CN1303921A - 连续发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过蛋白－产生微生物生产蛋白的连续方法,该方法中所述微生物任选地固定化在固体载体上和/或微生物生长和蛋白最佳化生产所需的营养和其它试剂分别以恒定的稀释速率进料到反应器中。而且,本发明还涉及使用发酵设备生产蛋白的方法。

Description

连续发酵方法
本发明涉及一种生产蛋白的连续方法。
根据本发明，发现连续发酵过程中使用的培养基的分解能够用来研究对微生物的生长和代谢物-生产的影响并由此确定发酵过程的最适条件。连续输送的发酵培养基通常被分成如其所含成分一样多的部分。这些成分的例子是碳源、氮源、磷源和硫源，还有维生素和复杂的底物如玉米浆、酵母提取物和其它天然产物。而且，每一种所需的无机物、微量或痕量元素能以水溶性盐(如氯化物、硫酸盐或硝酸盐)的溶液形式分别提供。如果在分别进料的溶液或发酵培养基中所需用量的成分是(水)-溶解的并不发生相互干扰作用(例如，沉淀、反应)，以这种方式可获得具有任何所需组成的发酵培养基。
一方面，本发明涉及一种通过蛋白-产生微生物生产蛋白的连续方法。
更特别地是，本发明涉及通过蛋白-生产微生物生产蛋白的连续方法，在该连续方法中微生物任选地被固定化在固体载体上和/或微生物生长和蛋白最佳化生产所需的营养成分和其它试剂以恒定的稀释速率被分别进料到反应器中。
优选的一个方面，本发明涉及使用一种发酵设备来生产蛋白的方法，该发酵设备包括：一个适合于进行涉及活细胞或灭活细胞的反应的容器；至少两个与所述容器相连的用于补加液体的贮料瓶和将所述液体从所述贮料瓶输送到所述容器的装置；监测所述贮料瓶中的内容物补加到所述容器中的独立的装置；与所述容器相连的收集瓶和将发酵液从所述容器输送到所述收集瓶的装置；和通过改变从所述贮料瓶向所述容器分别补加液体的速率来控制和维持所述容器内的恒定稀释速率的装置。
任何传统的发酵容器都可被用来实现本发明的目的。该容器可由如不锈钢、玻璃或陶瓷这样的材料制成并且可具有例如，从100ml至2500m3的体积，尽管这些数值并不是本发明的关键，为了连续操作，容器的内部任选地配备有例如，吸收固定化细胞的子层托或筛板。并且，发酵容器连接着一系列装有营养液和用于保持和控制发酵液中的理想PH值以及其它参数(如泡沫形成、氧化还原电位等)的溶液的贮料瓶。根据发酵的特殊需要，可以设置分离的贮料瓶用于分别补加作为活细胞所需的碳源或氮源或矿物质源的底物。
根据本发明，发现发酵容器中的恒定稀释速率对操作是有利的。如本文所用，术语“稀释速率”表示每小时[h-1]、每单位体积的发酵容器补加液体的总体积。
因此，在发酵过程中，当各种营养成分或其它添加剂的补加发生变化时，在发酵容器中以恒定的稀释速率进行发酵过程是本发明一个特有的特征。为了顺利完成这一任务，任选地提供装有惰性成分，例如水的贮料瓶。以便补足液体的补加量而保持液体的总补加量恒定。
优选地用来实施本发明方法的设备进一步包括从贮料瓶到发酵容器输送各种发酵培养基组分的装置，和监测补加到发酵容器的液体量的装置。每一套测量仪器(例如，通过重量分析的、测定风速的、磁力的、超声波的、文丘里的、J、交叉-关系、热量的、Coriolis或辐射测量的体积或质量流速)和传输装置(例如，泵或压力差)都可用于此目的。另外，每一传输装置可被用作定量装置(例如，齿轮、蠕动、活塞、膜或偏心泵)。对于小规模的操作，可通过称量装有预定浓度的营养成分或添加剂溶液的贮料瓶的重量来适当地监测补料。
用于控制和维持发酵容器中恒定稀释速率的合适装置是一个包括监测贮料瓶流速的测量仪器和控制装置的系统，例如，计算实际的质量流速，与期望值比较并由此调节泵的设置的计算机-软件控制装置。一个合适的系统是，例如，通过系列-界面箱(Rocket Port,Comtrol Europe Ltd，大不列颠，以TechnosoftwareAG Rothackerstrasse 13,5702 Niederlenz为代表，瑞士)被连到各种操作装置上(秤、泵)的程序自动化系统，National Instruments,Bridge View，美国，for Windows NT4.0(以National Instruments,Sonnenbergstrasses 53,5408Ennetbaden为代表，瑞士)。
本发明方法使用的设备如图1所示。
发酵容器1(发酵罐)配备有来自贮料瓶2(适当地配有搅拌器)的进口管2a，贮料瓶2用于补加盐溶液(盐)、营养溶液(营养成分)、补充例如不同碳源的特殊底物(底物1和底物2)、调控PH的试剂(碱)、控制恒定稀释速率的水，以及消泡剂。泵3将液体从贮料瓶2输送到发酵罐1。秤4监控补加到发酵罐的和流出发酵罐的液体量。并且，发酵罐有补加氧气的进口管9和由装置14和15调控的排放气体的出口管10。泵6通过出口管5a将发酵液排到收集瓶5。一个主控制装置7监测和操纵全过程。控制装置11监测和操纵用于温度、PH、气压、发酵罐容量和补加消泡剂的独立的控制系统17。包括泵13的回路12被用于从发酵液中取样并用于提供可控气流来移动发酵液。进口和出口的气流通过流动控制装置14和15来调控。可任选地提供灭菌滤器16。任选地，发酵容器1配有恒温装置8。
本发明的方法中，任何蛋白-产生微生物既可以是天然的，例如真菌或细菌，也可以是用蛋白编码DNA转化的微生物，其中这种转化的微生物可以是细菌或真菌或酵母菌，优选地是隔孢伏革菌属、曲霉属、汉逊氏酵母菌属或毕赤氏酵母属，特别是黑色曲霉、Aspergillus awanari、酱油曲霉、米曲霉或多形汉逊氏酵母或巴斯德毕赤氏酵母。
本文中，本技术领域的技术人员选择已知用于目的蛋白生产的那种蛋白-产生微生物。
在本发明的优选技术方案中，蛋白选自具有酶活性如过氧化氢酶、乳糖酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化还原酶、葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和其它多糖酶、过氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角质酶、蛋白酶和其它蛋白水解酶、氨肽酶、羧肽酶、肌醇六磷酸酶、裂解酶、果胶酶和其它的果胶分解酶、淀粉酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、壳多糖酶和脱氧核糖核酸酶的一组蛋白。并且，在本发明的优选技术方案中，蛋白选自一组治疗蛋白如抗体、疫苗、抗原、或抗菌剂和/或利于健康的蛋白如lactoternir、乳过氧化物酶或溶菌酶。
本技术领域的技术人员应该理解术语“活性”不但包括天然存在的酶的天然活性或治疗功能，还包括那些通过氨基酸的取代、缺失、添加、或其它增强或修饰所需活性或热稳定性、PH耐受性和/或其它性能的修饰而改变的活性或功能。
在本发明最优选的技术方案中，所选蛋白是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白的例子在EP684313、EP897010、EP897985或本发明的实施例6至16和图2至22中被描述。
图2：共有肌醇六磷酸酶序列(consensus phytase sequence)的设计。字母代表以单字母密码表示的氨基酸残基。下列序列被用于排列：土曲霉(Aspergillus terreus)9A-1的phyA(Mitchell等，1997；源于氨基酸(aa)27)，土曲霉cbs116.46的phyA(van Loon等，1998；源于aa27)，黑色曲霉泡盛变种的phyA(Piddington等，1993；源于aa27)，黑色曲霉T213的phyA；(Mitchell等，1997；源于aa27)，黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA(van Hartingsveldt等，1993；源于aa27)，烟曲霉ATCC13073的phyA(Pasamontes等，1997；源于aa25)，烟曲霉ATCC32722的phyA(EP897985；图1；源于aa27)，烟曲霉ATCC58128的phyA(EP897985；图1；源于aa27)，烟曲霉ATCC26906的phyA(EP897985；图1；源于aa27)，烟曲霉ATCC32239的phyA；(EP897985；图1；源于aa30)，Emericella nidulans的phyA(Pasamontes等，1997a；源于aa25)，嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的phyA(Pasamontes等，1997a；源于aa24)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的phyA(Mitchell等，1997；源于aa19)。采用程序PILEUP进行计算排列。通过手工精确定位缺口的位置。在给定位点的排列中用大写字母表示的氨基酸残基属于建立共有残基的氨基酸结合体。在计算的共有序列的下面，以粗体表示最终构建的共有肌醇六磷酸酶(Fcp)的氨基酸序列。根据实施例6所述的原理，通过手工填补计算的共有序列中的缺口。
图3：共有肌醇六磷酸酶-1(consensus phytase-1)基因(fcp)和用于基因构建的引物的DNA序列。采用程序BACKTRANSLATE(Devereux等.,1984)和高度表达的酵母基因的密码子频率表(GCG程序包，9.0)将计算的氨基酸序列(图2)转化为DNA序列。源自土曲霉cbs.116.46的肌醇六磷酸酶的信号肽被融合到N-末端。粗体碱基代表用于合成基因的寡核苷酸序列。每个寡核苷酸的名称在序列的上面或下面交替标注。划下标线的碱基代表基因的起始和终止密码子。斜体写的碱基表示两个引入的EcoRⅠ位点。
图4：五种担子茵纲的肌醇六磷酸酶的排列和共有序列。字母代表单字母密码的氨基酸残基。开始于括号中提到的氨基酸残基并且源自于卷边桩菇(Paxillus involutus)、phyA1(aa21)和phyA2(aa21,WO98/28409)、绒毛栓菌(aa24,WO98/28409)、平田头菇(aa19,WO98/28409)和Peniophora lycii(aa21,WO98/28409)的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列用于排列和计算称作“Basidio”(实施例7)的相应共有序列。排列是通过程序PILEPUP进行的。通过手工精确确定缺口的位置。通过程序PRETTY计算共有序列。将0.5的权重分配给两个P.Involutus的肌醇六磷酸酶，所有其它基因以1.0的权重用于共有序列的计算。在不能由程序确定共有序列残基的位点，Basidio序列含有一个破折号。在给定位点的排列中用大写字母表示的氨基酸残基属于建立共有序列残基的氨基酸结合体。
图5：共有肌醇六磷酸酶-10的氨基酸序列的设计。将Thermomyceslanuginosus(Berka等，1998)的肌醇六磷酸酶序列和五个担子菌纲的肌醇六磷酸酶的共有序列加入图2的排列之中，通过程序PRETTY计算出改进的共有序列。另外，黑色曲霉T213的氨基酸序列被删除；因此，0.5的权重用于保留下来的黑色曲霉肌醇六磷酸酶序列。进一步的信息见实施例8。
图6：共有肌醇六磷酸酶-10的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列采用单字母密码写在相应DNA序列的上面。用于组成基因的寡核苷酸的序列以粗体字母表示。与共有肌醇六磷酸酶-1的氨基酸相比改变了的寡核苷酸和氨基酸的标记被划上下划线。fcp10基因由下列寡核苷酸组成：CP-1,CP-2,CP-3.10,CP-4.10,CP-5.10,CP-6,CP-7.10,CP8.10,CP-9.10,CP-10.10,CP-11.10,CP-12.10,CP-13.10,CP-14.10,CP-15.10,CP-16.10,CP-17.10,CP-18.10,CP-19.10,CP-20.10,CP-21.10,CP-22.10。新合成的寡核苷酸另外以数字10标记。肌醇六磷酸酶相对于共有肌醇六磷酸酶-1具有下列32个置换：Y54F,E58A,D69K,D70G,A94K,N134Q,I158V,S187A,Q188N,D197N,S204A,T214L,D220E,L234V,A238P,D246H,T251N,Y259N,E267D,E277Q,A283D,R291I,A320V,R329H,S364T,I366V,A379K,S396A,G404A,Q415E,A437G,A463E。当作为共有肌醇六磷酸酶-1中的单突变被检测时，以粗体字母标注的突变显示出对共有肌醇六磷酸酶-1的稳定作用。
图7：用于设计共有肌醇六磷酸酶-11的排列。与共有肌醇六磷酸酶-10的设计相反，全部担子菌纲的肌醇六磷酸酶作为独立的序列用于共有肌醇六磷酸酶-11的氨基酸序列的设计，其中0.2的分配权重用于每一担子菌纲序列。另外，黑色曲霉T213的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列被再次用于排列。
图8：共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A(consensus phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A)的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列以单字母密码的形式写在相应的DNA序列的上面。用下划线标注置换的氨基酸残基。所述基因的终止密码子用星号(*)标注。
图9：共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T-K91A(consensus phytase-1-thermo[3]-Q50T-K91A)的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列以单字母密码的形式写在相应的DNA序列上面。用下划线标注置换的氨基酸残基。所述基因的终止密码子用星号(*)标注。
图10：烟曲霉ATCC13073的肌醇六磷酸酶α-突变体的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列以单字母密码的形式写在相应的DNA序列的上面。用下划线标注置换的氨基酸残基。所述基因的终止密码子用星号(*)标注。
图11：共有肌醇六磷酸酶-7的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列以单字母密码的形式写在相应的DNA序列的上面。用于组成基因的寡核苷酸序列以粗体字母表示。被置换的寡核苷酸和氨基酸用下划线标注并且其相应的三联体密码用小写字母标注。fcp7基因由下列寡核苷酸组成：CP-1,CP-2,CP-3,CP-4.7,CP-5.7,CP-6,CP-7,CP-8.7,CP-9,CP-10.7,CP-11.7,CP-12.7,CP-13.7,CP-14.7,CP-15.7,CP-16,CP-17.7,CP-18.7,CP-19.7,CP-20,CP-21,CP-22。新合成的寡核苷酸另外以数字7标注。该肌醇六磷酸酶相对于原始共有肌醇六磷酸酶-1具有以下24个置换：S89D,S92G,A94K,D164S,P201S,G203A,G205S,H212P,G224A,D226T,E255T,D256E,V25ST,P265S,Q292H,G300K,Y305H,A314T,S364G,M365I,A397S,S398A,G404A和A405S。
图12：共有肌醇六磷酸酶-1和共有肌醇六磷酸酶-10的差示扫描量热法(DSC)。蛋白样品被浓缩到约50-60mg/ml并用10mM的醋酸钠(PH.0)进行充分的透析。以10℃/分钟的恒定加热速率加热到95℃。共有肌醇六磷酸酶-10的DSC(上图)产生85.4℃的解链温度，比共有肌醇六磷酸酶-1的解链温度高7.3℃(78.1℃，下图)。
图13：共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T和共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T-K91A的差示扫描量热法(DSC)。蛋白样品被浓缩到约50-60mg/ml并用10mM的酯酸钠(PH5.0)进行充分的透析。以10℃/分钟的恒定加热速率加热到95℃。共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T的DSC(上图)产生88.6℃的解链温度，而共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T-K91A的解链温度被发现是89.3℃。
图14：共有肌醇六磷酸酶-1，共有肌醇六磷酸酶-10与共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T之间的温度最适值的比较。为了确定温度最适值，在37至86℃之间的一系列温度下进行肌醇六磷酸酶的标准分析。稀释的转化的酿酒酵母菌株的上清液被用于测定。上清液中的其它成分表明对温度最适值的测定没有影响：△，共有肌醇六磷酸酶-1；◇，共有肌醇六磷酸酶-10；■，共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T。
图15：共有肌醇六磷酸酶-10及其变体热-[3]-Q50T和热-[3]-Q50T-K91A的PH-依赖活性曲线图和底物特异性。图a)表示共有肌醇六磷酸酶-10(□)，共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T(△)，和共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T-K91A(△)的PH-依赖活性曲线图，通过在不同PH值的适当缓冲液中(参见实施例15)采用标准分析方法来测定肌醇六磷酸酶活性。图b)表示通过采用标准分析方法中由指定的化合物取代肌醇六磷酸后测得的相应底物特异性；空心条，共有肌醇六磷酸酶-10(白色条，共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T；黑色条，共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A)。数字对应于下列化合物：1，肌醇六磷酸；2，磷酸对硝基苯酯；3，磷酸苯酯；4,1,6-二磷酸果糖；5,6-磷酸果糖；6,6-磷酸葡萄糖；7,5-磷酸核糖；8,DL-3-磷酸甘油；9,2-磷酸甘油；10,3-磷酸甘油酸；11，磷酸烯醇丙酮酸；12,AMP；13,ADP；14,ATP。
图16：共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T和共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T-K91A的PH-依赖活性曲线图和底物特异性。图a)表示Q50T(■)和Q50T-K91A-变体(△)的PH-依赖活性曲线图。通过在不同PH值的适当缓冲液(见实施例15)中采用标准分析方法来测定肌醇六磷酸酶活性。图b)表示通过标准分析方法中指定的化合物取代肌醇六磷酸测得的相应底物特异性；(空心条，共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T；实心条，共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T-K91A)。底物列在图15的图说明中。
图17：共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T和共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T-K91A的差示扫描量热法(DSC)。蛋白样品被浓缩到约50-60mg/ml并用10mM的醋酸钠(PH5.0)进行充分的透析。以10℃/分钟的恒定加热速率加热到95℃。共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T的DSC(上图)显示84.7℃的解链温度，而共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T-K91A的解链温度被发现是85.7℃。
图18：共有肌醇六磷酸酶-1，共有肌醇六磷酸酶-1-热-[3]与共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]之间的温度最适值的比较。为了确定温度最适值，在37至86℃之间的一系列温度下进行肌醇六磷酸酶的标准分析。从转化的酿酒酵母菌株的上清液中提纯的蛋白被用于测寂。○，共有肌醇六磷酸酶-1；□共有肌醇六磷酸酶-1-热-[3]；△，共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]。
图19：共有肌醇六磷酸酶-1，共有肌醇六磷酸酶-7和源自于黑色曲霉NPRL3135.的肌醇六磷酸酶之间的PH-依赖活性曲线图和底物特异性的比较。图a)表示共有肌醇六磷酸酶-1(■)，源自于黑色曲霉NRRL3135.的肌醇六磷酸酶(○)和共有肌醇六磷酸酶-7(△)的PH-依赖活性曲线图。通过在不同PH值的适当缓冲液(见实施例15)中采用标准分析方法测定肌醇六磷酸酶活性。图b)表示通过标准分析方法中指定的化合物取代肌醇六磷酸后测得的相应底物的特异性；(黑色条，黑色曲霉NRRL3135.的肌醇六磷酸酶；灰色条，共有肌醇六磷酸酶-1；阴影条，共有肌醇六磷酸酶-7)。底物列在图15的图说明中。
图20：源自于烟曲霉ATCC 13073的肌醇六磷酸酶及其稳定的α-突变体的差示扫描量热法(DSC)，所述突变体含有下列氨基酸置换：F55Y,V100I,F114Y,A243L,S265P,N294D。
蛋白样品被浓缩到约50-60mg/ml并用10mM的醋酸钠(PH5.0)进行充分的透析。以10℃/分钟的恒定加热速率加热到95℃。烟曲霉ATCC 13073的共有肌醇六磷酸酶的DSC(下图)显示62.5℃的解链温度，而α-突变体的解链温度被发现是67.0℃。
图21：烟曲霉13073野生型肌醇六磷酸酶，其α-突变体和进一步稳定的α-突变体(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)之间的温度最适值的比较。为了确定温度最适值，在37至75℃之间的一系列温度下进行肌醇六磷酸酶的标准分析。稀释的转化的酿酒酵母菌株上清液被用于测定。上清液中的其它成分对温度最适值的测定没有影响。○，烟曲霉ATCC 13073肌醇六磷酸酶；△，烟曲霉ATCC13073α-突变体；□，烟曲霉ATCC 13073α-突变体(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)-Q27T；■，烟曲霉ATCC 13073α-突变体(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)-Q27T-K68A。烟曲霉α-突变体中的Q51T和K92A突变分别对应于共有肌醇六磷酸酶中的-1Q50T和K91A。
图22：含有一些从“basidio”共有序列转变为共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]-Q50T-K91A的活性位点残基的共有肌醇六磷酸酶-12(consphy12)的氨基酸序列。
本发明的发酵过程中使用的培养基通常含有细胞或微生物的营养成分如可消化的氮源和无机物、维生素、微量-和痕量元素和其它促生长因子。另外，培养基还含有碳源。根据本发明，各种有机或无机物可用作发酵过程中的氮源，如硝酸盐、铵盐、酵母提取物、肉膏、胨、酪蛋白、玉米浆、氨基酸和尿素。可用于发酵过程中的典型无机物是钙、铁、锌、镍、锰、钴、铜、钼和碱金属盐如氯化物、硫酸盐和磷酸盐和硼酸。甘油或象单-、双-、寡聚-或多糖的糖类，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、纤维素或含有这类物质的底物如糖蜜、葡萄糖浆和果糖糖浆可被用作碳源。总补料液流中的葡萄糖和/或甲醇每一组分的浓度变化范围是从大约10至大约500g/L并且优选地是从大约200至大约300g/L。当发酵培养基主要是一种液体培养基时，这类培养基可含有诸如醇类这样的有机溶剂，例如甲醇、乙醇或异丙醇。并且，发酵培养基也可是一种分散液或悬浮液，这种情况适于进行搅拌发酵。
为了连续操作，细胞任选地固定化在多孔固体载体上。传统上用于发酵过程的具有任意孔、尺寸和几何形状并且对需要固定的特定细胞或微生物没有毒性作用的任何多孔固体载体都适用于本发明的目的。这种载体的例子是那些由无机物质制成并具有大约0.5至大约100μm的孔径，优选地大约10至大约30μm的孔径的载体。无机物质的例子是陶瓷和天然无机物如冻石、沸石、膨润土、硅酸盐(玻璃)、铝硅酸盐、铝氧化物、镁铝硅酸盐和镁铝氧化物。这种载体可以从市场上购买到，例如从德国的Ceramtec,Marktredwitz，德国的SchottEngineering GmbH,Mainz等公司购买。优选地，载体是平均直径为大约0.2至大约20mm的球形体。通过使载体颗粒与一种适当的细胞培养物接触的已知方式，将活细胞固定到载体上。如果需要，可进一步采用膜式包裹层，如GermanOffenlegungsschrift DE3421049(德国专利DE3421049)中所描述的膜式包裹层处理固定了细胞的载体颗粒。合适地，载体以固定床的形式置于发酵容器内。并且，如果自动灭菌不可靠(例如，通过甲醇、乙醇、氨)，应在使用前分别对培养基，它的组分和它们的容器适当地进行灭菌。优选地是蒸汽加热灭菌(例如，在121℃和1bar压力下灭菌20分钟)和用于敏感成分的过滤(0.2μm)除菌。或采用其它的灭菌方法。当以连续的方式进行操作时，培养基成分不必灭菌。
根据使用的特定细胞或生物体，发酵可在PH为大约2至大约11的范围内进行。在本发明的优选方案中，使用微生物，即采用EP897010、EP897985或本申请实施例11中描述的用编码肌醇六磷酸酶的DNA序列转化的多形汉逊氏酵母进行生产肌醇六磷酸酶的发酵过程。根据本发明具体的方面，优选的碳源是葡萄糖和甲醇的混合物。并且，根据本发明的这一具体的方案，发酵可在PH范围为大约4至5，优选地在PH大约为4.6下进行。用于进行这种发酵过程的优选温度范围在大约10至50℃，更优选的发酵温度大约为30℃。通气速率优选地调到单位体积的液体中大约0.01至大约1.5体积的气体，其中液体中的溶氧浓度(D0)为0.01至大约500％。100％的DO表示在大气压(1bar)和反应器温度下的溶液的氧饱和度。发酵可在大约0.1至大约100bar的压力下进行，优选地在大气压下进行发酵，即在大约1bar下进行。稀释速率可从每小时大约0.001变化到大约0.5。
本发明通过下面给出的实施例得到进一步的说明。
                              实施例1
用于进料培养基的贮存液制备如下：
1.1  CaCl2/H3BO3溶液
CaCl2·2H2O          18.75  g/l
H2BO3                0.0125  g/l本溶液121℃灭菌20分钟。
1.2  微量元素溶液
(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O  2.5  g/l
CuSO4·5H2O          0.2   g/l
ZnSO4·7H2O          0.75  g/l
MnSO4·5H2O          1.0  g/l
Na-EDTA                2.5  g/l本溶液121℃灭菌20分钟。
1.3  痕量元素溶液
NiSO4·6H2O          0.025 g/l
CoCl2·6H2O          0.025 g/l
Na2MoO4·2H2O      0.025 g/l
KJ本溶液121℃灭菌20分钟。
1.4  盐+维生素溶液
KH2PO4               50.0  g/l
NH4H2PO4           100.0 g/l
MgSO4·7H2O          45.0  g/l
(NH4)2SO4     50.0   g/l
KCl                 23.0   g/l
NaCl                5.0    g/l
维生素溶液          5.0    ml/l
(在50％的异丙醇/水中D-生物素，600mg/l
盐酸硫胺素200g/l)维生素溶液采用过滤(0.2μm)除菌并加到经121℃灭菌20分钟的盐溶液中。
1.5  葡萄糖溶液
为了得到1L含有57％(重量)D-葡萄糖的溶液，将770g的D-葡萄糖·H2O溶解到480g的水中并进行灭菌(121℃，20分钟)。
1.6  甲醇
确定纯甲醇无菌后装入灭菌瓶中。
1.7  消泡剂
10％消泡剂(Struktol J673,Schill & Seilacher,Hamburg，德国)的灭菌(121℃，20分钟)溶液用于控制泡沫。
1.8  碱
大约12.5％(重量)的氨溶于无菌水中的溶液被装入灭菌瓶中。
                         实施例2
固定床生物反应器(1升)按图1所示的方式进行组装，该反应器配有用于提供实施例1的溶液1.1到1.8的独立的贮料瓶。由多孔冻石球体(直径4mm，孔径10-30μm，每ml 280个孔，CeramTeC，Marktredwitz，德国)组成的固定床被装载在顶部的筛板上。反应器进行灭菌(121℃,20分钟)后装入用例如EP897010、EP897985或实施例11中所述的肌醇六磷酸酶编码DNA转化的多形汉逊氏酵母的种子培养物。然后与贮料瓶连接。种子培养物在以甘油代替葡萄糖作为碳源的培养基上生长。反应器进行分批操作直到甘油被消耗完，这由溶解氧浓度的升高来决定。然后打开进料液体并按照下面给出的操作条件进行发酵：
温度   30    ℃
PH     4.6  稀释的氧浓度
P总    105  N/m2
Po2    105  N/m2
稀释速率    0.0067 h-1
通气速率    100    ml/min
V液体       1190   ml-1
V固定床     950    ml-1
贮料瓶1-8提供的底物组成；(给定进料流体中的实际浓度)：
D-葡萄糖        305    g/l
甲醇            264    g/l
CaCl2/H3BO3溶液 12.2g/l
微量元素溶液    20.9   g/l
痕量元素溶液    17.2   g/l
盐+维生素溶液   44.7   g/l
分析
用Bio-Rad蛋白分析试剂盒Ⅰ(Bio-Rad,Glattbrugg，瑞士)测定总蛋白浓度。由总蛋白浓度(ctp)计算肌醇六磷酸酶浓度(cphyt)的系数被确定为cphyt=0.76·ctp。
为了确定培养基中的生物量，离心分离两份1ml的样品，用1ml的水洗涤，再次离心分离，85℃下干燥两天并称重。
结果：
上述操作条件下的生物量为59g/l。给定0.0067/小时的稀释速率，产率是0.078g的肌醇六磷酸酶/升·小时。
进料-分批发酵的生物量是125g/l；然而计算的产率是0.054g的肌醇六磷酸酶/升·小时。
                           实施例3
发酵的进行与实施例2类似，但不采用冻石球体(即，不使用固定化微生物)。按下列组成的营养液、盐溶液和维生素溶液分别泵入反应器：
营养液：
NiSO4·6H2O    8.33 mg/l
CoCl2·6H2O    8.33 mg/l
Na2oO4·2H2O  8.33 mg/l
KJ                   8.33 mg/l
(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 833.33 mg/l
CuSO4·5H2O          66.67  mg/l
ZnSO4·7H2O          250    mg/l
MnSO4·5H2O          333.33 mg/l
Na-EDTA              833.33 mg/l
CaCl2·2H2O          6250   mg/l
H3BO3                4.17  mg/l
盐+维生素溶液：
KH2PO4               50.0  g/l
NH4H2PO4            100.0  g/l
MgSO4·7H2O          45.0  g/l
(NH4)2SO4           50.0  g/l
KCl                      23.0  g/l
NaCl                     5.0    g/l
维生素溶液               5.0  ml/l
(50％的异丙醇/水中D-生物素，600mg/l盐酸硫胺素200g/l)
调节这两种溶液的补加量使得进料液体中的营养液浓度为51g/l和盐+维生素溶液浓度为61g/l。将稀释速率调节到0.009h-1。通过补加12.5重量％的氢氧化铵将PH维持在4.6。
并且，为了维持进料液体中275g/l的葡萄糖浓度和260g/l的甲醇浓度，将如实施例1所述的葡萄糖溶液和甲醇分别进料到反应器中。
这种发酵的产率是0.088g肌醇六磷酸酶/升·小时。流出液体中的生物量是58g/l。
                           实施例4
发酵过程类似于实施例3，但将葡萄糖浓度调节到290g/l，甲醇浓度调节到260g/l并保持稀释速率恒定在0.009h-1，产率是0.092g肌醇六磷酸酶/升·小时。流出液中的生物量是60.4g/l。
                            实施例5
发酵过程类似于实施例3，但将葡萄糖浓度调节到270g/l，甲醇浓度调节到到280g/l并保持稀释速率恒定在0.009h-1，产率是0.094g肌醇六磷酸酶/升·小时。流出液中的生物量是56.8g/l。
                  实施例6
共有肌醇六磷酸酶-1的氨基酸序列的设计
氨基酸序列的排列
采用具有标准参数(缺口产生级数12(gap creation penalty 12)，缺口延伸级数4(gap extension penalty 4))的GCG序列分析程序包9.0版(Release9.0)(Devereux等，1984)中的程序PILEUP来计算排列顺序。使用文本编辑器(text editor)精确推算缺口的定位。表1给出不含信号序列的、用于从表1提到的氨基酸(aa)开始排列的序列(见图2)。
表1：用于设计共有肌醇六磷酸酶(consensus phytase)-1的肌醇六磷酸酶氨基酸序列的来源和权重(vote weight)
-土曲霉9A-1的phyA,aa27，权重0.5(Mitchell等，1997)
-土曲霉cbs116.46的phyA,aa27，权重0.5(EP897985；图1)
-黑色曲霉泡盛变种的phyA,aa27，权重0.33(Piddington等，1993)
-黑色曲霉T213的phyA,aa27，权重0.33
-黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA,aa27，权重0.33(van Hartingsveldt等，1993)
-烟曲霉ATCC13073的phyA,aa26，权重0.2(Pasamontes等，1997)
-烟曲霉ATCC32722的phyA,aa26，权重0.2(EP897985；图1)
-烟曲霉ATCC58128的phyA,aa26，权重0.2(EP897985；图1)
-烟曲霉ATCC26906的phyA,aa26，权重0.2(EP897985；图1)
-烟曲霉ATCC32239的phyA,aa30，权重0.2(EP897985；图1)
-Emericellanidularns的phyA,aa25，权重1.0(Pasamontes等，1997a)
-嗜热踝节菌ATCC20186的phyA,aa24，权重1.0(Pasamontes等，1997a)
-嗜热毁丝菌的phyA,aa19，权重1.0(Mitchell等，1997)
共有肌醇六磷酸酶-1的氨基酸序列的计算
输入精确的排列顺序，通过GCG序列分析程序包9.0版(Release9.0)(Devereux等，1984)中的程序PRETTY计算共有序列。PRETTY以排成列的形式打印序列并能显示用于排列的共有序列。与排成列的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列间的相似性有关的权重被分布给所有序列。权重是如此设置的以使源自于一个序列亚组(相同的种，但来自于不同菌株)的所有肌醇六磷酸酶，例如来自于烟曲霉的所有肌醇六磷酸酶的氨基酸序列对选择的综合影响设置为1，这意味着每一序列起的作用占菌株序列数目分之一(见表1)。通过这一方法，可避免非常相似的氨基酸序列，例如源自于烟曲霉的不同菌株的肌醇六磷酸酶在计算的共有序列中起主导作用。
程序PRETRY起始于下列参数：将限定其下没有共有序列的权数(number ofvotes)的复数(plurality)设为2.0。确定评估矩阵值(scorning matrixvalue)的阈值设为2，该矩阵值下的一个氨基酸残基不为残基结合体加权。PRETTY使用了用于肽的PrettyPep.Cmp共有序列评估矩阵(consensus scorningmatrix)。
排列序列中不能由程序确定共有序列残基的10个位点(位点46,66,82,138,162,236,276,279,280,308；图2)按照下述规则由手工填补：如果一个残基出现的频率最高，就选择这个残基(138,236,280)；如果出现一个相似等同残基的优势组，频率最高或如果得不到的话，选择该组中的一个残基(46,66,82,162,276,308)。如果既不存在一个优势残基也不存在一个优势组，根据对蛋白稳定性影响的一般假设选择一个出现的残基(279)。其它8个位点(132,170,204,211,275,317,384,447；图2)不填补通过程序选择的氨基酸残基，但通常填补与使用程序选择的残基出现频率相同的氨基酸。大多数情况下，通过这一校正，完全消除了对三个黑色曲霉序列(权重之和：O.99)的低估。
将共有肌醇六磷酸酶-1的氨基酸序列转换成DNA序列
土曲霉cbsll6.46的肌醇六磷酸酶的头26个氨基酸残基被用作信号肽并融合到所有共有肌醇六磷酸酶的N-端。对于这一段序列，我们使用了一个特殊方法来计算相应的DNA序列。Purvis等(1987)建议基因中掺入稀有密码子对蛋白的折叠效果有影响。信号序列的DNA序列是通过采用Purvis等(1987)的方法计算的并适于在酿酒酵母中表达。对于蛋白的其它部分，为了将计算的氨基酸序列翻译成DNA序列，我们采用了GCG程序包中的高度表达的酿酒酵母基因的密码子频率表。
得到的fcp基因的序列如图3所示。
共有肌醇六磷酸酶-1基因的构建和克隆
交替地使用有义和反义-链的序列，将计算的共有肌醇六磷酸酶-1(fcp)的DNA序列分成85bp的寡核苷酸。每一寡核苷酸与它前面和后面的反链寡核苷酸重叠20bp。从Microsynth,Balgach(瑞士)购买的并且是PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)-纯的所有引物的定位如图3所示。
PCR-反应
在三个PCR-反应中，将合成的寡核苷酸组合成全基因。BoehringerMannheim(Boehringer Mannheim，德国)产的高保真试剂盒(HighFidelity Kit)和AMS Biotechnology(欧洲)有限公司(Lugano，瑞士)产的热循环仪Protokol(TM)被用于PCR反应。
将寡核苷酸CP-1到CP-10(混合物1，图3)混合成每一种寡核苷酸的浓度为0.2pmol/μl的混合物。采用CP-9到CP-22(每一种寡核苷酸的浓度为0.2pmol/μl)制备第二种寡核苷酸混合物(混合物2)。另外，四种短链引物被用于PCR反应：
CP-a:EcoRⅠ
5’-TATATGAATTCATGGGCGTGTTCGTC-3’(SEQ ID No.1)
CP-b:
5’-TGAAAAGTTCATTGAAGGTTC-3’(SEQ ID No.2)
CP-c:
5’-TCTTCGAAAGCAGTACAAGTAC-3’(SEQ ID No.3)
CP-e:
5’-TATATGAATTCTTAAGCGAAAC-3’(SEQ ID No.4)
PCR反应a:10μl混合物1(每一种寡核苷酸2.0pmol)
          2μl核苷酸(每一种核苷酸10mM)
          2μl引物CP-a(10pmol/μl)
          2μl引物CP-c(10pmol/μl)
          10.0μlPCR缓冲液
          0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
     73.25μLH2OPCR反应b:10μl混合物2(每一种寡核苷酸2.0pmol)
     2μl核苷酸(每一种核苷酸10mM)
     2μl引物CP-b(10pmol/μl)
     2μl引物CP-e(10pmol/μl)
     10.0μlPCR缓冲液
     0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
     73.25μLH2OPCR反应a和b的反应条件：
步骤1  2分钟-45℃
步骤2  30秒钟-72℃
步骤3  30秒钟-94℃
步骤4  30秒钟-52℃
步骤5  1分钟-72℃步骤3至5重复40次。
采用琼脂糖凝胶电泳(0.9％的琼脂糖)和下列凝胶提取(QIAEⅫ凝胶提取试剂盒，Qiagen,Hilden，德国)纯化PCR产物(670和905bp)。纯化的DNA片段被用于PCR反应c。
PCR反应c:6μl反应a的PCR产物(≈50ng)
         6μl反应b的PCR产物(≈50ng)
         2μl引物CP-a(10pmol/μl)
         2μl引物CP-e(10pmol/μl)
         10.0μlPCR缓冲液
         0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
         73.25μLH2O
PCR反应c的反应条件：
步骤1  2分钟-94℃
步骤2  30秒钟-94℃
步骤3  30秒钟-55℃
步骤4  1分钟-72℃步骤2至4重复31次。
通过上述方法纯化产生的PCR产物(1.4kb)，用EcoRⅠ消化，并将其与用EcoRⅠ-消化的并且去磷酸化的pBsk(-)-载体(Stratagene,La Jolla,CA，美国)连接。用1μl的连接混合物转化大肠杆菌XL-1感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA，美国)。按照Sambrook等(1987)的描述实施所有的标准方法。通过本技术领域已知的测序调控所构建的共有肌醇六磷酸酶基因(fcp，图3)的DNA序列。
                           实施例7
改进的共有肌醇六磷酸酶(共有肌醇六磷酸酶-10)的氨基酸序列的设计
使用带有标准参数(缺口产生级数12(gap creation penalty 12)，缺口延伸级数4(gap extension penalty 4))的GCG序列分析程序包9.0版(Release9.0)(Devereux等，1984)中的程序PILEUP计算用于设计共有肌醇六磷酸酶-10的排列顺序。使用文本编辑器(text editor)精确推算缺口的定位。
下列序列被用于排列起始于表2所述氨基酸(aa)的担子菌纲肌醇六磷酸酶的顺序：
表2：用于计算相应氨基酸共有序列(basidio)的五种担子菌纲肌醇六磷酸酶的来源和权重(vote weight)
-卷边桩菇NN005693的phyA1(肌醇六磷酸酶A1),aa21，权重0.5(WO98/28409)
-卷边桩菇NN005693的phyA2(肌醇六磷酸酶A2),aa21，权重0.5(WO98/28409)
-绒毛栓菌NN9343的phyA,aa24，权重1.0(WO98/28409)
-平田头菇菌NN009289的phyA,aa19，权重1.0(WO98/28409)
-Peniophora lycii NN006113的phyA,aa21，权重1.0(WO98/28409)
排列顺序如图4所示。
表3中列出了用于进行最终排列顺序的基因。用在排列顺序中的序列的第一个氨基酸(aa)在生物体名称的后面提到。
表3：用于设计共有肌醇六磷酸酶-10的肌醇六磷酸酶序列的来源和权重(vote weight)
-土曲霉9A-1的phyA,aa27，权重0.5(Mitchell等，1997)-土曲霉cbs116.46的phyA,aa27，权重0.5(EP897985；图1)
-黑色曲霉泡盛变种的phyA,aa27，权重0.5(Piddington等，1993)
-黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA,aa27，权重0.5(van Hartingsveldt等，1993)
-烟曲霉ATCC13073的phyA,aa26，权重0.2(Pasamontes等，1997)
-烟曲霉ATCC32722的phyA,aa26，权重0.2(EP897985；图1)
-烟曲霉ATCC58128的phyA,aa26，权重0.2(EP897985；图1)
-烟曲霉ATCC26906的phyA,aa26，权重0.2(EP897985；图1)
-烟曲霉ATCC32239的phyA,aa30，权重0.2(EP897985；图1)
-Emericellanidulans的phyA,aa25，权重1.0(Pasamontes等，1997a)
-嗜热踝节菌ATCC20186的phyA,aa24，权重1.0(Pasamontes等，1997a)
-嗜热毁丝菌的phyA,aa19，权重1.0(Mitchell等，1997)
-Thermomyces lanuginosa的phyA,aa36，权重1.0(Berka等，1998)
-五种担子菌纲的肌醇六磷酸酶的共有序列，权重1.0(Basidio，图4)
图5显示了相应的排列顺序。
共有肌醇六磷酸酶-10的氨基酸序列的计算
为了改进排列顺序，我们将其中仍含有不确定序列位点(见图4)的、源自于四种不同担子茵纲的称作Basidio的五种肌醇六磷酸酶的共有序列、几乎所有用于计算原始共有肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸酶序列和一种源自于Ascomycete Thermomyces langinosus的新的肌醇六磷酸酶序列组合成更长的排列顺序。
我们将复数设为2.0并将阈值设为3。所用的权重列于表3。排列顺序和相应的共有序列如图5所示。新的共有肌醇六磷酸酶-10的序列含有32个不同于原始共有肌醇六磷酸酶的氨基酸。按照实施例6的规则来填补不能由程序PRETTY计算出共有氨基酸残基的位点。由程序推测出的残基没有一个被替换。
而且，我们将所有担子菌纲的肌醇六磷酸酶作为一个氨基酸序列，但在排列顺序中分配了0.2的权重。图7给出了相应的排列顺序。计算的共有氨基酸序列(共有肌醇六磷酸酶-11)与共有肌醇六磷酸酶-10的序列具有下列区别：D35X,X(K)69K,X(E)100E,A101R,Q134N,X(K)153N,X(H)190H,X(A)204S,X(E)220D,E222T,V227A,X(R)271R,H287A,X(D)288D,X(K)379K,X(I)389I,E390X,X(E)415E,X(A)416A,X(R)446L,E463A，其中按照图6编号。
字母X表示程序不能计算共有氨基酸；括号中的氨基酸对应最终包括在共有肌醇六磷酸酶-10中的氨基酸。
我们也检测了由改进的共有肌醇六磷酸酶序列10和11所暗示的单个氨基酸置换对原始共有肌醇六磷酸酶-1稳定性的影响。方法如实施例8所述。
将共有肌醇六磷酸酶-10的氨基酸序列转换为DNA序列
土曲霉cbs116.46的肌醇六磷酸酶的头26个氨基酸残基被用作信号肽并融合到共有肌醇六磷酸酶-10的N-端。融合过程在实施例6中有进一步的描述。
产生的fcp10基因序列如图6所示。
共有肌醇六磷酸酶-10基因(fcp10)的构建和克隆
交替地使用有义和反义-链的序列，将计算的fcp10的DNA序列分成85bp的寡核苷酸。每一寡核苷酸与它前面和后面反链的寡核苷酸重叠20bp。从Microsynth,Balgach(瑞士)购买的并且是PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)-纯的所有引物的定位如图6所示。
PCR-反应
在三个PCR-反应中，合成的寡核苷酸被组合成全基因。BoehringerMannheim(Boehringer Mannheim，德国)产的高保真试剂盒和AMS Biotechnology(欧洲)有限公司(Lugano瑞士)产的热循环仪ProtokolTM被用于PCR反应。下列寡核苷酸的使用浓度为0.2pmol/ml。
混合物1.10:CP-1,CP-2,CP-3.10,CP-4.10,CP-5.10,CP-6,CP-7.10,CP-8.10,CP-9.10,CP-10.10
混合物2.10:CP-9.10,CP-10.10,CP-11.10,CP-12.10,CP-13.10,CP-14.10,CP-15.10,CP-16.10,CP-17.10,CP-18.10,CP-19.10,CP-20.10,CP-21.10,CP-22.10
新合成的寡核苷酸以数字10来标记。如图6中用下划线所标明的，肌醇六磷酸酶与原始共有肌醇六磷酸酶-1相比，具有下列32处置换：Y54F,E58A,D69K,D70G,A94K,N134Q,I158V,S187A,Q188N,D197N,S204A,T214L,D220E,L234V,A238P,D246H,T251N,Y259N,E267D,E277Q,A283D,R291I,A320V,R329H,S364T,I366V,A379K,S396A,G404A,Q415E,A437G,A463E。
四种短链PCR引物被用于寡核苷酸的合成：
CP-a:EcoRⅠ
5’-TATATGAATTCATGGGCGTGTTCGTC-3’(SEQ ID No.1)
CP-b:
5’-TGAAAAGTTCATTGAAGGTTTC-3’(SEQ ID No.2)
CP-c.10:
5’-TCTTCGAAAGCAGTACACAAAC-3’(SEQ ID No.5)
CP-e:EcoRⅠ
5’-TATATGAATTCTTAAGCGAAAC-3’(SEQ ID No.4)
PCR反应a:10μl混合物1.10(每一种寡核苷酸2.0pmol)
         2μl核苷酸(每一种核苷酸10mM)
         2μl引物CP-a(10pmol/ml)
         2μl引物CP-c.10(10pmol/ml)
         10.0μlPCR缓冲液
         0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
         73.25μLH2O
PCR反应b:10μl混合物2.10(每一种寡核苷酸2.0pmol)
          2μl核苷酸(每一种核苷酸：10mM)
          2μl引物CP-b(10pmol/ml)
          2μl引物CP-e(10pmol/ml)
          10.0μlPCR缓冲液
          0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
          73.25μLH2O
PCR反应a和b的反应条件：
步骤1    2分钟-45℃
步骤2    30秒钟-72℃
步骤3    30秒钟-94℃
步骤4    30秒钟-52℃
步骤5    1分钟-72℃步骤3至5重复40次。
通过琼脂糖凝胶电泳(0.9％的琼脂糖)和下列凝胶提取(QIAEⅫ凝胶提取试剂盒，Qiagen,Hilden，德国)纯化PCR产物(670和905bp)。纯化后的DNA片段用于PCR反应c。
PCR反应c:6μl反应a的PCR产物(≈50ng)
         6μl反应b的PCR产物(≈50ng)
         2μl引物CP-a(10pmol/ml)
         2μl引物CP-e(10pmol/ml)
         10.0μlPCR缓冲液
         0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
         73.25μLH2OPCR反应c的反应条件：
步骤1    2分钟-94℃
步骤2    30秒钟-94℃
步骤3    30秒钟-55℃
步骤4    1分钟-72℃步骤2至4重复31次。
产生的PCR产物(1.4kb)以上述方法进行纯化，用EcoRⅠ消化，并连接到用EcoRⅠ-消化的并且去磷酸化的pBsk(-)-载体(Stratagene,La Jolla,CA，美国)上。1μl的连接混合物用来转化大肠杆菌XL-1感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA，美国)。按照Sambrook等(1987)的描述进行所有的标准方法。构建的基因(fcp10)的DNA序列通过本技术领域已知的测序方法进行测序。
                             实施例8
通过引入共有肌醇六磷酸酶-10和/或共有肌醇六磷酸酶-11的氨基酸序列
暗示的单突变来增强共有肌醇六磷酸酶-1的热稳定性
有可能通过检测感兴趣的蛋白和计算的共有序列之间的每一个不同氨基酸残基的稳定作用并将所有稳定的突变组合到感兴趣的蛋白中来增强同源基因的热稳定性。通过单突变，我们使用共有肌醇六磷酸酶-1作为感兴趣的蛋白并检测了34个氨基酸对蛋白稳定性的影响，其中这34个氨基酸在共有肌醇六磷酸酶-1和共有肌醇六磷酸酶-10和/或11之间是不同的。
为了构建在黑色曲霉，酿酒酵母或多形汉逊氏酵母中表达的突变蛋白，含有共有肌醇六磷酸酶基因的相应表达质粒被用作定点诱变的模板(见实施例11-13)。按照产品说明和采用相应的引物，利用Stratagene(La Jolla,CA，美国)生产的“快速置换TM定点诱变试剂盒”引入突变。引入的所有突变和相应的引物由表4进行了概括。含有所需突变的质粒通过本技术领域已知的DNA序列分析进行鉴别。
表4：用于共有肌醇六磷酸酶定点诱变的引物
(置换的碱基用粗体标示。引入的限制位点在序列上面作了标记。写在括号里的限制位点是被引入的突变破坏了的位点。)
突变    引物对
                                   Kpn ⅠQ50T     5’-CACTTGTGGGGTACCTACTCTCCATACTTCTC-3’(SEQ ID No.6)
     5’-GAGAAGTATGGAGAGTAGGTACCCCACAAGTG-3’(SEQ ID No.7)Y54F     5’-GGTCAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAAG-3’(SEQ ID No.8)
     5’-CTTCCAAAGAGAAGAATGGAGAGTATTGACC-3’(SEQ ID No.9)E58A     5’-CATACTTCTCTTTGGCAGACGAATCTGC-3’(SEQ ID No.10)
     5’-GCAGATTCGTCTGCCAAAGAGAAGTATG-3’ (SEQ ID No.11)
                                   Aat ⅡD69K     5’-CTCCAGACGTCCCAAAGGACTGTAGAGTTAC-3’(SEQ ID No. 12)
     5’-GTAACTCTACAGTCCTTTGGGACGTCTGGAG-3’ (SEQ ID No.13)
                                   Aat ⅡD70G     5’-CTCCAGACGTCCCAGACGGCTGTAGAGTTAC-3’(SEQ ID No.14)
     5’-GTAACTCTACAGCCGTCTGGGACGTCTGGAG-3’(SEQ ID No.15)K91A     5’-GATACCCAACTTCTTCTGCGTCTAAGGCTTACTCTG-3’
     (SEQ ID No. 16)
     5’-CAGAGTAAGCCTTAGACGCAGAAGAAGTTGGGTATC-3’
     (SEQ ID No. 17)
                                   ScaⅠA94K     5’-CTTCTAAGTCTAAGAAGTACTCTGCTTTG-3’(SEQ ID No.18)
     5’-CAAAGCAGAGTACTTCTTAGACTTAGAAG-3’(SEQ ID No.19)A101R    5’-GCTTACTCTGCTTTGATTGAACGGATTCAAAAGAACGCTAC- 3’
     5’-GTAGCGTTCTTTTGAATCCGTTCAATCAAAGCAGAGTAAGC-3’N134Q    5’-CCATTCGGTGAACAGCAAATGGTTAACTC-3’(SEQ ID No.22)
     5’-GAGTTAACCATTTGCTGTTCACCGAATGG-3’(SEQ ID No.23)
                                    Nru ⅠK153N    5’-GATACAAGGCTCTCGCGAGAAACATTGTTC-3’(SEQ ID No.24).
     5’-GGAACAATGTTTCTCGCGAGAGCCTTGTATC-3’(SEQ ID No.25)
                                    Bss HⅠI158V    5’-GATTGTTCCATTCGTGCGCGCTTCTGGTTC-3’(SEQ ID No.26)
     5’-GAACCAGAAGCGCGCACGAATGGAACAATC-3’(SEQ ID No.27)
                                    BclⅠD197N    5’-CTCCAGTTATTAACGTGATCATTCCAGAAGG-3’(SEQ ID No.28)
     5’-CCTTCTGGAATGATCACGTTAATAACTGGAG-3’(SEQ ID No.29)
                                    Apa ⅠS187A    5’-GGCTGACCCAGGGGCCCAACCACACCAAGC-3’(SEQ ID No.30)
     5’-GCTTGGTGTGGTTGGGCCCCTGGGTCAGCC-3’(SEQ ID No.31)
                                    Nco ⅠT214L    5’-CACTTTGGACCATGGTCTTTGTACTGCTTTCG-3’(SEQ ID No.32)
     5’-CGAAAGCAGTACAAAGACCATGGTCCAAAGTG-3’(SEQ ID No.33)
                                    Avr ⅡE222T    5’-GCTTTCGAAGACTCTACCCTAGGTGACGACGTTG-3’(SEQ ID No.34)
     5’-CAACGTCGTCACCTAGGGTAGAGTCTTCGAAAGC-3’(SEQ ID No.35)V227A    5’-GGTGACGACGCTGAAGCTAACTTCAC-3’(SEQ ID No.36)
     5’-GTGAAGTTAGCTTCAGCGTCGTCACC-3’(SEQ ID No.37)
                                    SacⅡL234V    5’-CTAACTTCACCGCGGTGTTCGCTCCAG-3’(SEQ ID No.38)
     5’-CTGGAGCGAACACCGCGGTGAAGTTAG-3’(SEQ ID No.39)A238P    5’-GCTTTGTTCGCTCCACCTATTAGAGCTAGATTGG-3’(SEQ ID No.40)
     5’-CCAATCTAGCTCTAATAGGTGGAGCGAACAAAGC-3’(SEQ ID No.41)
                                   Hpa ⅠT251N    5’-GCCAGGTGTTAACTTGACTGACGAAG-3’(SEQ ID No.42)
     5’-TTCGTCAGTCAAGTTAACACCTGGC-3’(SEQ ID No.43)
                                   Aat ⅡY259N    5’-GACGAAGACGTCGTTAACTTGATGGAC-3’(SEQ ID No.44)
     5’-GTCCATCAAGTTAACGACGTCTTCGTC-3’(SEQ ID No.45)
                                   Asp ⅠE267D    5’-GTCCATTCGACACTGTCGCTAGAACTTC-3’(SEQ ID No.46)
     5’-GAAGTTCTAGCGACAGTGTCGAATGGAC-3’(SEQ ID No.47)E277Q    5’-CTGACGCTACTCAGCTGTCTCCATTC-3’(SEQ ID No.48)
     5’-GAATGGAGACAGCTGAGTAGCGTCAG-3’(SEQ ID No.49)A283D    5’-GTCTCCATTCTGTGATTTGTTCACTCAC-3’(SEQ ID No.50)
     5’-GTGAGTGAACAAATCACAGAATGGAGAC-3’(SEQ ID No.51)
                                   KspⅠH287A    5’-GCTTTGTTCACCGCGGACGAATGGAG-3’(SEQ ID No.52)
     5’-CTCCATTCGTCCGCGGTGAACAAAGC-3’(SEQ ID No.53)
                                   Bam HⅠR291I    5’-CACGACGAATGGATCCAATACGACTAC-3’(SEQ ID No.54)
     5’-GTAGTCGTATTGGATCCATTCGTCGTG-3’(SEQ ID No.55)
                                   BsiWⅠQ292A    5’-GACGAATGGAGAGCGTACGACTACTTG-3’(SEQ ID No.56)
     5’-CAAGTAGTCGTACGCTCTCCATTCGTC-3’(SEQ ID No.57)
                                   HpaⅠA320V    5’-GGTGTTGGTTTCGTTAACGAATTGATTGC-3’(SEQ ID No.58)
     5’-GCAATCAATTCGTTAACGAAACCAACACC-3’(SEQ ID No.59)
                                   (BglⅡ)R329H    5’-GCTAGATTGACTCACTCTCCAGTTCAAG-3’(SEQ ID No.60)
     5’-CTTGAACTGGAGAGTGAGTCAATCTAGC-3’(SEQ ID No.61)
                                   Eco RⅤS364T    5’-CTCACGACAACACTATGATATCTATTTTCTTC-3’(SEQ ID No.62)
     5’-GAAGAAAATAGATATCATAGTGTTGTCGTGAG-3’(SEQ ID No.63)
                                   NcoⅠI366V    5’-CGACAACTCCATGGTTTCTATTTTCTTCGC-3’(SEQ ID No.64)
     5’-GCGAAGAAAATAGAAACCATGGAGTTGTCG-3’(SEQ ID No.65)
                                   KpnⅠA379K    5’-GTACAACGGTACCAAGCCATTGTCTAC-3’(SEQ ID No.66)
     5’-GTAGACAATGGCTTGGTACCGTTGTAC-3’(SEQ ID No.67)S396A    5’-CTGACGGTTACGCTGCTTCTTGGAC-3’(SEQ ID No.68)
     5’-GTCCAAGAAGCAGCGTAACCGTCAG-3’(SEQ ID No.69)G404A    5’-CTGTTCCATTCGCTGCTAGAGCTTAC-3’(SEQ ID No.70)
     5’-GTAAGCTCTAGCAGCGAATGGAACAG-3’(SEQ ID No.71)Q415E    5’-GATGCAATGTGAAGCTGAAAAGGAACC-3’(SEQ ID No.72)
     5’-GGTTCCTTTTCAGCTTCACATTGCATC-3’(SEQ ID No.73)
                                   SalⅠA437G    5’-CACGGTTGTGGTGTCGACAAGTTGGG-3’(SEQ ID No.74)
     5’-CCCAACTTGTCGACACCACAACCGTG-3’(SEQ ID No.75)
                                   MunⅠA463E    5’-GATCTGGTGGCAATTGGGAGGAATGTTTCG-3’(SEQ ID No.76)
     5’-CGAAACATTCCTCCCAATTGCCACCAGATC-3’(SEQ ID No.77)并用于其它突变。按照实施例14所述的方法测定由酿酒酵母表达的纯化的肌醇六磷酸酶(实施例14)的温度最适值。表5显示了引入的每一突变对共有肌醇六磷酸酶-1稳定性的影响。表5：共有肌醇六磷酸酶-1的单个氨基酸置换对稳定性的影响(+或-分别代表升高到1℃对蛋白稳定性的正，负的影响，++或--分别代表在1-3℃之间对蛋白稳定性的正，负的影响；数字10或11相当于暗示氨基酸置换的共有肌醇六磷酸酶的序列。)
  稳定的             中性的              不稳定的
  突变    影响 突变    影响 突变    影响
E58A(10)    +D69K(11)    +D197N(10)   +T214L(10)   ++E222T(11)   ++E267D(10)   +R291I*      +R329H(10)   +S364T(10)   ++A379K(11)   +G404A(10)   ++ D69A        ±D70G(10)    ±N134Q(10)   ±G186H       ±S187A(10)   ±T214V       ±T251N(10)   ±Y259N(10)   ±A283D(10)   ±A320V(10)   ±K445T       ± Y54F(10)    -V73I        -A94K(10)    -A101R(11)   -K153N(11)   -I15SV(10)   --G203A       --G205S       -A217V       -V227A(11)   --L234V(10)   -
A463E(10)   ± A23SP(10)    --E277Q(10)    -H287A(11)    -Q292A(10)    -I366V(10)    -S396A(10)    --Q415E(11)    -A437G(10)    --E451R        --
*：在另一轮突变中发现了这一氨基酸的置换。
使用本实施例以上所述的引物和技术，我们将八个正突变(E58A,D197N,E267D,R291I,R329H,S364T,A379K,G404A)组合到共有肌醇六磷酸酶-1中。并且，引入了主要影响肌醇六磷酸酶的催化特性的突变Q50T和K91A(见EP897985和实施例14)。所产生的肌醇六磷酸酶基因(共有肌醇六磷酸酶-1-热-[8]-Q50T-K91A)的DNA和氨基酸序列如图8所示。通过此方法，共有肌醇六磷酸酶的温度最适值和解链温度被提高了7℃(图16,17,18)。
使用表5的结果，我们通过下列回复突变K94A,V158I和A396S(其对共有肌醇六磷酸酶-1的稳定性呈很强负影响)，进一步提高了共有肌醇六磷酸酶10的热稳定性。产生的蛋白是共有肌醇六磷酸酶-10-热-[3]。而且，我们引入了主要影响共有肌醇六磷酸酶催化特性的突变Q50T和K91A(见EP897985和实施例14和图15和图16)。所产生的DNA和氨基酸序列如图9所示。最佳化的肌醇六磷酸酶的温度最适值和解链温度比共有肌醇六磷酸酶-10提高了4℃(图13和14)。而且在以肌醇六磷酸作底物以及PH5.5的条件下，该肌醇六磷酸酶的比活性急剧地提高到250U/mg(图15)。
                             实施例9
通过以共有肌醇六磷酸酶-1和共有肌醇六磷酸酶-10的相应残基置换氨基
酸残基来稳定烟曲霉ATCC 13073的肌醇六磷酸酶
在六个典型位点，非-共有氨基酸残基被共有氨基酸残基所替代。在所述位点，烟曲霉13073的肌醇六磷酸酶是图2排列顺序中唯一或近乎唯一的不含相应共有肌醇六磷酸酶氨基酸残基的肌醇六磷酸酶。在第一个轮中，含有Q51T置换和土曲霉cbs.116.46肌醇六磷酸酶的信号序列的烟曲霉13073肌醇六磷酸酶中的下列氨基酸被置换(见图10)：
F55(28)Y,V100(73)I,F114(87)Y,A243(220)L,S265(242)P,N294(282)D。
括号中的数字参考图2的编号。
在第二个轮中，在共有肌醇六磷酸酶-10的序列中发现并被测定为共有肌醇六磷酸酶-1(表5)中的单突变的七个稳定氨基酸置换中的四个置换(E59A,R329H,S364T,G404A)被另外引入烟曲霉α-突变体中。而且，引入了能够降低肌醇六磷酸酶的蛋白酶敏感性的氨基酸置换S154N。
按照实施例8(见表6)引入突变并按照实施例11至13进行表达。产生的烟曲霉13073肌醇六磷酸酶变体被称作α-突变体(a-mutant)和α-突变体-E59A-S154N-R329H-S364T-G404A。
烟曲霉13073肌醇六磷酸酶α-突变体的温度最适值(60℃，图21)和解链温度(67.0℃，图20)与野生型的值(温度最适值：55℃,Tm：60℃)相比提高了5-7℃。另外五个氨基酸置换进一步将温度最适值提高了3℃(图21)。
表6：用于稳定烟曲霉ATCC 13073肌醇六磷酸酶的诱变引物突变    引物F55Y       5’-CACGTACTCGCCATACTTTTCGCTCGAG-3’(SEQ ID No.78)
       5’-CTCGAGCGAAAAGTATGGCGAGTACGTG-3’(SEQ ID No.79)
                                (XhoⅠ)E58A       5’-CCATACTTTTCGCTCGCGGACGAGCTGTCCGTG-3’(SEQ ID NO.80)
       5’-CACGGACAGCTCGTCCGCGAGCGAAAAGTAGG-3’(SEQ ID NO.81)V100I      5’-GTATAAGAAGCTTATTACGGCGATCCAGGCC-3’(SEQ ID No.82)
       5’-GGCCTGGATCGCCGTAATAAGCTTCTTATAC-3’(SEQ ID No.83)F114Y      5’-CTTCAAGGGCAAGTACGCCTTTTTGAAGACG-3’(SEQ ID No.84)
       5’-CGTCTTCAAAAAGGCGTACTTGCCCTTGAAG-3’(SEQ ID No.85)A243L      5’-CATCCGAGCTCGCCTCGAGAAGCATCTTC-3’(SEQ ID No.86)
       5’-GAAGATGCTTCTCGAGGCGAGCTCGGATG-3’(SEQ ID No.87)S265P      5’-CTAATGGATGTGTCCGTTTGATACGGTAG-3’(SEQ ID No.88)
       5’-CTACCGTATCAAACGGACACATGTCCATTAG-3’(SEQ ID No.89)N294D      5’-GTGGAAGAAGTACGACTACCTTCAGTC-3’(SEQ ID No.90)
       5’-GACTGAAGGTAGTCGTACTTCTTCCAC-3’(SEQ ID No. 91)
                                (MluⅠ)R329H      5’-GCCCGGTTGACGCATTCGCCAGTGCAGG-3’(SEQ ID No.92)
       5’-CCTGCACTGGCGAATGCGTCAACCGGGC-3’(SEQ ID No.93)
                                 NcoⅠS364T      5’-CACACGACAACACCATGGTTTCCATCTTC-3’(SEQ ID No.94)
       5’-GAAGATGGAAACCATGGTGTTGTCGTGTG-3’(SEQ ID No.95)
                                 (Bss HⅠ)G404A      5’-GTGGTGCCTTTCGCCGCGCGAGCCTACTTC-3’(SEQ ID No.96)
       5’-GAAGTAGGCTCGCGCGGCGAAAGGCACCAC-3’(SEQ ID No.97)
                               实施例10将黑色曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶的活性位点氨基酸残基引入共有肌醇六磷酸酶1中
我们使用黑色曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶的晶体结构定义所有活性位点氨基酸残基(见参考实施例和EP897010)。采用图2的排列顺序，用黑色曲霉的肌醇六磷酸酶的残基置换了共有肌醇六磷酸酶-1中的下列活性位点残基和其它的不同的相邻残基：
S89D,S92G,A94K,D164S,P201S,G203A,6205S,H212P,G224A,D226T,E255T,D256E,V258T,P265S,Q292H,G300K,Y305H,A314T,S364G,M365I,A397S,S398A,G404A,和A405S。
按照实施例6所述将新的共有肌醇六磷酸酶-7的蛋白序列反译成DNA序列(图11)。采用下列寡核苷酸混合物，按照实施例6所述方法合成相应的基因(fcp7)：
混合物1.7:Cp-1,CP-2,CP-3,CP-4.7,CP-5.7,CP-6,CP-7,CP-8.7,CP-9,CP-10.7
混合物2.7:CP-9,CP-10.7,CP-11.7,CP-12.7,CP-13.7,CP-14.7,CP-15.7,CP-16,CP-17.7,CP-18.7,CP-19.7,CP-20,CP-21,CP-22。
寡核苷酸的DNA序列如图11所示。另外用数字7标记新合成的寡核苷酸。采用与实施例6所述的相同PCR引物合成寡核苷酸后，将基因克隆到实施例11-13中所述的表达载体上。
由多形汉逊氏酵母表达并提纯的共有肌醇六磷酸酶-7的PH-曲线与黑色曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶的非常相似(见图19)。
                               实施例11
共有肌醇六磷酸酶基因在多形汉逊氏酵母中的表达
通过将pBsk-fcp或其变体的EcoRⅠ片段插入多形汉逊氏酵母表达载体pFPMT121的多克隆位点上来构建用于转化多形汉逊氏酵母RB11(Cellissen等，1994)的肌醇六磷酸酶表达载体，其中该表达载体基于源自于酿酒酵母的ura3选择标记，源自于多形汉逊氏酵母的甲酸脱氢酶(FMD)启动子元件和甲醇氧化酶(MO)终止子元件。fcp基因的5’端融合到FMD启动子上，3’端融合到MOX终止子上(Gellissen等，1996；EP0299108B)中。产生的表达载体被命名为pFPMTfcp,pFPMTfcp10,pFPMT fcp7。
将构建的质粒在大肠杆菌中进行繁殖。使用标准技术方法纯化质粒DNA。采用Gelissen等(1996)所描述的制备感受态细胞和转化酵母的方法，将表达质粒转化到乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷的多形汉逊氏酵母菌株RP11中。将每一转化混合物平板接种到含有2％葡萄糖和1.8％琼脂的YNB平板(0.14％w/vDifco YNB和0.5％的硫酸铵)上并在37℃下培养。4至5天后，挑出单个的转化菌落并在上述液体培养基中于37℃下培养2天。接着将该培养物的一份等分试样用来接种到装有含2％葡萄糖的YNB-培养基的新鲜小瓶中。进一步在选择培养基中进行七次传代后，表达载体以多聚体的形式被整合到酵母的基因组中。随后，通过在3ml非-选择液体培养基(YPD,2％葡萄糖，10g酵母提取物和20g蛋白胨)中的两个附加培养步骤，获得了有丝分裂稳定的转化子。为了获得基因同源重组菌株，将最终稳定培养物的一份等分试样平板接种到选择平板上。分离单个菌落用于分析在以2％甘油代替葡萄糖来抑制find启动子的YNB中肌醇六磷酸酶的表达。共有肌醇六磷酸酶的纯化按照实施例12所述的方法进行。
                                实施例12
共有肌醇六磷酸酶基因在酿酒酵母中的表达和由培养上清液中肌醇六磷酸酶的纯化
从相应的Bluescript-质粒(pBsk-fcp,pBSK-fcp10,pBSK-fcp7)中分离共有肌醇六磷酸酶基因并连入酿酒酵母表达载体pYES2(Invitrogen,San Diego,CA，美国)的表达盒的EcoRⅠ位点或亚克隆到Janes等所描述(1990)的截短的GAPFL(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子和pho5终止子之间。采用PCR检测基因的正确取向。按照Hinnen等所述的方法(1978)转化酿酒酵母菌株，例如INVScl(Invitrogen,San Diego,CA，美国)。挑选出含有由GAPFL启动子调控的肌醇六磷酸酶基因的单个菌落，并在5ml选择培养基(SD-尿嘧啶，Sherman等，1986)中、于30℃下剧烈振荡(250rpm)培养一天。然后将预培养物加到500mlYPD培养基(Sherman等，1986)并在相同的条件下培养。按照产品说明书的方法诱导Gall启动子。培养四天后的细胞培养液通过离心(7000rpm,GS3转子，15分钟，5℃)去除细胞并通过采用Amicon 8400 cells(PM30膜)和ultrafree-15离心过滤装置(Biomax-30K,Millipore,Bedford,MA，美国)进行超滤来浓缩上清液。以PH5.0的10mM醋酸钠作为洗脱缓冲液将浓缩物(10ml)在一根40ml的Sephadex G25 Superfine柱(Pharmacia Biotech,Freiburg，德国)上脱盐。将脱盐样品加到2M的(NH4)2SO4中并直接上样到1ml的Butyl Sepharose4快速流动疏水相互作用层析柱(Pharmacia Biotech,Freiburg，德国)，然后用溶于PH5.0的10mM醋酸钠的2M到0M(NH4)2SO4的线性梯度进行洗脱。将肌醇六磷酸酶洗脱到临界点，浓缩并上样到120ml的SephacrylS-300凝胶渗透层析柱(PharmaciaBiotech,Freiburg，德国)。洗脱的共有肌醇六磷酸酶-1和共有肌醇六磷酸酶-7呈均匀的对称峰，经SDS-PAGE分析纯度大约是95％。
                                 实施例13
共有肌醇六磷酸酶基因在黑色曲霉中的表达
将Bluescript-质粒pBsk-fcp,pBSK-fcp10，和pBsk-fcp7作为模板，用于引入基因起始密码子上游的BspHⅠ-位点和终止密码子下游的EcoRⅤ-位点。使用具有下列引物的ExpandTM高保真PCR试剂盒(Boehringer Mannheim,Mannheim，德国)：
引物Asp-1：
BspHⅠ
5’-TATATCATGAGCGTGTTCGTCGTGCTACTGTTC-3’(SEQ ID No.98)
用于克隆fcp和fcp7的引物Asp-2:
EcoRⅤ
3’-ACCCGACTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5’(SEQ ID No.99)
用于克隆fcp10的引物Asp-3:
EcoRⅤ
3’-ACCCTTCTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5’(SEQ ID No.100)
按照生产商提供的说明进行反应。PCR-扩增的fcp基因在起始密码子处具有通过引物Asp-1引入的新的BspHI位点，结果导致第二个氨基酸残基甘氨酸被丝氨酸置换。接着，用BspHⅠ和EcoRⅤ消化DNA-片段并接入黑色曲霉的葡糖淀粉酶启动子(glaA)下游的NcoⅠ位点和构巢曲霉的色氨酸C终止子(trpC)(Mullaney等，1985)上游的EcoRⅤ位点。完成这一克隆步骤后，基因通过测序来检测由PCR引入的可能的衰退。产生的基本对应于EP684313中的实施例9所描述的pGLAC载体的表达质粒含有作为选择标记的粗糙链孢霉的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyr4)。按照EP684313的方法转化黑色曲霉并进行共有肌醇六磷酸酶基因的表达。
                              实施例14
肌醇六磷酸酶活性和温度最适值的测定
肌醇六磷酸酶活性基本上是按照Mitchell等(1997)所描述的方法测定的。在含有溶于200mM醋酸钠，PH5.0的0.5％肌醇六磷酸(≈5mM)的测定混合物中测定活性。在37℃培养15分钟后，通过加入等体积的15％三氯乙酸终止反应。通过将100μl的测定混合物与900μlH2O和1ml的0.6MH2SO4,2％的抗坏血酸和0.5％的钼酸铵进行混合来定量测定释放出的磷酸。用标准磷酸钾溶液作对照。37℃下每分钟释放1μmol的磷酸的酶量被定义为一个酶活性单位。通过采用由Pace等(1995)计算出的280nm下的酶消光系数测定下列蛋白质的浓度：共有肌醇六磷酸酶-1.101；共有肌醇六磷酸酶-7,1.068；共有肌醇六磷酸酶-110,1.039。
在PH-最适值曲线图中，用PH5.0的10mM醋酸钠稀释纯化的酶。通过将稀释蛋白的等份样品与等体积的1％肌醇六磷酸(≈10mM)混合在一系列不同的缓冲液：0.4M甘氨酸/HCl,PH2.5；0.4M乙酸/NaOH,PH3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5；0.4M咪唑/HCl,PH6.0,6.5；0.4MTris/HCl,PH7.0,7.5,8.0,8.5,9.0中开始培养。对照实验表明PH只受混合步骤的轻微影响。如上所述培养在37℃下进行15分钟。
为了确定肌醇六磷酸酶的底物特异性，测定混合物中的肌醇六磷酸分别被5mM浓度的各个磷酸化合物所替代。活性的测定如上所述。
为了确定温度最适值。酶(100μl)和底物溶液(100μl)在给定的温度下预培养5分钟。通过将底物溶液加入到酶中开始反应。培养15分钟后，加入三氯乙酸终止反应并测定释放的磷酸的量。
原始共有肌醇六磷酸酶的PH-最适值大约为PH6.0-6.5(80U/mg)。引入Q50T突变后，PH-最适值变为PH6.0(130U/mg)。引入K91A突变后，PH-最适值变化一个PH单位成为酸性PH-范围：PH2.5至PH6.0之间，这个范围内呈现较高的比活性。对于稳定的突变体和共有肌醇六磷酸酶-10情况也是这样(图15和16)。
将黑色曲霉NRRL3135肌醇六磷酸酶的催化特性转移给共有肌醇六磷酸酶-1所构建的共有肌醇六磷酸酶-7具有非常类似于黑色曲霉NRRL3135肌醇六磷酸酶的PH-曲线图(见图19)。共有肌醇六磷酸酶-7的底物特异性也比类似于共有肌醇六磷酸酶-1更类似于黑色曲霉NRRL3135肌醇六磷酸酶。
共有肌醇六磷酸酶-1的温度最适值(71℃)比用于计算共有序列的野生型肌醇六磷酸酶的温度最适值(45-55℃，表7)高16-26℃。改进的共有肌醇六磷酸酶-10的温度最适值进一步增高到80℃(图12)。通过采用超量生产的酿酒酵母菌株的上清液，发现共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]肌醇六磷酸酶的温度最适值在同一范围(78℃)内。共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T-K91A的最高温度最适值达到82℃。
表7：共有肌醇六磷酸酶和源自于烟曲霉、黑色曲霉、E.nidulans和嗜热毁丝菌的肌醇六磷酸酶温度最适值和Tm-值。温度最适值的测定如实施例14所述进行。按照实施例15所述的差示扫描量热法测定Tm-值。
肌醇六磷酸酶   温度最适值[℃]     Tm[℃]
共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T-K91A     82     89.3
共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T     82     88.6
共有肌醇六磷酸酶-10     80     85.4
共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T     78     84.7
共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A     78     85.7
共有肌醇六磷酸酶-1     71     78.1
黑色曲霉NRRL3135     55     63.3
烟曲霉13073     55     62.5
烟曲霉13073     60     67.0
α-突变体
烟曲霉13073     63     -
α-突变体(最优化的)
土曲霉9A-1     49     57.5
土曲霉cbs.116.46     45     58.5
 E.nidulans     45     55.7
嗜热毁丝菌     55     n.d.
嗜热踝节菌     45     n.d.
               实施例15
采用差示扫描量热法(DSC)测定解链温度
采用以前由Lehmann等(2000)发表的差示扫描量热法来测定肌醇六磷酸酶的伸展温度。50-60mg/ml的均质肌醇六磷酸酶溶液用于测定。以恒定的加热速率10℃/分钟加热到90-95℃。
测定的解链温度反应了获得的温度最适值的结果(表7)。所设计的最稳定的共有肌醇六磷酸酶是在选择条件下具有89.3℃的解链温度的共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T-K91A。这比使用的野生型肌醇六磷酸酶的解链温度高26至33.6℃。
                               实施例16
将担子菌纲肌醇六磷酸酶的活性位点转入共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-
       Q50T-K91A中
如前所述(实施例8)，将源自于担子菌纲肌醇六磷酸酶活性位点的突变引入共有肌醇六磷酸酶-10中。五个构建体a)至e)的制备如下：
a)此构建体称作共有肌醇六磷酸酶-12，其含有选定数目的basidio共有序列的活性位点残基。它的氨基酸序列(consphy12)如图22所示(头26个氨基酸形成信号肽，修正的位置用下划线标出)；
b)将一组突变(Cluster Ⅱ)转入共有肌醇六磷酸酶-10序列中，即：S80Q,Y86F,S90G,K91A,S92A,K93T,A94R,Y95I；
c)类似地，转入另一组突变(Cluster Ⅲ)，即：T129V,E133A,Q143N,M136S,V137S,N138Q,S139A；
d)类似地，进一步转入一组突变(Cluster Ⅳ)，即：A168D,E171T,K172N,F173W；
e)最后，又进一步转入一组突变(Cluster Ⅳ)，即：Q297G,S298D,G300D,Y305T。
这些构建体按照实施例11-13所述进行表达。
参考文献Akanuma,S.,Yamagishi,A.,Tanaka,N. & Oshima,T.(1998).实验评价来自Bacillus subtilis的3-异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性的系列增加，蛋白质科学(prot.Sci.)7,698-705.Arase,A.,Yomo,T.,Urabe,I.,Hata,Y.,Katsube,Y. & Okada,H.(1993).通过随机诱变稳定木聚糖酶.FEBS Lett.316,123-127.Berka,R.M.,Rey,M.W.,Brown,K.M.,Byun,T. & Klotz,A.V.(1998)。来自嗜热真菌Thermomyces lanuginosus的植酸酶基因的分子表征和表达。应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64,4423-4427.Blaber,M.,Lindstron,J.D.,Gassner,N.,Xu,J.,Heinz,D.W. & Matthews,B.W.(1993).在T4溶茵酶中Ala‘Ser和Val’Thr取代所致的蛋白的核中埋入羟基的能量消耗和结构后果。生物化学(Biochemistry)32,11363-11373.Cosgrove,D.J.(1980)肌醇磷酸-其化学，生物化学和生理学：无机化学研究，chapter 4.Elsevier Scientific Publishing Company,Amsterdam,Oxford,New York.Devereux,J.,Haeberli,P. & Smithies,O.(1984)全套VAX序列分析程序。核酸研究(Nucleic Acids Res.)12,387-395.Gellissen,G.,Hollenberg,C.P.,Janowicz,Z.A.(1994)甲基营养酵母中的基因表达。In:Smith,A.(ed.)重组微生物中的基因表达.Dekker,New York,395-439.Gellissen,G.,Piontek,M.,Dahlems,U.,Jenzelewski,V.,Gavagan,J.E.,DiCosimo,R.,Anton,D.I. & Janowicz,Z.A.(1996)重组多形汉逊氏酵母作为生物催化剂：共表达菠菜乙醇酸氧化酶(GO)和酿酒酵母过氧化氢酶T(CTT1)基因。应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)46,46-54.Gerber,P.and Müller,K.(1995)Moloc分子模拟软件。计算机辅助分子设计杂志(J.Comput.Aided Mol.Des.)9,251-268.Hinnen,A.,Hicks,J.B. & Fink,G,R.(1978)酵母转化。美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75,1929-1933.Imanaka,T.,Shibazaki,M. & Takagi,M.(1986)。增强蛋白酶热稳定性的一种新方法。自然(Nature)324,695-697.Janes,M.,Meyhack,B.,Zimmermann,W. & Hinnen,A.(1990)GAP启动子变体对酿酒酵母中蛭素生产，平均质粒拷贝数和细胞生长的影响。当代遗传学(Curr.Genet.)18,97-103.Karpusas,M.,Baase,W.A.,Matsumura,M. & Matthews,B.W.(1989)。腔-填充突变体探测的T4溶菌酶中的疏水性堆积。Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86,8237-8241.Lehmann,L.,Kostrewa,D.,Wyss,M.,Brugger,R.,D′Arcy,A.,Pasamontes,L.,van Loon,A.(2000)，从DNA到改进的官能度：用蛋白质序列比较来快速设计热稳定性共有植酸酶，蛋白质工程(ProteinEngineering)13,49-57.Margarit,I.,Campagnoli,S.,Frigerio,F.,Grandi,G.,Fillipis,V.D. & Fontana,A.(1992)。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶中甘氨酸-丙氨酸的置换的累积的稳定作用。Prot.Eng.5,543-550.Matthews,B.W.(1987a).蛋白质稳定问题的遗传学和结构分析。Biochemistry 26,6885-6888.Matthews,B.W.(1993)。蛋白质稳定性的结构和遗传分析。生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)62,139-160.Matthews,B. W.,Nicholson,H. & Becktel,W.(1987)。源自降低伸张熵的定点突变的增强的蛋白质热稳定性。Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84,6663-6667.Mitchell,D.B.,Vogel,K.,Weimann,B.J.,Pasamontes,L. & vanLoon,A.P.G.M.(1997)组氨酸酸性磷酸酶的植酸酶亚族：从真菌Aspergillus terreus和Myceliophthora thermophila分离的两种新的植酸酶微生物学(Microbiology)143,245-252.Mullaney,E.J.,Hamer,J.E.,Roberti,K.A.,Yelton,M.M. &Timberlake,W.E.(1985)Aspergillus nidulans的trpc基因的一级结构。分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)199,37-46.Munoz,V. & Serrano,L.(1995)。螺旋设计，预测和稳定性。当代生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol).6,382-386.Pace,N.C.,Vajdos,F.,Fee,L.,Grimsley,G. & Gray,T.(1995).如何测量和预测蛋白质的摩尔吸收系数。Prot.Sci.4,2411-2423.Pantoliano,M.W.,Landner,R.C.,Brian,P.N.,Rollence,M.L.,Wood,J.F. & Poulos,T.L.(1987).枯草蛋白酶BPN’的蛋白质工程：通过引入两个半胱氨酸形成二硫键而增强的稳定性。Biochemistry 26,2077-2082.Pasamontes,L.,Haiker,M.,Henriquez-Huecas,M.,Mitchell,D.B.& van Loon,A.P.G.M.(1997a)。从Emericella nidulans和嗜热真菌Talaromyces thermophilus克隆植酸酶。Biochim.Biophys.Acta1353,217-223.Pasamontes,L.,Haiker,M.,Wyss,M.,Tessier,M. & van Loon,A.P.G.M.(1997)真菌烟曲霉的热稳定的植酸酶克隆，纯化和鉴定，Appl.Environ.Microbiol.63,1696-1700.Piddington,C.S.,Houston,C.S.,Paloheimo,M.,Cantrell,M.,Miettinen-Oinonen,A.Nevalainen,H., & Rambosek,J.(1993)黑曲霉泡盛变种的植酸酶(phy)和pH2.5-最适的酸性磷酸酶(aph)编码基因的克隆和测序。基因(Gene)133,55-62.Purvis,I.J.,Bettany,A.J.E.,Santiago,T.C.,Coggins,J.R.,Duncan,K.,Eason,R. & Brown,A.J.P.(1987)。通过控制体内翻译速率而增加一些蛋白质的折叠效率。分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193,413-417.Risse,B.,Stempfer,G.,Rudolph,R.,Schumacher,G. & Jaenicke,R.(1992).Lactobacillus plantarum的丙酮酸氧化酶的点突变的稳定作用的鉴定：通过调节辅酶结合和亚基相交作用保护天然状态。Prot.Sci.1,1710-1718.Sambrook,J.,Fritsch,E.F. & Maniatis,T.(1989)分子克隆：实验手册，2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Co1d SpringHarbor,NY.Sauer,R.,Hehir,K.,Stearman,R.,Weiss,M.,Jeitler-Nilsson,A.,Suchanek,E. & Pabo,C.(1986)。改造的亚基间二硫键增强1-阻抑蛋白的N-末端区的稳定性和DNA结合。Biochemistry 25,5992-5999.Serrano,L.,Day,A.G. & Fersht,A.R.(1993).Step-wise mutationof barnase to binase。一种改造增加蛋白质稳定性的方法和一种评价蛋白质稳定性的实验分析。J.Mol.Biol.233,305-312.Sheman,J.P.,Finck,G.R. & Hicks,J.B.(1986)酵母遗传学方法的实验手册。Cold Spring Harbor University.Steipe,B.,Schiller,B.,Plueckthun,A. & Steinbach,S.(1994)。序列统计可靠地预测蛋白质区域的稳定性突变。J.Mol.Biol. 240,188-192.van den Burg, B., Vriend, G., Veltman, O. R., Venema & G.,Eijsink,V.G.H.(1998)。工程改造酶以耐煮沸。Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95,2056-2060.Van Etten,R.L.(1982)人前列腺酸式磷酸酶：一种组氨酸磷酸酶。Ann.NYAcad.Sci.390,27-50.van Hartingsveldt,W.,vain Zeijl,C.M.F.,Harteveld,G.M.,Gouka,R.J.,Suykerbuyk,M.E.G.,Luiten,R.G.M.,van Paridon,P.A.,Selten,G.C.M.,Veenstra,A.E.,van Gorcom,R.F.M., & van denHondel,C.A.M.J.J.(1993)黑曲霉的植酸酶-编码基因(phyA)的克隆，定性和过表达。Gene 127,87-94。

Claims (20)

1．一种发酵设备，其包括：
一个适合于进行涉及活细胞的反应的容器；
至少两个与所述容器连接的、用于补加液体的贮料瓶和将所述液体从所述贮料瓶输送到所述容器的装置；
监测所述贮料瓶的内容物补加到所述容器的独立的装置；
与所述容器相连的收集瓶和将发酵液从所述容器输送到所述收集瓶的装置；和
通过改变从所述贮料瓶向所述容器分别补加液体的速率来控制和维持所述容器内恒定稀释速率的装置。
2．一种如权利要求1所述和图1所示的设备，其包括：
配有来自于贮料瓶2并用于补加液体的进口管2a的发酵罐1；用于将液体从贮料瓶2输送到发酵罐1的泵3；用于检测液体补加到和排出发酵罐的量的秤4；气体的进口管9和出口管10；用于将发酵液通过出口管5a排到收集瓶5的泵6；用于监测和操纵全过程的主控制装置7；用于监测和操纵用于温度、PH、气压、发酵罐容量和消泡剂的独立控制系统17的控制装置11；包括用于供应气体和取样的泵13在内的回路12；气体进口和出口流量的控制装置14和15；和，任选地，灭菌滤器16和恒温装置8。
3．一种如权利要求1或2所述的设备，其中所述贮料瓶包括用于为所述细胞生长和所需反应产物最佳化形成所需的碳、氮和矿物质源的溶液的独立的贮料瓶。
4．一种如权利要求1至3中的任意一项权利要求所述的设备，其中所述贮料瓶包括至少一个装有调控试剂的独立的贮料瓶。
5．一种如权利要求1至4中的任意一项权利要求所述的设备，其中所述贮料瓶包括一个装有水的独立的贮料瓶。
6．一种如权利要求1至5中的任意一项权利要求所述的设备，其中所述容器装有固定化活细胞的一个固定床和/或一个膨胀床和/或一个移动床。
7．一种如权利要求6所述的设备，其中所述活细胞固定化在多孔载体上。
8．一种从活细胞培养物中生产蛋白的连续方法，其中为所述细胞生长和所需蛋白最佳化生产所需的营养物质和其它试剂以恒定的稀释速率分别进料到反应器中。
9．一种如权利要求8所述的连续方法，其中所述蛋白选自过氧化氢酶、乳糖酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化还原酶、葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和其它多糖酶、过氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角质酶、蛋白酶和其它蛋白水解酶、氨肽酶、羧肽酶、肌醇六磷酸酶、裂解酶、果胶酶和其它的果胶分解酶、淀粉酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、壳多糖酶和脱氧核糖核酸酶或选自一组治疗蛋白如抗体、疫苗、抗原、或抗菌的和/或利于健康的蛋白如lactoternin、乳过氧化物酶或溶菌酶。
10．一种如权利要求8所述的连续方法，其中所述蛋白选自一组具有治疗蛋白活性的蛋白如抗体、疫苗、抗原。
11．一种如权利要求8至10中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述细胞被固定化。
12．一种如权利要求8至11中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述细胞是肌醇六磷酸酶-产生微生物。
13．一种如权利要求12所述的方法，其中所述肌醇六磷酸酶-产生微生物是多形汉逊氏酵母。
14．一种如权利要求13所述的方法，其中所述肌醇六磷酸酶-产生微生物是用编码真菌或共有序列来源的肌醇六磷酸酶的DNA转化的多形汉逊氏酵母。
15．一种如权利要求8至14中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述细胞或微生物载于固定床和/或膨胀床和/或移动床中的多孔载体上。
16．一种如权利要求8至15中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述碳源是甘油或一种糖如单糖、双糖或多糖。
17．一种如权利要求16所述的方法，其中所述的碳源是葡萄糖。
18．一种如权利要求8至15中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述碳源是甲醇。
19．一种如权利要求8至15中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖和甲醇。
20．一种如权利要求19所述的方法，其中甲醇和葡萄糖的总量分别为大约10至大约500g/l。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057701A (zh) * 2019-12-29 2020-04-24 陈东浩 一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法
CN114958803A (zh) * 2022-05-18 2022-08-30 阳原县仁恒精细粘土有限责任公司 植酸酶发酵生产方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6451572B1 (en) 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
EP2335501B8 (en) 2001-10-31 2016-09-21 Huvepharma Eood Phytase-containing animal food and method
DE10237082B4 (de) * 2002-08-09 2014-12-31 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen
EP1604008B1 (en) * 2002-09-13 2010-12-22 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases
US7635586B2 (en) 2003-11-26 2009-12-22 Broadley-James Corporation Integrated bio-reactor monitor and control system
US7435581B2 (en) 2003-11-26 2008-10-14 Broadley-James Corporation Integrated bio-reactor monitor and control system
AT501629B1 (de) * 2005-04-05 2007-10-15 Erber Ag Herstellung von hochgradig isotopenmarkierten, sekundären, mikrobiellen stoffwechselprodukten sowie stoffwechselprodukte
US7919297B2 (en) * 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
EP2069486A2 (en) * 2006-08-03 2009-06-17 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
US20080294361A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Popp Shane M Intelligent execution system for the monitoring and execution of vaccine manufacturing
US20080299624A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Edward Heslop Continuous fermentation apparatus and method
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
US8759068B2 (en) * 2008-01-02 2014-06-24 Missing Link Technologies, L.L.C. System for fermentation using algae
US8372631B2 (en) 2008-12-08 2013-02-12 Missing Link Technology, Llc System for harvesting algae in continuous fermentation
DE202010011059U1 (de) 2009-08-13 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Stützeinheit zum Anbringen von mehreren Flüssigkeitsaufbewahrungseinheiten
WO2011135588A2 (en) * 2010-04-29 2011-11-03 Shree Renuka Sugars Limited A continuous process for the preparation of alcohol
JP5742327B2 (ja) * 2011-03-15 2015-07-01 東レ株式会社 連続発酵重量制御装置、連続発酵システム、連続発酵重量制御方法、および、連続発酵重量制御プログラム
RU2450306C1 (ru) * 2011-04-21 2012-05-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "СКУ Система" (ООО "СКУ Система") Автоматизированная система управления подготовкой ракет-носителей
US9758413B1 (en) 2012-06-21 2017-09-12 Missing Link Technology, Llc Process and system for removing pollutants from contaminated water and for the production of an algal biomass
RU2491599C1 (ru) * 2012-08-28 2013-08-27 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "СКУ Система" (ООО "СКУ Система") Автоматизированная система управления подготовкой и пуском ракет-носителей
CN104884604A (zh) * 2012-11-01 2015-09-02 碧普(瑞典)有限公司 用于监测和/或控制发酵过程的系统设置
US10364426B1 (en) 2017-03-03 2019-07-30 Missing Link Technology, Llc Process for reducing cell death and increasing growth of an algal culture

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3338792A (en) * 1963-07-30 1967-08-29 Exxon Production Research Co Fermentation process utilizing pathogenic organisms
US4743545A (en) * 1984-08-09 1988-05-10 Torobin Leonard B Hollow porous microspheres containing biocatalyst
US4840902A (en) * 1987-05-04 1989-06-20 George Weston Limited Continuous process for ethanol production by bacterial fermentation using pH control
JPS63276482A (ja) * 1987-05-08 1988-11-14 Tabai Esupetsuku Kk 潅流培養装置における薬液注入排出装置
US5081035A (en) * 1988-04-18 1992-01-14 The University Of Michigan Bioreactor system
JP2622024B2 (ja) * 1990-10-09 1997-06-18 東洋エンジニアリング株式会社 発酵槽の制御方法
JPH04234981A (ja) * 1991-01-08 1992-08-24 Mitsui Toatsu Chem Inc 枯草菌の高密度培養方法および培養装置
ATE332378T1 (de) * 1994-04-25 2006-07-15 Dsm Ip Assets Bv Polypeptide mit phytase wirkung
ATE204322T1 (de) * 1995-06-07 2001-09-15 Aastrom Biosciences Inc Vorrichtung und verfahren zum aufbewahren und zur züchtung biologischer zellen
CA2231948C (en) * 1997-03-25 2010-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified phytases
NZ330940A (en) * 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057701A (zh) * 2019-12-29 2020-04-24 陈东浩 一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法
CN114958803A (zh) * 2022-05-18 2022-08-30 阳原县仁恒精细粘土有限责任公司 植酸酶发酵生产方法
CN114958803B (zh) * 2022-05-18 2024-06-04 阳原县仁恒精细粘土有限责任公司 植酸酶发酵生产方法

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Publication number Publication date
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