CN103756922A

CN103756922A - 一种生命结合态有机酵母蛋白硒产品生产方法和应用

Info

Publication number: CN103756922A
Application number: CN201310747684.7A
Authority: CN
Inventors: 刘东霞; 杜景德
Original assignee: Guangzhou Bosar Biological Technology Co ltd
Current assignee: GUANGZHOU BOSAR BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Guangzhou Boshiao Biochemical Technology Research Co Ltd
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明涉及一种生命结合态的有机酵母蛋白硒产品的生产方法和应用。本发明在发酵过程中所使用的硒源是纳米硒。纳米硒具有毒性低、比表面积大和生物活性高等优势，可提高酵母菌对硒的耐受量和生物利用率；本发明在酵母发酵培养基中加入蛋白酶，以提高发酵原料的利用率，降低成本。相比以往通过酵母菌把无机硒转化为有机硒的方法，本发明硒源采用纳米硒，其具有毒性低、转化率高、吸收率高、产品安全性能好、生物利用率高和便于大规模生产及收集等优点。

Description

一种生命结合态有机酵母蛋白硒产品生产方法和应用

技术领域

本发明涉及一种酵母蛋白硒产品的生产方法及应用领域，具体为一种生命结合态的有机酵母蛋白硒产品生产方法和应用。

背景技术

硒是人和动物机体必需的一种微量元素，是机体内多种酶的重要组成成分，具有抗氧化、调节机体代谢、增强免疫力等性能。但硒在最佳浓度和致毒浓度之间的安全限度非常狭窄，因此开发低毒、高效的硒源一直是硒营养研究的重点。纳米硒是一种新型的硒产品，具有毒性低、生物利用率高等特点。中华人民共和国农业部公告（第1226号），饲料添加剂品种目录（2008），矿物元素及其络（螯）合物中没有纳米硒，即纳米硒不能作为饲料添加剂。酵母菌具有富集硒元素的能力，酵母蛋白硒是通过酵母生长过程中对高浓度纳米硒硒的自主吸收和转化，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖结合，形成蛋白硒、氨基酸硒及多糖硒，即使硒元素以生命结合态的形式存在，从而消除硒元素对动物机体的伤害，并有利于机体的吸收利用。另外酵母中有丰富的营养成分，可以发挥协同作用。

当前，畜产品日趋丰富，市场对畜产品的需求已由以数量为主转向质量和数量并重的消费格局。酵母蛋白硒能促进动物机体的吸收利用率，提高畜禽的抗氧化和免疫性能，改善肉品质，又提高畜禽的生产性能，减少畜禽排泄物中氮、磷和硒的排泄量，保护水体和土壤免受污染，因而酵母硒作为一种高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂，在21世纪将有十分广阔的应用前景。

中国专利ZL201210496430.8提供了一种简单混合方法制备富硒生物菌肥的方法，没有将无机硒转化为有机硒，而且没有具体络和方法。中国专利ZL01100600.5提供了一种含有高生物量的富硒酵母及其生产方法，其每克富硒酵母细胞含有机硒量仅有500～1500微克。中国专利：201010191719.X使用亚硒酸钠所得产品硒含量5000mg/kg。

然而，酵母硒产品在应用过程中很少能达到显著效果；另外酵母硒很少能大生产。主要的问题：（1）酵母硒产品中硒含量较低；(2)酵母菌对无机硒的耐受量低；（3）酵母硒中有机硒含量低，一部分只是简单的酵母和硒吸附；（4）培养基原料利用率低，成本高，且生产工艺复杂，重复性很差；（5）酵母硒产品的吸收率低、安全性低及生物利用率低。

发明内容

本发明目的在于提供一种生命结合态的有机酵母蛋白硒产品、其生产方法和应用。所述生产方法是指利用微生物发酵生产高硒含量的酵母蛋白硒的方法。

本发明具体技术方案为：

一种生命结合态有机酵母蛋白硒产品，它由如下方法制备而得：在酵母发酵培养过程中分批加入纳米硒元素，通过酵母生长过程中对高浓度纳米硒的自主吸收和转化，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合，形成蛋白硒、氨基酸硒及多糖硒，即得以生命结合态存在的有机酵母蛋白硒产品。

无机硒毒性较大，酵母很难在高硒的条件下生长，即使有生长，其生长速率和对硒的利用率也不高。因此本发明所采用的硒源为纳米硒。纳米硒具有低毒高效优势，酵母菌对其具有较好耐受性能。

本发明所采用的纳米硒粒径主要在在20～100nm之间，是单质硒，呈红色。

所述酵母发酵培养过程中，酵母菌发酵培养基组份为豆粕50～80g/L、麸皮20～40g/L、麦芽汁15～40g/L和BOSAR蛋白酶0.1～0.3g/L。

优选地，所述酵母菌发酵培养基组份为豆粕70g/L、麸皮30g/L、麦芽汁20g/L和BOSAR蛋白酶0.2g/L。

优选地，所述酵母菌发酵培养基使用前进行以下预处理步骤：将培养基中的豆粕、麸皮、麦芽汁与BOSAR蛋白酶混合均匀后，在pH值为5.5～6.0、温度为50～55℃的条件下，水解5～7小时，将培养基中的蛋白质分解为小分子物质后，采用湿热法对液体培养基进行灭菌，即在121℃下，灭菌20～30min，然后冷却到常温。

优选地，所述酵母发酵培养过程具体包括如下步骤：

1）将酵母菌通过斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和发酵罐种子培养进行扩大培养；

2）将扩大培养后的酵母菌按5%接种量接种到灭菌的发酵培养基中，并采用分批次的加入纳米硒，在发酵温度26℃～32℃进行发酵，将酵母发酵液干燥，即得生命结合态的有机酵母蛋白硒。

优选地，所述步骤2）中加入的纳米硒总量为120～150mg/L。

优选地，所述步骤2）中的发酵温度为31℃。

优选地，所述步骤2）中的干燥是喷雾干燥。

优选地，所述步骤2）中的干燥还可以是喷粉干燥、蒸汽压力滚筒干燥或冷冻干燥。

本发明由上述方法制备而得的生命结合态的有机酵母蛋白硒产品，每kg产品中含硒10000～12000mg，其中有机硒含量占总硒的99.0～99.4%，可以应用于制备饲料。

本发明的主要特点有：

（1）本发明使用的纳米硒具有粒径小、比表面积庞大、活性中心多，表面台阶和粗糙度增加的特点，具有较强的低毒高效优势；酵母菌对纳米硒的耐受性能稳定，吸收利用率高。所得的酵母蛋白硒产品中含硒高，其中有机硒含量高达12000mg/kg。

（2）本发明生产高硒含量的酵母蛋白硒中的酵母可以有活性，而以前的技术生产的酵母硒中的酵母大多是没有活性的。

（3）本发明中发酵培养基经蛋白酶预处理后，为酵母菌提供了更多的游离氨基酸，提高原料利用率，促进酵母菌的生长繁殖、发酵速率，并减少菌体用于合成氨基酸等造成的底物流失和能耗。

（4）本发明所述方法制备而得的生命结合态有机酵母蛋白硒产品可以用于动物饲料和植物饲料的制备。

具体实施方式

实施例1：

生产流程如下：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。

（1）斜面菌种培养：将酵母菌划线于蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖10g/L、纳米硒120mg/L、琼脂20g/L、pH值为4.8～6.0固体平板上活化，31℃恒温培养48小时，挑取单菌落斜面保存备用。

（2）一级液体种子培养：挑取斜面上的酵母菌种1～4环接种于装有100～500mL蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖10g/L、纳米硒120mg/L、pH值为4.8～6.0液体培养基的三角瓶中，在31℃恒温培养48小时。

（3）二级液体种子培养：将一级种子培养液按1%的接种量接种于装有10～40L的蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖10g/L、纳米硒120mg/L、pH值为4.8～6.0的卡氏培养瓶中，在26℃～32℃培养18～48小时。

（4）发酵罐种子培养：将二级种子培养液按5%的接种量接种到装有1～15 m³的已预处理的发酵培养基中、纳米硒120mg/L的种子发酵罐中，在26℃～32℃培养18～48小时。

（5）发酵罐培养：将发酵罐种子培养液按5%的接种量接种到装有15～180m³的已预处理的发酵培养基中、纳米硒120mg/L的发酵罐中（纳米硒的加入方式为分批次加入），在26℃～32℃培养14～36小时。

发酵培养基预处理：将豆粕70g/L、麸皮30g/L、麦芽汁20g/L和BOSAR蛋白酶0.2g/L，混合均匀，在pH值为5.5～6.0、温度为50～55℃的条件下水解5～7小时,将培养基中大分子物质酶解为小分子物质后，加入磷酸氢氨6g/L,调pH值为4.8～6.0，采用湿热法对液体培养基进行灭菌，即在121℃下，灭菌20～30min，然后冷却到常温，接种。

（6）分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

（7）干燥：采用喷雾干燥法干燥，干燥的产品具有活性；采用喷粉干燥或者蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性，是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。

（8）包装：可以采用多种形式的包装成为高硒含量的富硒酵母产品。硒含量达到10000mg/kg，有机蛋白硒含量达到99.4%。

实施例2：

（1）斜面菌种培养：将酵母菌划线于蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖10g/L、纳米硒150mg/L、琼脂20g/L、pH值为4.8～6.0固体平板上活化，31℃恒温培养48小时，挑取单菌落斜面保存备用。

（2）一级液体种子培养：挑取斜面上的酵母菌种1～4环接种于装有100～500mL蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖10g/L、纳米硒150mg/L、pH值为4.8～6.0液体培养基的三角瓶中，在31℃恒温培养48小时。

（3）二级液体种子培养：将一级种子培养液按1%的接种量接种于装有10～40L的蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖10g/L、纳米硒150mg/L、pH值为4.8～6.0的卡氏培养瓶中，在26℃～32℃培养18～48小时。

（4）发酵罐种子培养：将二级种子培养液按5%的接种量接种到装有1～15 m³的已预处理的发酵培养基中、纳米硒150mg/L的种子发酵罐中，在26℃～32℃培养18～48小时。

（5）发酵罐培养：将发酵罐种子培养液按5%的接种量接种到装有15～180m³的已预处理的发酵培养基中、纳米硒150mg/L的发酵罐中（纳米硒的加入方式为分批次加入），在26℃～32℃培养14～36小时。

（8）包装：可以采用多种形式的包装成为高硒含量的富硒酵母产品。硒含量达到12000mg/kg，有机蛋白硒含量达到99.0%。

对比例1

1）斜面菌种培养：将耐高硒的富硒酵母菌种接种到含糖量为5～25重量％、硒（硒酸盐或亚硒酸盐）浓度为300μg/mL、pH值为4～6.5的麦芽汁固体斜面上，在26～35℃培养24～48小时。

2）一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～4环到装有100～500mL的含糖量为5～25重量％、硒（硒酸盐或亚硒酸盐）浓度为300μg/mL、pH值为4～6.5的麦芽汁专用培养瓶中，在26～35℃培养24～48小时。

3）二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖（麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物）量为5～25重量％、硒（硒酸盐或亚硒酸盐）浓度为300μg/mL、pH值为4～6.5的卡氏培养瓶中，在26～35℃培养15～48小时。

4）发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有1～15m³的含糖（麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物）量为5～25重量％、硒（硒酸盐或亚硒酸盐）浓度为300μg/mL、加1～5重量％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，在26～35℃培养18～48小时。

5）发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到15～180m³的含糖（淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物）量为5～25重量％、硒（硒酸盐或亚硒酸盐）浓度为300μg/mL、加1～5重量％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，硒分批次加入，在26～35℃培养14～36小时。

6）分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7）干燥：采用60～140℃沸腾式干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用3～6Kpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。

8）包装：可以采用多种形式的包装成为高硒含量的富硒酵母产品。硒含量达到7900mg/kg，其中有机硒含量占总硒的90.1重量％。

对比例2

1、培养基

麦芽汁为培养基中的主要碳源，添加的糖度为90g/L～110g/L，蛋白胨和酵母膏为培养基中的氮源；亚硒酸钠为培养基中的无机硒，种子培养基的初始添加量为50mg/L，发酵培养基的初始添加量为100mg/L,流加补硒的亚硒酸钠浓度为10g/L。

种子培养基按照如下方法制备：将含糖量90g/L的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和无水亚硒酸钠混合得到种子培养基，蛋白胨在种子培养基中的浓度为15g/L，酵母膏在种子培养基中的浓度为8g/L，亚硒酸钠在种子培养基中的初始添加浓度为50mg/L，该种子培养基初始pH值为5.5。

发酵培养基按照如下方法制备：将含糖量110g/L的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和无水亚硒酸钠混合得到种子培养基，蛋白胨在发酵培养基中的浓度为15g/L，酵母膏在发酵培养基中的浓度为8g/L，亚硒酸钠在发酵培养基中的初始添加浓度为100mg/L，该发酵培养基初始pH值为6。

2、富硒酵母产品

（1）斜面菌株培养

将富硒酵母S1204 CCTCC NO:M2012216 接种于含葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，琼脂20g/L，亚硒酸钠30ug/mL的斜面培养基（18*180mm试管）。28℃培养16h。

（2）摇瓶一级种子培养

吸取6mL无菌水至18*180mm的试管斜面，洗脱斜面菌株制成菌悬液（3×10⁷个/mL），然后再按2%的接种量接种至含有80mL的种子培养基的500mL摇瓶中，8层纱布封口，28℃振荡培养(220r/min)16h，得到一级种子培养液（种子液的OD600nm=50）。

（3）二级种子培养

将一级种子培养液按1%（体积百分含量）的接种量移种至含20L种子培养基的50L全自动发酵罐，28℃，pH5.5培养16h，得到摇瓶二级种子培养液（种子液的OD600nm=70）。

（4）三级种子培养

将二级种子培养液按5%（体积百分含量）的接种量移种至含250L种子培养基的500L全自动发酵罐，培养温度28℃，pH6.0，培养16h，得到摇瓶三级种子培养液（种子液的OD600nm=75）。

（5）发酵培养

将三级种子培养液按12%（体积百分含量）的接种量移种至5m³发酵罐（装液量为45%）28℃，溶氧控制50～70%，含糖量控制1.0～2.0g/100mL，pH维持5.5～6.0，发酵12h后在发酵产物中补加终浓度为200mg/L的亚硒酸钠，再发酵培养22h，发酵菌浓达到OD600nm=135，收集发酵产物。富硒酵母产品中的有机硒浓度（有机硒含量）达8899mg/kg。

应用实验

实施例3

在饲料厂生产肥育猪饲料25吨，饲粮中添加的酵母硒产品的量为40mg/kg，180头体重65kg左右的杜长大肥育猪按饲养要求分为6组，每组3个重复，每个重复10头，进行了为期45天的养殖试验。

表1 肥育猪肉品质表

指标	对照组	普通酵母硒组	对比例1	对比例2	实例1产品组	实例2产品组
							PH1	6.01	6.11	6.17	6.19	6.40	6.23
PH24	5.47	5.50	5.62	5.64	5.85	5.69
							滴水损失（%）	6.57	5.01	3.81	3.56	2.06	2.02
硒沉积量（mg/kg）	0.056	0.209	0.306	0.322	0.460	0.481

实施例4

在饲料厂生产仔猪饲料7吨，饲粮中添加的酵母硒产品的量为40mg/kg，180头体重8.3kg左右的杜长大断奶仔猪按饲养要求分为6组，每组3个重复，每个重复10头，进行了为期45天的养殖试验，主要测定了GSH-PX谷胱甘肽过氧化物酶、脱碘酶I型即碘甲腺原氨酸脱碘酶I型（IDI）

表2 仔猪肝脏酶活性

指标	对照组	普通酵母硒组	对比例1	对比例2	实例1产品组	实例2产品组
							GSH-PX(U/mg)	28.32	58.23	68.94	68.99	84.87	84.99
脱碘酶I型(nmoL/min·g)	1.21	2.48	2.55	2.62	2.87	3.14

Claims

1.一种生命结合态的有机酵母蛋白硒产品生产方法，其特征在于，包括如下步骤：在酵母发酵培养过程中分批加入纳米硒元素，通过酵母生长过程中对硒的自主吸收和转化，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合，形成蛋白硒、氨基酸硒及多糖硒，即得以生命结合态存在的有机酵母蛋白硒产品。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述纳米硒是粒径在20～100nm之间的红色单质硒。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述纳米硒添加量是120～150mg/L。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酵母发酵培养过程中，发酵培养基组份为豆粕50～80g/L、麸皮20～40g/L、麦芽汁15～40g/L和BOSAR蛋白酶0.1～0.3g/L。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述酵母菌发酵培养基组份为豆粕70g/L、麸皮30g/L、麦芽汁20g/L和BOSAR蛋白酶0.2g/L。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述酵母菌发酵培养基使用前进行以下预处理步骤：混合均匀后，在pH值为5.5～6.0、温度为50～55℃的条件下，水解5～7小时后，采用湿热法对液体培养基进行灭菌，即在121℃下，灭菌20～30min，然后冷却到常温。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酵母发酵培养过程具体包括如下步骤：

2）将扩大培养后的酵母菌按5%接种量接种到灭菌的发酵培养基中，并采用分批次的加入纳米硒，在发酵温度26℃～32℃进行发酵，将酵母发酵液喷雾干燥，即得生命结合态的有机硒, 发酵温度优选为31℃。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤2）中纳米硒添加量是120～150mg/L。

9.根据权利要求1所述方法制备而得的生命结合态有机酵母蛋白硒产品。

10.根据权利要求12所述有机酵母蛋白硒产品，其特征在于，每kg产品中含硒10000～12000mg，其中有机硒含量占总硒的99.0～99.4%。