CN109554302B - 一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养；S2固定化细胞制备；S3固定化细胞通电培养；S4发酵产酶培养；S5酶制剂分离纯化；S6循环利用。本发明利用固定化细胞技术将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌共同固定在载体颗粒中，进行混合发酵来生产饲用酶制剂，各菌株之间互利共生，产出的酶种类丰富，与单独发酵生产各酶种，然后再复配相比，能简化生产工艺，缩短生产周期，大大提高生产效率。制备的固定化细胞颗粒稳定性好，易于分离回收，可循环利用产酶，大大降低生产成本，在饲用酶制剂生产领域具有很好的应用前景。

Description

一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂生产领域，具体涉及一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法。

背景技术

饲用酶制剂是一种以酶为主要功能因子的饲料添加剂，其中酶的来源包括植物、动物和微生物等，可以通过提取获得，也可以发酵加工得来。研究表明，饲用酶制剂对动物是无毒、无害、无残留的，不会对动物产生负面影响。首先酶制剂的本质是蛋白质，进入动物消化道发挥完作用后会被分解为氨基酸和多肽，被机体吸收，不会残留；其次饲料中添加的酶制剂属于外源性酶，在结构和组成上与动物自身分泌的内源性酶存在一定差别，因此不会对动物产生影响。目前，市场上饲用酶制剂品种很多，根据酶的作用可分为消化酶和非消化酶两大类。消化酶是动物本身就能够分泌到消化系统内的酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，在饲料中添加外源酶后可以协助动物自身分泌的消化酶一道将饲料中不易消化的大分子物质分解为易被吸收的小分子物质，起到增强消化功能的作用。非消化酶是动物自身不能分泌、需要从外界获得的酶，通过添加到饲料被动物采食后，这些酶能够分解一些动物自身不能消化的物质，降解一些抗营养因子，主要有纤维素酶、植酸酶、果胶酶等。根据酶的种类数量可分为单酶制剂和复合酶制剂。动物饲料中通常含有多种营养物质，而酶具有严格的专一性和特异性，因此单酶制剂的作用效果要低于复合酶制剂。复合酶制剂通过多种酶的协同作用，来降解饲料中的各种底物，可最大限度地提高饲料中能量、蛋白质和纤维素等营养物质的利用率，从而达到提高动物增重速度和饲料利用率的目的。

饲用酶制剂作为绿色天然、安全有效的饲料添加剂，已经在水产、家禽、牲畜的养殖方面有了较为广泛的应用。在饲料中添加酶制剂，既可以提高畜禽生产性能，降低养殖成本，又可以拓宽饲料的原料范围，提高饲料的转化效率，还能降低畜禽排泄物中氮和磷的含量，改善饲养环境，在促进养殖业向资源节约型和环境友好型的方向发展中具有重要的作用。随着养殖业的发展以及人们对环境保护和食品安全的日益关注，饲用酶制剂的研发与应用日益受到重视，其在国内外市场上的需求一直保持高速增长的态势。

微生物发酵是当前饲用酶制剂的主要生产方法，与过去的直接从动植物组织器官提取相比，这种方法产量高，成本低，工艺简单，并且生产出的酶在物理和化学性质上，与动物体内自然产生存在的酶基本一致。工业生产中应用较为广泛的产酶微生物主要包括霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌和部分的放线菌。霉菌中的木霉属、曲霉属不仅拥有强大的产酶能力，而且不产生真菌毒素，因此在发酵工业中被广泛应用。芽孢杆菌具有强大的产酶系统，能够利用

多种营养物质，能分泌中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶等多种胞外酶，与植物源、动物源蛋白酶相比，芽孢杆菌蛋白酶具有良好的生物学性质，如催化效率高、作用条件温和、作用范围广、安全无毒副作用，目前在工业生产中也广泛应用。

微生物发酵的模式主要有固态发酵和液态发酵。固态发酵是指待发酵的物质在没有游离水或含水量极低的情况下利用微生物的活动进行发酵的过程，是当前最常用的发酵模式，具有技术含量低、设备要求简单，成本投入少的特点。液态发酵是指待发酵的物质在以液体为介质的情况下利用微生物的活动进行发酵的过程，相比于固态发酵，液态发酵更适合于工业化的大规模生产。固定化细胞技术是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，就是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。利用固定化细胞技术生产酶制剂具有以下优点：①保持细胞生命活力，细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快；②有利于细胞和产物酶的分离，减少酶的活力损失，酶的稳定性更高；③可循环利用发酵，省去菌种扩培操作，节省培养时间，节约原料，提高生产能力，降低生产成本。

在酶制剂的生产过程中，现有技术大多采用单一菌株发酵生产一种酶，两种以上的菌株混合发酵生产两种以上的酶制剂的方式比较少，因为不同的菌株之间容易产生拮抗，产酶机理不同，难以协同共生。然而在实际使用过程中，两种及两种以上的复合酶制剂的作用效果更好，因此通常的生产方法是先单独制备某一种酶，再将不同的酶进行复配制备成复合酶制剂。这种方法存在着生产工艺复杂、生产效率较低、生产成本高等缺陷，亟需技术改进。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法。

本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：

一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1菌株活化及扩大培养

1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3-5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×10⁷个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24-30h，分别获得这两种菌的菌悬液；

2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18-24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18-24h，分别获得这两种菌的菌悬液；

S2固定化细胞制备

称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液，与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl₂溶液中，制成直径约2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用；

S3固定化细胞通电培养

将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基的三角瓶中，在温度31-33℃、转速145-155rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理；

S4发酵产酶培养

将产酶培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%左右，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在31-33℃，转速控制在175-185rpm，通气量控制在1.2-1.4V/V/M，共培养4-6d；

S5酶制剂分离纯化

培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品；

S6循环利用

将分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，接种到新鲜产酶培养基中，按照步骤S4所述方法再次进行发酵产酶培养；当固定化细胞产酶能力衰减50%时，进行恢复培养。

步骤S2所述的混合菌悬液中，黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的体积比为2:3:3:2。

步骤S3所述的液体培养基的配方为（按1L计）：玉米粉20-26g，干酪素11-15g，（NH₄）₂SO₄ 4.4-5.0g，玉米浆8-12ml，KH₂PO₄ 2.0-2.4g，MgSO₄·7H₂O0.4-0.6g，NaCl 0.9-1.3g，柠檬酸钙0.2-0.4g，谷胱甘肽12-15mg，维生素C 6.5-7.5mg，CoCl₂·6H₂O 0.33-0.37mg，pH值自然。

步骤S3所述的间歇性施加直流电场的具体操作为：从三角瓶顶部插入惰性电极，在培养的第8h、16h、24h分别接通电源，并将电流强度调节为10mA，刺激处理10min。

步骤S4所述的产酶培养基的配方为（按1L计）：木薯渣15-18g，苹果渣15-18g，豆饼粉17-21g，麸皮4-6g，糊精4.0-4.6g，紫丁香提取液20-24ml，KNO₃ 5.3-5.7g，KH₂PO₄ 2.8-3.2g，MgSO₄·7H₂O1.2-1.4g，NaCl 0.9-1.3g，CaCl₂0.3-0.5g，柠檬酸钛3.8-4.4mg，消泡剂8-12ml，pH值为6.4-6.6。

步骤S4所述的固定化细胞颗粒的接种量为8%-10%。

步骤S6所述的恢复培养是指将回收的固定化细胞颗粒加到新鲜液体培养基中，按照步骤S3的方法进行通电培养。

步骤S6所述的恢复培养次数不超过3次。

所述紫丁香提取液的制备方法为：称取一定量的紫丁香叶加入纯净水中，紫丁香叶与纯净水的重量比为1:25，加热煮沸后保持温度80℃提取3h，然后过滤取滤液。

本发明的技术方案具有的有益效果，主要包括以下几个方面：

1）本发明利用黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶，这四种微生物都具备较强的产酶能力，并且主要产酶种类也不同，因此生产出的饲用酶制剂酶系丰富，酶活力高，与常规复合酶制剂生产方法相比，可以简化生产工艺，提高生产效率。

2）本发明利用固定化细胞技术将菌体共同固定在载体中，在发酵过程中，发酵液中几乎没有游离菌体，发酵液粘度小，传质容易，酶的产量更高；发酵结束后，固定化细胞与产物酶的分离十分容易，无需复杂工艺，可以减少酶活力的损失；制得的固定化细胞可以在较长时间内保持稳定性，因此可循环利用发酵，省去前期扩培操作，节省培养时间，节约原料，降低生产成本。

3）本发明采用的固定化细胞通电培养方法具有促进微生物细胞增殖，提高微生物代谢能力的作用，在制备好固定化细胞颗粒后首次进行通电培养，可以最大限度的提高微生物细胞代谢能力，从而提高产酶能力；在多次循环利用后，固定化细胞产酶能力衰减约50%时进行通电培养，可以使微生物细胞再次增殖，使得固定化细胞的产酶能力得到一定程度的恢复，延长固定化细胞的使用寿命。

附图说明

图1海藻酸钠溶液浓度对产酶的影响；

图2固定化细胞颗粒直径对产酶的影响；

图3接种量对产酶的影响；

图4温度对产酶的影响；

图5转速对产酶的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

1、实施例中使用的菌株

黑曲霉（Aspergillus niger），保藏编号为BNCC186380，康氏木霉（Trichoderma koningii Oudem），保藏编号为BNCC115651，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏编号为BNCC189983，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），保藏编号为BNCC185324，均购于苏州北纳创联生物技术有限公司。

2、实施例中酶活力的测定方法

1）粗酶液的制备：培养结束后，取发酵液过滤分离出的滤液，于5000r/min离心20min，得到的上清液即为粗酶液。

2）羧甲基纤维素酶：取0.5mL粗酶液，与1.5mL1%的CMC-Na与柠檬酸缓冲液（pH5.0）混合，在50℃水浴下反应30min，反应后采用DNS法测定酶解产生的还原糖。将上述条件下的每小时由底物生成1μmol的葡萄糖所需酶的用量定义为一个酶活力单位U。

3）α-淀粉酶：将2.0mL粗酶液与2.0mL柠檬酸缓冲液（pH5.5）混合，加入1%淀粉溶液2.0mL，摇匀后在40℃水浴加热5min，然后加入4.0mL 0.4M的NaOH溶液终止反应，取反应后的溶液2.0mL，与2.0mLDNS溶液混合，沸水浴加热5min然后在560nm下测定其吸光值。将上述条件下的每小时由底物生成1μmol的葡萄糖所需酶的用量定义为一个酶活力单位U。

4）蛋白酶：取1.0mL粗酶液，与0.5mL1%的酪氨酸溶液混合，40℃水浴加热10min，然后加入3.0mL0.4M的三氯乙酸溶液终止反应，3000r/min离心5min，收集上清液，取1.0mL上清液与5.0mL0.4MNa₂CO₃溶液、0.5mLFolin试剂混合，40℃水浴加热20min，在650nm下测定其吸光值。将上述条件下的每小时由底物生成1μmol的酪氨酸所需酶的用量定义为一个酶活力单位U。

实施例1

按照本发明提供的利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的技术方案进行试验，步骤如下：

S1菌株活化及扩大培养

1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3-5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×10⁷个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24-30h，分别获得这两种菌的菌悬液；

2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18-24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18-24h，分别获得这两种菌的菌悬液。

S2固定化细胞制备

称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液（体积比为2:3:3:2），与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl₂溶液中，制成直径约 2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用。

S3固定化细胞通电培养

将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基（液体培养基的配方为（按1L计）：玉米粉23g，干酪素13g，（NH₄）₂SO₄ 4.7g，玉米浆10ml，KH₂PO₄ 2.2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NaCl 1.1g，柠檬酸钙0.3g，谷胱甘肽13.5mg，维生素C 7.0mg，CoCl₂·6H₂O 0.35mg，pH值自然）的三角瓶中，在温度32℃、转速150rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理，具体操作方法为：从三角瓶顶部插入惰性电极，在培养的第8h、16h、24h分别接通电源，并将电流强度调节为10mA，刺激处理10min。

S4发酵产酶培养

将产酶培养基（产酶培养基的配方为（按1L计）：木薯渣16.5g，苹果渣16.5g，豆饼粉19g，麸皮5g，糊精4.3g，紫丁香提取液22ml，KNO₃ 5.5g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O1.3g，NaCl 1.1g，CaCl₂ 0.4g，柠檬酸钛4.1mg，消泡剂10ml，pH值为6.5）装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，接种量为9%，培养期间温度控制在32℃，转速控制在180rpm，通气量控制在1.3V/V/M，一共培养5d。其中紫丁香提取液的制备方法为：称取一定量的紫丁香叶加入纯净水中，紫丁香叶与纯净水的重量比为1:25，加热煮沸后保持温度80℃提取3h，然后过滤取滤液。

S5酶制剂分离纯化

培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品。

实施例2 海藻酸钠溶液浓度对产酶的影响

按照实施例1的方法，将步骤S2中采用的海藻酸钠溶液浓度设置为2%、4%、6%、8%、10%，其它操作相同，发酵产酶培养结束后制备粗酶液，测定羧甲基纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶这三种具有代表性的酶的活力，结果如图1所示。结果表明，海藻酸钠溶液浓度过高会导致载体孔隙度减少，从而影响酶分子从载体中扩散到发酵液中，而浓度过低会降低载体强度，载体在剪切力的作用下容易破碎，使菌体游离在发酵液中，影响产酶效果，也达不到固定化细胞的作用，因此海藻酸钠溶液浓度以6%为宜。

实施例3 固定化细胞颗粒直径对产酶的影响

按照实施例1的方法，采用不同型号的注射器针头将步骤S2中的固定化细胞颗粒制备成直径为0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm，其它操作相同，发酵产酶培养结束后制备粗酶液，测定酶活力，结果如图2所示。结果表明，固定化细胞颗粒的直径对固定化细胞产酶有明显影响，当颗粒直径越小，酶活力越高，但同时发现当颗粒直径小于2mm时，在后续循环使用时，酶活力与颗粒的机械稳定性都下降较快，而当颗粒直径为2mm时，既能保持酶活力，又具有一定的机械稳定性，因此固定化细胞颗粒直径以2mm为宜。

实施例4 接种量对产酶的影响

按照实施例1的方法，将步骤S4中固定化细胞颗粒的接种量设置为3%、6%、9%、12%、15%，其它操作相同，发酵产酶培养结束后制备粗酶液，测定酶活力，结果如图3所示。结果表明，当接种量较小时，酶活力较低，主要是由于菌体数量不足导致产酶量较少，当接种量过大时，酶活力同样会降低，主要是由于菌体数量过多，前期会消耗大量营养物质进行生长繁殖，导致后期营养物质不足，从而影响产酶，因此接种量以9%为宜。

实施例5 温度对产酶的影响

按照实施例1的方法，将步骤S4中温度设置为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，其它操作相同，发酵产酶培养结束后制备粗酶液，测定酶活力，结果如图4所示。结果表明，温度对产酶有明显影响，当温度偏低时，菌体生长缓慢，酶活力较低，当温度过高时，菌体容易过早老化，酶活力也明显降低，因此温度以32℃为宜。

实施例6 转速对产酶的影响

按照实施例1的方法，将步骤S4中转速设置为120rpm、150rpm、180rpm、210rpm、240rpm，其它操作相同，发酵产酶培养结束后制备粗酶液，测定酶活力，结果如图5所示。结果表明，当转速偏低时，发酵液中溶解氧量不够，而且营养物质不能充分与菌体接触，导致菌体生长较慢，酶活力较低，当转速过快时，酶活力也会下降，可能是因为固定化细胞颗粒受到过大剪切力作用从而发生破碎，菌体游离在发酵液中发生机械损伤，从而不利于酶的合成，影响酶的活力，因此转速以180rpm为宜。

实施例7通电培养方式对产酶的影响

按照实施例1的方法，在固定化细胞制备好后进行通电培养，方式1为实施例1中的间歇性施加直流电场；方式2为恒定施加直流电场，即插入惰性电极后，在培养的第8h开始接通电源，将电流强度调节为10mA，一直进行刺激处理，直到培养结束；对照组为不进行通电培养；将方式1、方式2和对照组的固定化细胞颗粒接种后进行发酵产酶培养，培养结束后制备粗酶液，测定酶活力，结果如表1所示。结果表明，与对照组相比，按照方式1的方法进行通电培养，然后进行产酶培养，羧甲基纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶活力都有显著提高；而按照方式2的方法进行通电培养，然后进行产酶培养，羧甲基纤维素酶和α-淀粉酶和蛋白酶活力没有显著提高，甚至有的还略有下降。本试验发现间歇性施加直流电场刺激具有促进微生物细胞增殖，提高微生物代谢能力的作用，对提高微生物产酶能力有积极效果，而恒定施加直流电场刺激，则没有起到显著效果。一般认为直流电场刺激可能会改变微生物细胞膜的通透性，但如果刺激时间过长，可能会对微生物细胞造成损伤，反而不利于微生物细胞的生长代谢。

实施例8 固定化细胞的循环利用

将实施例1中分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，进行循环利用，操作方法为：按照实施例1中的配方制备新鲜的产酶培养基装入发酵罐中，装液量为60%，灭菌后按照9%的接种量接入回收的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在32℃，转速控制在180rpm，通气量控制在1.3V/V/M，培养5d，培养结束后将分离出的固定化细胞颗粒洗净回收，再次进行发酵产酶培养，如此循环利用60次，每隔20次取发酵液分离后的滤液制备粗酶液，测定酶活力，结果如表2所示。结果表明，循环利用60次后，羧甲基纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶的活力分别是首次培养的48.7%、53.4%、51.5%，说明固定化细胞产酶能力衰减了约50%。

实施例9 固定化细胞的恢复培养

根据实施例8的结果，固定化细胞循环利用60次后，将此时的固定化细胞颗粒回收后加到新鲜液体培养基中，在温度32℃、转速150rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理，操作方法与实施例1中相同，然后将处理后的固定化细胞颗粒接种到新鲜的产酶培养基中，进行产酶培养，培养结束后制备粗酶液，测定酶活力分别为羧甲基纤维素酶2943U/ml，α-淀粉酶1825U/ml，蛋白酶2142U/ml，说明固定化细胞的产酶能力得到了一定程度的恢复。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1菌株活化及扩大培养

1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3-5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×10⁷个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24-30h，分别获得这两种菌的菌悬液；

2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18-24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18-24h，分别获得这两种菌的菌悬液；

S2固定化细胞制备

称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液，与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl₂溶液中，制成直径约 2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用；所述的混合菌悬液中，黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的体积比为2:3:3:2；

S3固定化细胞通电培养

将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基的三角瓶中，在温度31-33℃、转速145-155rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理；所述的间歇性施加直流电场的具体操作为：从三角瓶顶部插入惰性电极，在培养的第8h、16h、24h分别接通电源，并将电流强度调节为10mA，刺激处理10min；

S4发酵产酶培养

将产酶培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%左右，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在31-33℃，转速控制在175-185rpm，通气量控制在1.2-1.4V/V/M，共培养4-6d；所述的产酶培养基的配方按1L计为：木薯渣15-18g，苹果渣15-18g，豆饼粉17-21g，麸皮4-6g，糊精4.0-4.6g，紫丁香提取液20-24ml，KNO₃ 5.3-5.7g，KH₂PO₄ 2.8-3.2g，MgSO₄·7H₂O1.2-1.4g，NaCl 0.9-1.3g，CaCl₂0.3-0.5g，柠檬酸钛3.8-4.4mg，消泡剂8-12ml，pH值为6.4-6.6；

S5酶制剂分离纯化

培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品；

S6循环利用

将分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，接种到新鲜产酶培养基中，按照步骤S4所述方法再次进行发酵产酶培养；当固定化细胞产酶能力衰减50%时，进行恢复培养；所述的恢复培养是指将回收的固定化细胞颗粒加到新鲜液体培养基中，按照步骤S3的方法进行通电培养；

黑曲霉保藏编号为BNCC186380，康氏木霉保藏编号为BNCC115651，枯草芽孢杆菌，保藏编号为BNCC189983，纳豆芽孢杆菌保藏编号为BNCC185324，均购于苏州北纳创联生物技术有限公司。

2.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，步骤S3所述的液体培养基的配方按1L计为：玉米粉20-26g，干酪素11-15g，（NH₄）₂SO₄ 4.4-5.0g，玉米浆8-12ml，KH₂PO₄ 2.0-2.4g，MgSO₄·7H₂O0.4-0.6g，NaCl 0.9-1.3g，柠檬酸钙0.2-0.4g，谷胱甘肽12-15mg，维生素C 6.5-7.5mg，CoCl₂·6H₂O 0.33-0.37mg，pH值自然。

3.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，步骤S4所述的固定化细胞颗粒的接种量为8%-10%。

4.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，步骤S6所述的恢复培养次数不超过3次。

5.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，所述紫丁香提取液的制备方法为：称取一定量的紫丁香叶加入纯净水中，紫丁香叶与纯净水的重量比为1:25，加热煮沸后保持温度80℃提取3h，然后过滤取滤液。

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