CN105274034A

CN105274034A - 一种液态复合微生态制剂的制备方法

Info

Publication number: CN105274034A
Application number: CN201510793425.7A
Authority: CN
Inventors: 时祥柱; 姚丽梅; 吴坤; 连建芸; 况应谷; 陈炳钿
Original assignee: FUJIAN XINMINKE BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Corp Ltd
Current assignee: FUJIAN XINMINKE BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Corp Ltd
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2016-01-27

Abstract

本发明公开了一种液态复合微生态制剂的制备方法。包括复合菌种的筛选，种子液、二级发酵液的培养基配方，以及成品的制备步骤。本发明PH值在5.5-6.5之间，采用的微生物是地衣芽孢杆菌，嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌。该液态复合微生态制剂，富含乳酸、免疫多糖、生长因子和活性益生菌等。在增强动物机体免疫活性，降低动物肠道发病率，调节和提高畜禽各器官的生理功能方面，作用显著。本产品性能稳定，通过复合菌体的互惠共生，协同作用，充分的发挥了群体的联合作用优势，显著提高了嗜酸乳杆菌保藏期；缓解了发酵反馈抑制作用，能够使菌体保持良好的生物活性；能够节约成本，提高生产效率。

Description

一种液态复合微生态制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种液态复合微生态制剂的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

微生态制剂是作为饲料添加剂直接添加使用的一类制剂。当前，为了解决饲用抗生素引起的药物残留，各国畜牧业都在寻求绿色环保型抗生素替代品。而微生态制剂具有无毒副作用，无药性残留以及效果显著，成本低等诸多优势，是绿色添加剂的首选。

嗜酸乳杆菌是动物肠道主要益生菌，对肠道健康和生理调控起着重要作用。然而，嗜酸乳杆菌稳定性较弱。目前，市面上的嗜酸乳杆菌制品生产工艺多采用包埋和干燥的技术。若使用全部包埋，无法完全发挥其在胃中的有益作用；而使用干燥的方式难以避免部分菌体的死亡和过程中的能耗，并且生产成本高昂。

液态复合微生态制剂，利用微生物间的协同作用，发挥了群体的联合作用优势，很好的提高了菌体的稳定性，保持了生物活性，为调节动物生理活性发挥重要作用；而且制备工艺简单，有效的降低了成本，能够产生巨大的经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种液态复合微生态制剂的制备方法，旨在克服现有技术上乳酸菌稳定性不强，活性不高的问题。本发明对提高禽畜生产性能，特别是提高断奶仔猪的存活率和饲料利用率方面有明显效果。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

先通过菌株筛选选择发酵活力高，组合生长性能最优的菌种；通过发酵配方优化组合制成液态复合微生态制剂成品。所述液体发酵菌种的制备均单独采用液体发酵：斜面菌种－200mL三角瓶种子－20L发酵罐一级种子－200L发酵罐二级种子，放大至菌种液体体积达100L、菌体数量达到2×10⁹cfu/ml以上。

一种液态复合微生态制剂的制备方法，筛选发酵活力高，组合生长性能最优的菌种，再将地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌分别进行液体发酵后，将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1：1等量混合，再加入1~2倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至PH调至5.5-6.5，制成液态复合微生态制剂成品。地衣芽孢杆菌芽孢率为90%-100%。

液体发酵液的菌液接种量为：地衣芽孢杆菌1-5%，酿酒酵母1-5%，嗜酸乳杆菌2-10%。

地衣芽孢杆菌液体发酵方法为，取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30-37℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，30-37℃培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度30-37℃，150r/min,培养18-24h，再调节温度转32-37℃培养20-30h。地衣芽孢杆菌三角瓶培养基、10L液体发酵培养基,配方均为:葡萄糖1-3%、豆粕2-5%、牛肉膏0.1-1%、氯化钠0.1-1%,水1000mL,PH7.0；100L液体发酵培养基，配方为:豆粕2-5%，酵母膏0.1-1%，磷酸氢二钾0.1-1%，磷酸二氢钾0.1-1%，硫酸锰0.01-0.1%，水1000mL，pH7.0。

酿酒酵母菌液体发酵方法为，取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，28-35℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，28-35℃下培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，28-35℃下发酵18-24h。酿酒酵母菌的三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化钾0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-1%、硫酸镁0.01-0.1%、硫酸锌0.01-0.1%、硫酸铁0.01-0.1%，水1000mL，pH7.0。

嗜酸乳杆菌液体发酵方法为，取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，30-37℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，30-37℃下培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min，30-37℃下发酵18-24小时。嗜酸乳杆菌的三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸铵0.02%，吐温0.1%，水1000mL，pH6.2-6.6。

本发明的优点在于：

本发明的复合微生物制剂，菌液能够长期保存。其中地衣芽孢杆菌形成芽孢，处于休眠状态；在协同作用下，嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的稳定性大量提高，能够保持良好的菌体活性。

本发明的产品生产工艺简单，有效地降低了生产成本；本产品富含乳酸、小肽、免疫多糖、核酸、蛋白酶、生长因子和活性益生菌等，对禽畜作用效果明显，特别是在提高断奶仔猪的存活率和提高饲料利用率方面作用突出。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行描述。

实施例1

1.菌种的选择和组合。本发明从枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌中进行选择，通过菌种间拮抗作用测试最终确定地衣芽孢杆菌，酿酒酵母，嗜酸乳杆菌三者组合最佳。

2.最佳培养配方的确定。运用单因素试验的方法，选定最佳碳源氮源和无机盐比重，根据菌体的生长情况最终确定最佳培养基配方。液体发酵液的菌液接种量为：地衣芽孢杆菌1%，酿酒酵母1%，嗜酸乳杆菌2%。

3.取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30℃下培养18h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，30℃培养18h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度30℃，150r/min,培养18h，再调节温度转32℃培养20h。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基,配方均为:葡萄糖1%、豆粕2%、牛肉膏0.1%、氯化钠0.1%,水1000mL,PH7.0；100L液体发酵培养基，配方为:豆粕2%，酵母膏0.1%，磷酸氢二钾0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸锰0.01%，水1000mL，pH7.0。

4.取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，28-35℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，28-35℃下培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，28-35℃下发酵18-24h。三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化钾0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-1%、硫酸镁0.01-0.1%、硫酸锌0.01-0.1%、硫酸铁0.01-0.1%，水1000mL，pH7.0。

5.取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，30℃下培养18h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，30℃下培养18h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min，30℃下发酵18小时。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸铵0.02%，吐温0.1%，水1000mL，pH6.2。

6.发酵完成后的地衣芽孢杆菌发酵液PH为8.3，乳酸杆菌发酵液PH为4.1,酿酒酵母菌发酵液PH为4.1。将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1：1等量混合，再加入1倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至PH调至6即制备完成。该液态微生物制剂菌量可达20亿，保质期三个月。

实施例2

2.最佳培养配方的确定。运用单因素试验的方法，选定最佳碳源氮源和无机盐比重，根据菌体的生长情况最终确定最佳培养基配方。液体发酵液的菌液接种量为：地衣芽孢杆菌3%，酿酒酵母3%，嗜酸乳杆菌6%。

3.取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，35℃下培养20h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，35℃培养20h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度35℃，150r/min,培养20h，再调节温度转35℃培养25h。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基,配方均为:葡萄糖2%、豆粕3%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%,水1000mL,PH7.0；100L液体发酵培养基，配方为:豆粕3%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸锰0.05%，水1000mL，pH7.0。

4、取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30℃下培养20h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，32℃下培养22h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，32℃下发酵20h。三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、氯化钾0.05%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.05%、硫酸铁0.05%，水1000mL，pH7.0。

5、取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，35℃下培养22h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，35℃下培养22h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min，35℃下发酵22小时。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸铵0.02%，吐温0.1%，水1000mL，pH6.4。

6.发酵完成后的地衣芽孢杆菌发酵液PH为8.0，乳酸杆菌发酵液PH为4.0,酿酒酵母菌发酵液PH为4.0。将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1：1等量混合，再加入2倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至PH调至5.5即制备完成。该液态微生物制剂菌量可达20亿，保质期三个月。

实施例3

液体发酵液的菌液接种量为：地衣芽孢杆菌5%，酿酒酵母5%，嗜酸乳杆菌10%。

2.最佳培养配方的确定。运用单因素试验的方法，选定最佳碳源氮源和无机盐比重，根据菌体的生长情况最终确定最佳培养基配方。

3.取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，37℃下培养24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，37℃培养24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度37℃，150r/min,培养18-24h，再调节温度转37℃培养30h。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基,配方均为:葡萄糖3%、豆粕5%、牛肉膏1%、氯化钠1%,水1000mL,PH7.0；100L液体发酵培养基，配方为:豆粕5%，酵母膏1%，磷酸氢二钾1%，磷酸二氢钾1%，硫酸锰0.1%，水1000mL，pH7.0。

4.取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，35℃下培养24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，35℃下培养24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，35℃下发酵24h。三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖3%、蛋白胨1%、氯化钾0.1%、磷酸二氢钾1%、硫酸镁0.1%、硫酸锌0.1%、硫酸铁0.1%，水1000mL，pH7.0。

5.取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，37℃下培养24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，37℃下培养24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min，37℃下发酵24小时。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸铵0.02%，吐温0.1%，水1000mL，pH6.6。

6.发酵完成后的地衣芽孢杆菌发酵液PH为8.5，乳酸杆菌发酵液PH为4.5,酿酒酵母菌发酵液PH为4.5。将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1：1等量混合，再加入1倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至PH调至6.5即制备完成。该液态微生物制剂菌量可达20亿，保质期三个月。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：筛选发酵活力高，组合生长性能最优的菌种，再将地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌分别进行液体发酵后，将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1：1等量混合，再加入1~2倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至pH5.5-6.5，制成液态复合微生态制剂成品。

2.根据权利要求1所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：地衣芽孢杆菌芽孢率为90%-100%。

3.根据权利要求1液态所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：液体发酵液的菌液接种量为：地衣芽孢杆菌1-5%，酿酒酵母1-5%，嗜酸乳杆菌2-10%。

4.根据权利要求1液态所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：地衣芽孢杆菌液体发酵方法为，取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30-37℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，30-37℃培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度30-37℃，150r/min,培养18-24h，再调节温度转32-37℃培养20-30h。

5.根据权利要求4所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：地衣芽孢杆菌三角瓶培养基、10L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖1-3%、豆粕2-5%、牛肉膏0.1-1%、氯化钠0.1-1%,水1000mL,pH7.0；100L液体发酵培养基，配方为:豆粕2-5%，酵母膏0.1-1%，磷酸氢二钾0.1-1%，磷酸二氢钾0.1-1%，硫酸锰0.01-0.1%，水1000mL，pH7.0。

6.根据权利要求1液态所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：酿酒酵母菌液体发酵方法为，取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，28-35℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，28-35℃下培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，28-35℃下发酵18-24h。

7.根据权利要求6液态所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：酿酒酵母菌的三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化钾0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-1%、硫酸镁0.01-0.1%、硫酸锌0.01-0.1%、硫酸铁0.01-0.1%，水1000mL，pH7.0。

8.根据权利要求1液态所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：嗜酸乳杆菌液体发酵方法为，取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，30-37℃下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，30-37℃下培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min，30-37℃下发酵18-24小时。

9.根据权利要求8液态所述液态复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：嗜酸乳杆菌的三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸铵0.02%，吐温0.1%，水1000mL，pH6.2-6.6。