CN111057701A - 一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，包括如下步骤：（1）种子液制备；（2）载体的预处理：用碱液对陶粒载体进行改性；（3）固定化细胞制备：将载体装填于固定床反应器，将菌体细胞通过吸附作用固定于载体上；（4）预培养：用发酵培养基对固定化细胞进行培养30~40h；（5）连续发酵培养：将发酵培养基以一定的稀释率流入固定床反应器中进行连续发酵。本发明采用碱改性载体对芽孢杆菌进行固定，具有成本低、性质稳定、无毒性、吸附效果好的优点。本发明利用固定化细胞技术结合连续发酵工艺实现了持续不断高强度生产中性植酸酶的目的，大大提高了发酵效率和植酸酶产率，有利于工业化的生产。

Description

一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程以及酶工程领域，具体涉及一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法。
背景技术
磷作为动物机体内含量丰富的一种矿物质元素，与生命活动息息相关，主要参与骨骼以及肌肉的组成和生长。动物机体内的磷主要由饲料提供，而饲料中磷主要是以植酸磷或植酸盐的形式存在。植酸是一种抗营养因子，因其特殊结构与理化特性，具有很强的螯合作用。植酸会与锌、铁、铜、锰、钾、钠、镁、钙等形成稳定的络合物，降低饲料中矿物质元素的消化利用率。植酸还会与蛋白质形成植酸盐-蛋白质二元复合物，使蛋白质沉淀，影响饲料中蛋白质的消化率，同时还会抑制动物机体内消化酶的活性。
植酸酶是对可水解植酸磷释放磷酸基团形成肌醇衍生物的一类酶的总称，属于磷酸单脂水解酶，能水解植酸最终释放出无机磷。植酸酶在饲料、食品、环境和医药等领域有着广泛应用。首先植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用到猪、家禽饲料中。国内外大量的实验都证明，在饲料中添加植酸酶，可有效分解存在于饲料中的植酸，释放无机磷，提高饲料中植酸磷的利用率，降低粪便中磷的排放量，减少环境污染。同时因为解除了植酸的抗营养作用，所以植酸酶的添加可以提高单胃动物对淀粉、脂肪和蛋白质等营养物质的利用率，还能释放被植酸鳌合的各种矿物元素，从而促进动物健康快速的生长。其次植酸酶可以作为土壤改良剂。对农作物而言，磷是一种基本营养元素，土壤中30%~80% 的磷是以有机磷的形式存在，有机磷中植酸磷占了约50%，能被植物利用的非常少。通过在植物生长环境中引入产植酸酶菌株或者直接添加植酸酶，可高效水解土壤中的植酸磷，促进土壤中的稳定有机磷向活性有机磷转化，从而可增强植物对植酸磷的利用。第三植酸酶可以作为食品添加剂。许多主要的食品原料，如豆类、谷物和油料作物中抗营养因子——植酸的含量很高，由其加工的食品中植酸的含量也很高。而在人的小肠中，植酸酶活性极低，难以利用植酸盐。所以在一些食品中添加植酸酶是必要的，可提高其营养价值。因此植酸酶作为一种新型的食品添加剂也必将有很好的应用前景。此外，植酸酶还能应用在许多新兴的工业上，例如，在造纸业中植酸酶可作为添加剂，提高纸张的质量，减少污染；植酸酶还可以和木聚糖酶一起形成多酶体系应用在纸浆的制造业。
植酸酶在自然界分布很广泛，存在于动物、植物和微生物中。由于来源于微生物的植酸酶作用范围和稳定性较好，易规模化生产，近几年的研究大都集中在微生物生产植酸酶。目前生产植酸酶应用最多的为丝状真菌，如黑曲霉、米曲霉、根霉等。这些真菌产生的植酸酶为酸性植酸酶，其最适温度在53~70℃，最适pH范围在2.0~6.0之间，适用于胃pH值呈酸性的单胃动物，如猪和鸡、鸭等家禽。中性植酸酶主要来源于芽孢杆菌，芽孢杆菌植酸酶不仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒过程中高温引起的酶失活，而且其酶促反应的pH值有效作用范围在6.5~7.5之间，更适用于消化道为中性的鲤科鱼类和畜禽肠道部位。因此中性植酸酶可以有效弥补酸性植酸酶的不足，在水产养殖业中具有更广泛的应用。
固定化细胞技术是 20 世纪 70 年代兴起的一种新型生物技术，是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。固定化细胞不仅保持了细胞的生命活动能力、可反复连续进行发酵，有利于提高发酵效率和生产能力，而且反应快、节省养料及有利于产物分离纯化。更重要的是发酵过程中底物和产物可同时进出，避免反馈抑制和产物的消耗。由于固定化细胞技术具有诸多优势，而因此在发酵工业、食品工业、环境保护、生物制药、化工及能源等领域都有着巨大的应用前景。细胞固定化的成功，以及在连续使用中细胞的稳定性，主要取决于合适载体和合适细胞固定化方法的选择。细胞固定化方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价法等，其中，载体吸附法通过物理吸附、化学或离子结合的方式将微生物细胞吸附到载体表面，具有成本较低，操作简单，对细胞的活性影响较小，放大规模化生产简便等优势。在载体选择上，无机载体机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长，是一类重要的固定化细胞载体材料。无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应将微生物固定；同时还可以容纳不断增殖的微生物，使载体具有较高的细胞容量。
目前植酸酶的工业化生产主要采用游离细胞分批发酵或补料发酵的方法，存在着生产成本高、劳动强度大、设备利用率低、产酶效率不高等问题，而关于利用固定化细胞技术发酵生产植酸酶的研究，在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用固定化芽孢杆菌连续发酵生产中性植酸酶的方法。
本发明的技术方案为：
一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）种子液制备：以巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）为出发菌株，经过活化后接种于种子培养基中，在温度37℃、转速160~200r/min的条件下培养至对数生长期；
（2）载体的预处理：将陶粒投入1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，在150r/min振荡吸附30min，再静置24h，使用蒸馏水冲洗载体至冲洗液pH呈中性，105℃干燥2h，制得碱改性陶粒载体；
（3）固定化细胞制备：将上述载体以25%~35%的装填量装填于固定床反应器床层，将种子液加入固定床反应器中进行循环流动，使菌体细胞充分接触载体而被吸附固定；固定结束后，放出废液；
（4）预培养：将发酵培养基加入固定床反应器中，以1.0~2.0L/h的流速进行循环流动培养，培养时间为30~40h，然后放出反应器中的培养液；
（5）连续发酵培养：将新鲜发酵培养基以一定的稀释率流入固定床反应器中进行连续发酵，同时流出的发酵醪液由收集罐收集，再经过3000~4000r/min离心处理10~15min，取上清液得到中性植酸酶粗酶液。
步骤（1）中，所述活化的方法为：将菌株划线接种于LB斜面培养基上，在37℃恒温培养36~48h。
步骤（1）中，所述种子培养基的成分为：10~20g/L葡萄糖，10~20g/L蛋白胨，3~5g/L酵母浸膏，4~6g/L氯化钠，1.5~2.5g/L氯化钙，0.3~0.5g/L硫酸镁，0.1~0.3g/L磷酸二氢钾，0.02~0.04g/L硫酸亚铁，pH6.5~7.5。
步骤（2）中，所述陶粒的直径为2~3mm，陶粒与氢氧化钠溶液的料液比为1g:5mL。
步骤（3）中，所述种子液的循环流速为2.0~3.0L/h。
步骤（3）中，所述的固定结束是指种子液中的菌体细胞浓度保持稳定，几乎不再下降。
步骤（4）和（5）中，所述发酵培养基的成分为：30~40g/L麸皮，4~6g/L葡萄糖，10~20g/L豆饼粉，6~8g/L硫酸铵，2~3g/L植酸钠，5~7g/L氯化钠，1.5~2.5g/L氯化钙，0.1~0.2g/L磷酸二氢钾，0.2~0.4g/L硫酸镁，0.02~0.04g/L硫酸亚铁，45~55μmol/L H2O2，5~10g/L正十二烷，pH6.5~7.5。
步骤（4）中，预培养的温度为36~38℃，通气量为1.6~2.0vvm。
步骤（5）中，连续发酵培养的温度为34~36℃，通气量为1.8~2.2vvm，稀释率为0.05~0.07h-1。
本发明的有益效果是：
1、本发明选择具有多空结构的陶粒作为载体材料，并利用碱液对陶粒进行改性，使孔洞的有效孔径拓宽，比表面积增加，提高其对菌体细胞的吸附能力，避免了菌体细胞在连续发酵过程中的流失现象，从而提高固定化细胞在发酵过程中的稳定性，使产酶效率保持相对恒定。
2、本发明利用固定化细胞技术实现了中性植酸酶的连续发酵，并通过对发酵培养基成分以及连续发酵过程参数的优化，有效提高了中性植酸酶的活力。本发明的固定化细胞能够稳定地用于连续发酵，并在连续发酵中保持较高的产酶效率，在一个实施例中连续发酵240h的酶活力保持在19000U/mL左右。
3、本发明与传统的植酸酶间歇发酵工艺相比，可简化菌种制备过程，降低生产成本，提高发酵设备的利用率，大幅度节约非生产时间，实现整个过程连续化，极大地提高发酵效率。
附图说明
图1为植酸钠浓度对发酵产酶的影响；
图2为H2O2浓度对发酵产酶的影响；
图3为培养温度对发酵产酶的影响；
图4为通气量对发酵产酶的影响；
图5为稀释率对发酵产酶的影响；
图6为连续发酵时间曲线。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）菌株购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC 01737。
实施例中植酸酶活力按照以下方法测定：
采用偏钒酸铵法，取粗酶液稀释10倍，取稀释液0.1mL加入pH为7.5的Tris-HCl缓冲液1.9mL和2mmol/L植酸钠溶液4mL，在55℃反应30min，再加入反应终止液4mL，显色10min，4000r/min离心10min后，于415nm波长处测OD值，参照定磷标准曲线计算酶活。对照组为先加入反应终止液，再加入植酸钠溶液。
酶活单位（U）：在55℃，pH7.5的条件下，每分钟从浓度为2mmol/L的底物植酸钠中释放出1mmol的无机磷所需要的酶量为1个酶活单位。
实施例1 无机载体的选择
（1）种子液制备：将巨大芽孢杆菌菌株划线接种于LB斜面培养基上，在37℃恒温培养36~48h，然后接种于种子培养基中，在温度37℃、转速180r/min的条件下培养至对数生长期；种子培养基的成分为：15g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨，4g/L酵母浸膏，5g/L氯化钠，2g/L氯化钙，0.4g/L硫酸镁，0.2g/L磷酸二氢钾，0.03g/L硫酸亚铁，pH7.0。
（2）载体的预处理：选择直径为2~3mm的粉煤灰、活性炭、沸石和陶粒作为载体，用蒸馏水清洗后105℃干燥2h；将陶粒投入1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，陶粒与氢氧化钠溶液的料液比为1g:5mL，在150r/min振荡吸附30min，再静置24h，使用蒸馏水冲洗载体至冲洗液pH呈中性，105℃干燥2h，制得碱改性陶粒载体。
（3）固定化细胞制备：将上述不同无机载体分别以30%的装填量装填于固定床反应器床层，将种子液加入固定床反应器中进行循环流动，循环流速为2.5L/h，使菌体细胞充分接触载体而被吸附固定；固定结束后即种子液中的菌体细胞浓度几乎不再下降时，放出废液。分别计算使用不同无机载体时的细胞固定效率，结果见表1。
细胞固定效率（%）=（固定前种子液细胞浓度-固定后种子液细胞浓度）/固定前种子液细胞浓度×100%。
Figure 241574DEST_PATH_IMAGE001
由表1可见，使用碱改性陶粒作为载体对游离细胞的固定效果最好，细胞固定效率达到85.7%，其次是使用陶粒作为载体，细胞固定效率为66.5%。陶粒内部呈细密蜂窝状微孔结构，本身就具有较强的微生物吸附能力，利用碱液对陶粒进行改性，可以置换陶粒孔道中原有的半径大的阳离子，使孔洞的有效孔径拓宽，增加比表面积，从而影响陶粒的离子交换和吸附吸能，增加吸附活性中心，因此能进一步提高其对菌体细胞的固定效率。
实施例2
按照实施例1中的方法，选择碱改性陶粒作为载体制备固定化细胞，然后按照以下步骤进行连续发酵培养：
（1）预培养：将发酵培养基加入固定床反应器中，以1.5L/h的流速进行循环流动培养，培养时间为36h，温度为37℃，通气量为1.8vvm，然后放出反应器中的培养液；发酵培养基的成分为：35g/L麸皮，5g/L葡萄糖，15g/L豆饼粉，7g/L硫酸铵，2.5g/L植酸钠，6g/L氯化钠，2g/L氯化钙，0.15g/L磷酸二氢钾，0.3g/L硫酸镁，0.03g/L硫酸亚铁，50μmol/L H2O2，7.5g/L正十二烷，pH7.0。
（2）连续发酵培养：将新鲜发酵培养基以0.06h-1的稀释率流入固定床反应器中进行连续发酵培养72h，培养温度为35℃，通气量为2.0vvm，同时流出的发酵醪液由收集罐收集，再经过3500r/min离心处理10min，取上清液得到中性植酸酶粗酶液。
发酵培养基成分的优化
2.1植酸钠浓度对发酵产酶的影响 在发酵培养基中分别添加0、0.5g/L、1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L的植酸钠，连续发酵培养后分别测定植酸酶粗酶液的酶活，结果如图1所示。
由图1可见，在0~2.5g/L浓度范围内，植酸酶活力随着植酸钠浓度的增加而显著升高，在2.5~4.5g/L浓度范围内，植酸酶活力略有升高，但变化不明显，因此可以选择2.5g/L作为植酸钠的最佳浓度，在此浓度下，植酸酶活力达到了19328U/mL。植酸钠是植酸酶的直接目标底物，因此在培养基中添加适量植酸钠对巨大芽孢杆菌产酶具有诱导作用。
2.2 H2O2浓度对发酵产酶的影响 在发酵培养基中分别添加0、25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、125μmol/L的 H2O2，连续发酵培养后分别测定植酸酶粗酶液的酶活，结果如图2所示。
由图2可见，当H2O2浓度为50μmol/L时，植酸酶活力为19650U/mL，达到最大值，比不添加H2O2时的酶活力（15336U/mL）提高了28%。一方面H2O2可以在过氧化氢酶的催化下分解放出氧气，从而提高发酵液中的溶解氧浓度，促进巨大芽孢杆菌菌体生长；另一方面H2O2还可能改变菌体的代谢途径，从而影响菌体产酶。
发酵条件的优化
2.3培养温度对发酵产酶的影响 将培养温度设置为29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃，在这些培养温度下分别进行连续发酵培养，然后测定植酸酶粗酶液的酶活，结果如图3所示。
由图3可见，当培养温度为35℃时，植酸酶活力为19584U/mL，达到最大值。巨大芽孢杆菌的最适生长温度在37℃，但通常情况下菌体的最佳产酶温度与最适生长温度不同，从实验可以看出，35℃是巨大芽孢杆菌的最佳产酶温度。
2.4通气量对发酵产酶的影响 将通气量分别设置为1.4vvm、1.6vvm、1.8vvm、2.0vvm、2.2vvm，在这些通气量下分别进行连续发酵培养，然后测定植酸酶粗酶液的酶活，结果如图4所示。
由图4可见，当通气量为2.0vvm时，植酸酶活力为19775U/mL，达到最大值。巨大芽孢杆菌是好氧微生物，菌体生长代谢是需氧的过程，因此通气量对植酸酶活力有很大影响，较大的通气量对巨大芽孢杆菌发酵产酶更有利。
2.5稀释率对发酵产酶的影响 将稀释率设置为0.02h-1、0.04h-1、0.06h-1、0.08h-1、0.10h-1，在这些稀释率下分别进行连续发酵培养，然后测定植酸酶粗酶液的酶活，结果如图5所示。
稀释率是连续发酵过程中的重要参数，由图5可见，当稀释率为0.06h-1时，植酸酶活力为19472U/mL，达到最大值；当稀释率小于0.06h-1时，新鲜培养基的加入使发酵液中的营养总是维持在饱和的水平，虽然能刺激菌体的大量生长，但在一定程度上会抑制植酸酶的合成；当稀释率大于0.06h-1时，植酸酶活力下降很快，这可能是由于稀释率过高，导致发酵液在反应器中的停留时间较短，菌体细胞不能及时地利用培养基中的营养物质并合成酶。
实施例3
一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，包括如下步骤：
（1）种子液制备：将巨大芽孢杆菌菌株划线接种于LB斜面培养基上，在37℃恒温培养36~48h，然后接种于种子培养基中，在温度37℃、转速180r/min的条件下培养至对数生长期；种子培养基的成分为：15g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨，4g/L酵母浸膏，5g/L氯化钠，2g/L氯化钙，0.4g/L硫酸镁，0.2g/L磷酸二氢钾，0.03g/L硫酸亚铁，pH7.0。
（2）载体的预处理：将直径为2~3mm的陶粒投入1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，陶粒与氢氧化钠溶液的料液比为1g:5mL，在150r/min振荡吸附30min，再静置24h，使用蒸馏水冲洗载体至冲洗液pH呈中性，105℃干燥2h，制得碱改性陶粒载体。
（3）固定化细胞制备：将上述载体以30%的装填量装填于固定床反应器床层，将种子液加入固定床反应器中进行循环流动，循环流速为2.5L/h，使菌体细胞充分接触载体而被固定；固定结束后放出废液。
（4）预培养：将发酵培养基加入固定床反应器中，以1.5L/h的流速进行循环流动培养，培养时间为36h，温度为37℃，通气量为1.8vvm，然后放出反应器中的培养液；发酵培养基的成分为：35g/L麸皮，5g/L葡萄糖，15g/L豆饼粉，7g/L硫酸铵，2.5g/L植酸钠，6g/L氯化钠，2g/L氯化钙，0.15g/L磷酸二氢钾，0.3g/L硫酸镁，0.03g/L硫酸亚铁，50μmol/L H2O2，7.5g/L正十二烷，pH7.0。
（5）连续发酵培养：将新鲜发酵培养基以0.06h-1的稀释率流入固定床反应器中进行连续发酵培养240h，培养温度为35℃，通气量为2.0vvm，每隔24h对流出的发酵醪液进行取样，测定植酸酶活力，得到如图6所示的连续发酵时间曲线。
由图6可知，在连续发酵培养72h~240h时间内，植酸酶活力能够稳定保持在19000U/mL左右，说明固定化细胞能够稳定地用于连续生产中性植酸酶，并在连续化操作中保持恒定的产酶效率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）种子液制备：以巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）为出发菌株，经过活化后接种于种子培养基中，在温度37℃、转速160~200r/min的条件下培养至对数生长期；
（2）载体的预处理：将陶粒投入1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，在150r/min振荡吸附30min，再静置24h，使用蒸馏水冲洗载体至冲洗液pH呈中性，105℃干燥2h，制得碱改性陶粒载体；
（3）固定化细胞制备：将上述载体以25%~35%的装填量装填于固定床反应器床层，将种子液加入固定床反应器中进行循环流动，使菌体细胞充分接触载体而被吸附固定；固定结束后，放出废液；
（4）预培养：将发酵培养基加入固定床反应器中，以1.0~2.0L/h的流速进行循环流动培养，培养时间为30~40h，然后放出反应器中的培养液；
（5）连续发酵培养：将新鲜发酵培养基以一定的稀释率流入固定床反应器中进行连续发酵，同时流出的发酵醪液由收集罐收集，再经过3000~4000r/min离心处理10~15min，取上清液得到中性植酸酶粗酶液。
2.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述活化的方法为：将菌株划线接种于LB斜面培养基上，在37℃恒温培养36~48h。
3.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基的成分为：10~20g/L葡萄糖，10~20g/L蛋白胨，3~5g/L酵母浸膏，4~6g/L氯化钠，1.5~2.5g/L氯化钙，0.3~0.5g/L硫酸镁，0.1~0.3g/L磷酸二氢钾，0.02~0.04g/L硫酸亚铁，pH6.5~7.5。
4.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述陶粒的直径为2~3mm，陶粒与氢氧化钠溶液的料液比为1g:5mL。
5.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述种子液的循环流速为2.0~3.0L/h。
6.根据权利要求1所述的一种利用固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的固定结束是指种子液中的菌体细胞浓度保持稳定，几乎不再下降。
7.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（4）和（5）中，所述发酵培养基的成分为：30~40g/L麸皮，4~6g/L葡萄糖，10~20g/L豆饼粉，6~8g/L硫酸铵，2~3g/L植酸钠，5~7g/L氯化钠，1.5~2.5g/L氯化钙，0.1~0.2g/L磷酸二氢钾，0.2~0.4g/L硫酸镁，0.02~0.04g/L硫酸亚铁，45~55μmol/L H2O2，5~10g/L正十二烷，pH6.5~7.5。
8.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（4）中，预培养的温度为36~38℃，通气量为1.6~2.0vvm。
9.根据权利要求1所述的一种利用固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（5）中，连续发酵培养的温度为34~36℃，通气量为1.8~2.2vvm，稀释率为0.05~0.07h-1。
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