、AおよびBとした。Aのみ、ブロックヒーターを用いて90℃で10分間加熱することにより、発芽活性化処理を行った。その後、AおよびBを、ブロックヒーターを用いて30℃で5時間培養した。培養開始時および30℃での培養中の1時間経過毎に、実施例1(5)に記載の方法により芽胞数を計測し、位相差顕微鏡を用いて400倍で芽胞の観察を行った。培養開始時(発芽活性化処理を行う前)および5時間培養後のAにおける芽胞の観察結果を図6に、芽胞数の計測結果を図7にそれぞれ示す。なお、一般に、芽胞の発芽は熱によって活性化されることが知られている(蜂須賀養悦、化学と生物、第7巻、第509〜516頁、1969年)。
[2−1]液体中における耐熱性
lilac−01株を55℃、実施例1(4)に記載の培養条件で前培養して前培養液を得た。前培養液を実施例1(5)に記載の芽胞用培地に接種して、好気条件下で40℃で2日間振盪培養することにより菌液を調製し、芽胞数を計測した。この菌液をエッペンドルフチューブに100μLずつ入れたものを6つ用意し、ブロックヒーターを用いて70℃、80℃、85℃、90℃、95℃および100℃で、それぞれ30分間加熱した。加熱開始から10分後および30分後に一定量の菌液を取って芽胞数の計測を行った。なお、芽胞数の計測は、実施例1(5)に記載の方法により行った。その結果を図8に示す。
普通寒天培地のプレートにlilac−01株を塗抹して、好気条件下、40℃で2日間培養した。プレート上のコロニーを掻き取って滅菌水に入れて懸濁することにより、菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液50μLを小サイズのアルミケースに入れたものを10用意し、5つずつ2群に分けて、100℃群および120℃群とした。オーブン(アズワン社)を用いてこれらを60℃で30分間加熱することにより乾燥させた。その後、オーブンを用いて100℃群は100℃で、120℃群は120℃でそれぞれ30分間加熱した。100℃または120℃での加熱開始時、加熱開始から5分後、10分後、20分後および30分後に各群からアルミケースを1つずつ取り出し、その中に滅菌生理食塩水を入れて懸濁し、その全量を標準寒天培地(日水製薬社)で混釈し、好気条件下、55℃で1日間培養した後、コロニーの数を数えることにより生存した芽胞数を計測した。その結果を図9に示す。
[3−1]lilac−01培養オカラ粉の製造
造粒したオカラ900gを、ステンレス製カゴに入れてオートクレーブを用いて殺菌した。ここに、lilac−01株を3.6×106cfu/mLを含む培養液0.9mLを添加して、好気条件下、およそ50℃で26時間培養した後、乾燥機を用いて乾燥させ、粉末化して、これをlilac−01培養オカラ粉とした。lilac−01培養オカラ粉を一定量取って滅菌生理食塩水に希釈して希釈液とし、希釈液を標準寒天培地(日水製薬社)で混釈し、好気条件下、55℃で1日間培養した後、コロニーの数を数えることにより生菌数を計測したところ、3.0×108cfu/gであった。また、lilac−01培養オカラ粉の栄養分析を株式会社食環境衛生研究所に依頼して行った。lilac−01培養オカラ粉については得られた栄養分析値、オカラについては五訂増補日本食品標準成分表の値にそれぞれ基づいて、水分を0%とした値を算出して比較した。但し、イソフラボンの値はダイジン、グリシチン、ゲニスチンおよびそれらのアグリコン計6種類の総量の値とし、独立行政法人産業技術総合研究所北海道センターに依頼して得られた分析値に基づいた。その結果を表1に示す。
健康な女性(49歳)に、本実施例2(3)[3−1]のlilac−01培養オカラ粉1g(lilac−01株の菌数3.0×108cfu)を、水と一緒に1日1回、10日間摂取してもらった。摂取前、摂取開始から10日間経過後(摂取10日後)および摂取終了から6日間経過後(摂取終了6日後)に糞便を採取した。なお、試験期間中、食事制限は行わなかった。
リバースプライマー ;264−21R;5’−AAACTGAACAAAACGGAAACG−3’(配列番号5)
PCR反応溶液組成;フォワードプライマー(10pmol/μL) 2.5μL、リバースプライマー(10pmol/μL) 2.5μL、dNTP(各2.5mmol/L) 4μL、10×PCRバッファー 5μL、Ex Taq HS(5U/μL;TaKaRa社) 0.25μL、鋳型DNA液 1μL、dH20 34.75μL
PCR反応条件;94℃で5分の反応の後、94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分の各反応を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で2分の反応を行った。
(1)lilac−01入り豆乳
[1−1]lilac−01入り豆乳の製造
lilac−01株を実施例1(4)に記載の条件下で前培養して前培養液を得た。また、250mLの豆乳をバッフル付きフラスコに入れて、オートクレーブを用いて殺菌した。ここに、lilac−01株の前培養液を0.1%(v/v)となるよう添加して、40℃で2日間振盪培養することによりlilac−01入り豆乳を製造した。製造したlilac−01入り豆乳の栄養分析を財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。その結果を表3に示す。また、lilac−01入り豆乳中の生菌数を実施例2(3)[3−1]に記載の方法により、芽胞数を実施例1(5)に記載の方法により、それぞれ計測したところ、生菌数が8.0×108cfu/mLであり、芽胞数が4.9×108cfu/mLであった。
本実施例3(1)[1−1]に記載の方法により製造したlilac−01入り豆乳について、限度試験による急性毒性試験を財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。具体的には、lilac−01入り豆乳(生菌数1.4×109cfu/g、芽胞数8.6×108cfu/g)を投与量2000mg/kgでマウスに1回投与した後、14日間観察を行った。その結果、異常や死亡は認められなかったことから、lilac−01株入り豆乳は安全であることが確認された。
オカラを造粒した後、乾燥機を用いて乾燥させて、乾燥オカラとした。この乾燥オカラ200gに本実施例3(1)[1−1]のlilac−01入り豆乳50mLを添加して吸収させた後、乾燥機を用いて乾燥させ、粉末化して、これをlilac−01入りオカラ粉とした。lilac−01入りオカラ粉の栄養分析を財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。その結果を表4に示す。
ゆでたカボチャを水に入れて懸濁したものを、実施例2(3)[3−1]のlilac−01培養オカラ粉に吸収させてlilac−01カボチャオカラとした。続いて、乾燥機を用いて乾燥させて粉末化し、lilac−01カボチャオカラ粉とした。次に、薄力粉200g、ベーキングパウダー6g、lilac−01入りカボチャオカラ粉100g、無塩バター120g、砂糖100g、卵1個および塩少々を混ぜ合わせてlilac−01カボチャオカラクッキー生地を調製した後、成形して、予熱をしていたオーブンを用いて180℃で17分間焼成することによりlilac−01入りカボチャオカラクッキーを製造して検食した。製造途中において、lilac−01カボチャオカラ、lilac−01カボチャオカラ粉、lilac−01カボチャオカラクッキー生地およびlilac−01入りカボチャオカラクッキーのそれぞれから一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例2(3)[3−1]に記載の方法により計測した。また、lilac−01カボチャオカラ粉については、実施例1(5)に記載の方法により芽胞数も計測した。生菌数および芽胞数の計測結果を下記に示す。
lilac−01カボチャオカラ 1.1×109
lilac−01カボチャオカラ粉 6.6×109 1.8×109
lilac−01カボチャオカラクッキー生地 2.0×108
lilac−01入りカボチャオカラクッキー 4.7×106
実施例2(3)[3−1]のlilac−01培養オカラ粉15g、強力粉135g、西京味噌12g、ベーキングパウダー5gおよびバター10gをフードプロセッサーに入れて混ぜ合わせた。続いて、混ぜながら120mLの水を少しずつ入れて、一塊になるまで混ぜることによりlilac−01パン生地を調製した。lilac−01パン生地を4等分して成形し、打ち粉をしてから切れ目を入れて、予熱をしていたオーブンを用いて180℃で20分間焼成することによりlilac−01入りパンを製造して検食した。焼成後のlilac−01入りパンの表面温度および内部温度を、放射温度計を用いて測定したところ、表面温度は105℃であり、内部温度は70℃であった。
lilac−01パン生地 6.8×108 1.3×108
lilac−01入りパン 1.5×107 7.6×106
lilac−01入りラスク 5.0×106 6.6×106
本実施例3(1)[1−1]に記載の方法によりlilac−01入り豆乳(生菌数7.1×108cfu/mL、芽胞数5.3×108cfu/mL)を調製し、水道水を用いて5倍に希釈した。これをパン生地に80ベーカーズ%の割合で添加して、定法に従いパンを製造し、lilac−01入り豆乳パンとした。なお、焼成時のパン生地の大きさはおよそ17cm×7cm×6cm、焼成条件は170℃で45分とした。この製造途中におけるパン生地、lilac−01入り豆乳パンの端部および中心部のそれぞれから一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例2(3)[3−1]に記載の方法により、芽胞数を実施例1(5)に記載の方法によりそれぞれ計測した。その結果を下記に示す。
パン生地 6.2×107 2.2×107
lilac−01入り豆乳パン(端部) 1.3×106 3.8×105
lilac−01入り豆乳パン(中心部) 1.1×107 7.8×106
本実施例3(1)[1−1]に記載の方法によりlilac−01入り豆乳(生菌数7.6×108cfu/mL、芽胞数6.0×108cfu/mL)を調製し、これを生地に2−3%(w/w)の割合で添加して、定法に従いオレンジパウンドケーキ、フルーツパウンドケーキ、バタークッキー、チョコクッキーおよびヘーゼルナッツクッキーを製造し、lilac−01入り焼き菓子とした。但し、バタークッキーのみ焼成前に50時間冷凍庫で保存した。lilac−01入り焼き菓子から一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例2(3)[3−1]に記載の方法により、芽胞数を実施例1(5)に記載の方法によりそれぞれ計測した。lilac−01入り焼き菓子の焼成条件、焼成時の大きさならびに生菌数および芽胞数の計測結果を表5に示す。
(1)lilac−01入り飼料の製造
日清丸紅印平牧米子豚、子豚育成用配合飼料{可消化養分総量(Total Digestible Nutrients;TDN)77%以上、抗生物質無添加;日清丸紅飼料社}に、実施例3(2)に記載の方法により製造したlilac−01入りオカラ粉(生菌数1.1×108cfu/g、芽胞数8.2×107cfu/g)を0.5%(w/w)となるよう添加することによりlilac−01入り飼料を製造した。また、コントロールとしてlilac−01入りオカラ粉を添加しない上記飼料を用意し、これを通常飼料とした。
北海道夕張郡長沼町の養豚農家において、母豚がランドレース×ダイヨークシャーであり、父豚がバークシャーである三元交雑種の14〜16週齢の子豚1腹10頭を用意し、5頭ずつ2群に分けて試験群およびコントロール群とした。試験群には本実施例4(1)のlilac−01入り飼料を、コントロール群には本実施例4(1)の通常飼料を、それぞれ自由摂取させながら、2週間試験飼育を行った。試験飼育期間中の餌の摂取量は、試験群およびコントロール群のいずれも1頭あたりおよそ2kg/日であったことから、試験群におけるlilac−01株の芽胞摂取量は、1頭あたりおよそ108cfu/日であった。
(1)食品残渣を原料としたlilac−01入り飼料の製造
弁当製造工場から排出する新鮮な食品残渣1kgに対して、実施例2(3)[3−1]のlilac−01培養オカラ粉(生菌数1.1×108cfu/g、芽胞数8.2×107cfu/g)を0.5%(5g)、さらに無添加のオカラ粉9.5%(95g)を添加し、85℃、1分以上の熱処理を加えることによってlilac−01入り飼料を製造した。このようにして、実施例4と同等の整腸効果を有し、栄養価の高い飼料を作製することができた。また様々な食品残渣を原料とした飼料の製造を試みた結果、lilac−01培養オカラ粉を0.1から10%、無添加のオカラ粉を10から15%添加してよく粉砕混合することによって、同様に整腸効果を有し、栄養価の高い飼料を作製することが可能であることが明らかになった。
Claims (7)
- 芽胞形成能を有する菌株Bacillus coagulans lilac−01(受託番号:NITE P−1102)。
- 40℃で24時間以上培養後の芽胞数がBacillus coagulans標準株であるNBRC12583と比較して1000倍以上である、請求項1に記載の菌株。
- 増殖至適温度cが50℃<c<60℃である、請求項1または請求項2に記載の菌株。
- 50℃で6時間以上培養した後の菌量が、Bacillus coagulans標準株であるNBRC12583を50℃で6時間以上培養した後の菌量と比較して大である、請求項1から請求項3のいずれかに記載の菌株。
- 100℃で30分間加熱後の菌株の生存率が4%以上である、請求項1から請求項4のいずれかに記載の菌株。
- L−アラビノース、リボース、D−キシロース、ラムノース、α−メチル−D−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、D−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化し、かつマンニトールおよびD−アラビトールを資化しない、請求項1から請求項5のいずれかに記載の菌株。
- 食品または飼料の製造方法であって、請求項1から請求項6のいずれかに記載の菌株を添加する工程を有する前記方法。
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