CN1105778C - 核苷－5’－ 磷酸酯的制造方法 - Google Patents

核苷－5’－ 磷酸酯的制造方法 Download PDF

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Abstract

一种有效、经济地生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以酸性磷酸酶、特别是核苷酸酶活性降低了的酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的条件下处理核苷和一种磷酸供体，磷酸供体选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)，从而生成核苷-5’-磷酸酯并收集生成物。

Description

核苷-5’-磷酸酯的制造方法
                           技术领域
本发明涉及核苷-5’-磷酸酯的制造方法。本发明还涉及在核苷-5’-磷酸酯的制造中有用的新型酸性磷酸酶、编码这种酸性磷酸酶的基因、含有这种基因的重组DNA和携带这种重组DNA的微生物。核苷-5’-磷酸酯作为调味品、医药及其原料非常有用。
                           背景技术
核苷经生物化学磷酸化来制造核苷-5’-磷酸酯的方法中，就所使用的磷酸供体而言，已知有使用对硝基苯磷酸的方法(特公昭39-29858号)、使用无机磷酸的方法(特公昭42-1186号)、使用聚磷酸的方法(特开昭53-56390号)、使用乙酰磷酸的方法(特开昭56-82098)、使用腺苷三磷酸(ATP)的方法(特开昭63-230094号)。然而，这些方法使用的底物非常昂贵，并可生成反应副产物，因而都不能满足廉价而高效地生产核苷-5’-磷酸酯的要求。
于是，本发明者们开发了使用特定的微生物菌体，在酸性条件下作用于核苷和选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)的磷酸供体，在不伴有2’-、3’-核苷酸异构体副产物生成的情况下，高效生成核苷-5’-磷酸酯的方法(特开平7-231793号)。
但是，在此方法中也有以下各种缺点，在所使用的微生物菌体中存在微量的核苷分解活性，因而在反应中部分底物被分解；而且，随着反应的继续，生成和积累的核苷-5’-磷酸酯也会被分解，从而在反应液中生成副产物，不能获得足够的回收率。另外，由于单个菌体的磷酸转移活性较低，当加入高浓度底物时反应无法进行。
                        发明内容
本发明的目的是提供一种廉价而高效的核苷-5’-磷酸酯的制造方法。本发明的另一目的是提供在核苷-5’-磷酸酯的制造方法中有用的酶、编码这种酶的基因、含有这种基因的重组DNA和携带这种重组DNA的微生物。
本发明者们为开发一种比传统方法更有效的核苷-5’-磷酸酯的制造方法进行了多方面的研究，结果发现，将从微生物的无细胞抽提液中纯化的酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的条件下作用于核苷和选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)的磷酸供体，能够高产、有效地生产核苷-5’-磷酸酯。而且，本发明非常成功地从多种细菌中获得了编码酸性磷酸酶的野生型基因及从摩根氏菌属和埃希氏菌属的细菌中获得了编码磷酸酯水解活性降低了的突变型酸性磷酸酶的基因，并发现用基因工程技术大量表达该基因能使核苷-5’-磷酸酯的生产飞跃性地提高，至此完成本发明。
即，本发明提供一种核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其特征在于使酸性磷酸酶，优选是核苷酸酶活性降低了的酸性磷酸酶，在pH3.0～5.5的条件下作用于核苷和选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)的磷酸供体，来生成核苷-5’-磷酸酯，并收集生成物。
另外，本发明还提供磷酸酯水解活性降低了的突变型酸性磷酸酶、编码这种酶的基因、含有这种基因的重组DNA以及携带这种重组DNA的微生物。
本发明还提供来源于埃希氏菌属、肠杆菌属，克雷伯氏菌属和沙雷氏菌属的新型酸性磷酸酶、编码这些酶的基因、含有这些基因的重组DNA和携带这些重组DNA的微生物。
下面详细说明本发明。
<1>酸性磷酸酶的获取
本发明  所使用的酸性磷酸酶能以聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)或氨甲酰磷酸(盐)为磷酸供体在pH3.0～5.5的条件下，催化磷酸基团转移至核苷生成核苷-5’-磷酸酯的反应，没有特别的限制。这种酸性磷酸酶优选来源于微生物，特别优选的实施例为来源于有这种酶活性的、属于摩根氏菌属、埃希氏菌属、普罗威登斯菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和沙雷氏菌属的细菌的酶。可举出以下菌株作为这类细菌的代表例。
摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)NCIMB10466
摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO3168
摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO3848
蟑螂埃希氏菌(Escherichiia blattae)JCM1650
蟑螂埃希氏菌(Escherichiia blattae)ATCC33429
蟑螂埃希氏菌(Escherichiia blattae)ATCC33430
苏氏普罗成登氏菌(Providencia stuartii)ATCC29851
苏氏普罗威登氏菌(Providencia stuartii)ATCC33672
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IFO12010
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IFO13534
植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IFO14939
植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IAM1133
无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)IAM13540
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)IAM12143
然而，酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)本来是在酸性条件下催化磷酸酯水解的酶，具有降解在磷酸转移反应中生成的核苷-5’-磷酸酯的核苷酸酶活性(在下文中称为“磷酸酯水解活性”)。在本发明的核苷-5’-磷酸酯制造方法中，也可以使用这种酸性磷酸酶。但为了高收率地获得核苷-5’-磷酸酯，最好使用与上述细菌产生的野生型酸性磷酸酶相比，磷酸酯水解活性降低了的突变型酸性磷酸酶(在下文中也简称为“突变型酸性磷酸酶”)。
如后述及，突变型酸性磷酸酶可用  使编码酸性磷酸酶的基因直接突变而表达突变型基因的方法来获得；亦可，用紫外线照射或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等人工突变常用的诱变剂处理产生酸性磷酸酶的微生物。培养能产生磷酸酯水解活性降低了的突变型酸性磷酸酶的微生物，来获得突变型酸性磷酸酶。
从上面介绍的微生物获得具有酸性磷酸酶活性的蛋白质可按下列步骤进行，将具有这种活性的菌株培养在适当的培养基中，收集增殖的菌体，破碎菌体制备无细胞抽提液，并进行必要的纯化。
培养微生物的培养基没有特殊的限制，可以使用含有普通的碳源、氮源、无机离子，必要时用含有有机营养源的普通培养基。碳源可用葡萄糖、蔗糖等糖类、甘油等醇类、有机酸及其它。氮源可用氨气、氨水、铵盐及其它。无机离子包括镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子、锰离子及其它，可按需要而使用。有机营养源可使用维生素、氨基酸等，或含有它们的酵母抽提物、蛋白胨、肉抽提物、玉米浆、酪素分解物、大豆水解物等。
培养条件也没有特殊的限制。例如，可在需氧条件下，将pH和温度适当控制在pH5～8和温度25～40℃的范围内，培养12～48小时左右。
增殖的菌体可用离心等方法从培养液中收集。用常规方法由回收的菌体制备无细胞抽提液。即，用超声波处理、Dyno-mill、氟氏压碎器等方法破碎菌体，离心除去菌体残渣，从而获得无细胞抽提液。
从无细胞抽提液中纯化酸性磷酸酶可采用硫酸铵分级、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤层析、等电点沉淀等纯化酶的常用技术适当加以组合运用。纯化并不一定必须是完全纯化，除去参与底物核苷降解的酶等夹杂物即可。
<2> 酸性磷酸酶基因的获取
含有编码具有酸性磷酸酶活性的蛋白质的结构基因的DNA片断，可以从具有该酶活性的微生物等的细胞中克隆。克隆方法有：以酶活性为指标筛选染色体基因表达文库的方法；制备针对该蛋白质的抗体来筛选染色体基因表达文库的方法；分析纯化蛋白质的N末端等的氨基酸序列，据此制备出探针来筛选基因文库的方法等。
具体地说，编码上面介绍的摩氏摩根氏菌、蟑螂埃希氏菌、苏氏普罗威登氏菌、产气肠杆菌、植生克雷伯氏菌、无花果沙雷氏菌或粘质沙雷氏菌的酸性磷酸酶的基因，可通过制备各种微生物的染色体基因表达文库，以磷酸酶活性为指标筛选这些文库来克隆。
即，首先由上述细菌制备染色体DNA，用适当的限制酶部分消化，然后与在大肠杆菌中能自主复制的载体连接，用获得的重组DNA转化大肠杆菌，从而制备成染色体基因表达文库。在切断染色体DNA时，通过调节切断反应时间来调整切断的程度，并可使用众多种类的限制酶。而且，基因克隆中使用的载体可以是任何能在大肠杆菌中自主复制的载体。例如，可以使用pUC19、pUC118、pHSG298、pBR322、pBluescriptII等。
制备载体与含有编码酸性磷酸酶的基因的DNA片断连接而成的重组DNA，其过程为，使用与切断染色体DNA所用的限制酶相同的限制酶，或使用产生的切断面与染色体的切断面互补的限制酶，预先切断载体，并用T4DNA连接酶等连接酶进行与DNA片断的连接。所制备的重组DNA的受体菌可为任何适宜于载体复制的菌株，例如可以使用大肠杆菌HB101、JM109、DH5等菌株。
使这样获得的转化子在琼脂培养基上生长繁殖形成菌落，然后，在培养基表面上倒入含有对硝基苯磷酸的反应液进行反应，表达磷酸酶活性的菌株会释放出对硝基苯并显黄色。在酸性条件下进行上述反应，以呈色为指标筛选转化子，能够筛选到携带含编码目的酸性磷酸酶的基因的DNA片断的转化子。
接着，从被选择的转化子中回收重组DNA，分析载体中连接的含有编码酸性磷酸酶的基因的DNA片断的结构。编码酸性磷酸酶的基因的碱基序列，在基因来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466、蟑螂埃希氏菌JCM1650、苏氏普罗威登氏菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO14939和无花果沙雷氏菌IAM13540时，分别显示在序列表序列编号2、9、17、19、21和23中。
由上述基因的编码推导的酸性磷酸酶的氨基酸序列显示在序列表序列编号4、11、18、20、22和24中。由上述基因编码的酸性磷酸酶可以在本发明中优选使用。而且，任何含有与上述基因编码的酸性磷酸酶的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的酸性磷酸酶，都可以在本发明中优选使用。“实质上相同”的意思是指酸性磷酸酶的氨基酸序列尽管有一个或两个以上的氨基酸残基的置换、缺失、插入或转移，但核苷-5’-磷酸酯的生成活性(下文表述为“磷酸转移活性”)并不丧失。
<3> 编码突变型酸性磷酸酶的基因的获取
按上述方法获得的野生型酸性磷酸酶由于含有磷酸酯水解活性，在制造核苷-5’-磷酸酯时，随着反应时间的延续，伴随着生成物的降解，因此是导致产率降低的重要原因。在这种情况下，应人工引起编码酸性磷酸酶的基因的突变以使其磷酸酯水解活性降低。
在DNA的目的位点上引起目的突变的位点特异性突变方法有，使用PCR的方法(Higuchi，R.，61页，《PCR技术》(PCR technology)，Erlich，H.A.E编辑，Stockton press(1989)；Carter，P.，《酶学方法》(Meth.in Enzymol.)，154卷，382页(1987))和使用噬菌体的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，《酶学方法》(Meth.in Enzymol.)，154卷，350页(1987)；Kunkel，T.A.等，《酶学方法》(Meth.in Enzymol.)，154卷，367页(1987))等。
磷酸酯水解活性降低了的酸性磷酸酶的实例包括含有与序列表序列编号4、11、18、20、22或24中所示氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，且含有使野生型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性降低的突变的突变型酸性磷酸酶。具体地说，当酶来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466时，所举的例子为，在序列表序列编号4所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸残基和/或第151位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换。在后述的实施例中所示的例子是第72位的甘氨酸残基被天冬氨酸残基置换、第151位的异亮氨酸残基被苏氨酸残基置换而获得的突变型酸性磷酸酶基因。当酶来源于蟑螂埃希氏菌JCM1650时，所举的例子为，在序列表序列编号11所示的氨基酸序列中第74位的甘氨酸残基和/或第153位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换。在后述的实施例中所示的例子是第74位的甘氨酸残基被天冬氨酸残基置换、第153位的异亮氨酸残基被苏氨酸残基置换而获得的突变型酸性磷酸酶基因。
因此，为了编码这些突变型酸性磷酸酶，使用上述的位点特异性突变方法，在野生型基因的特定部位中进行碱基置换即可。而且，磷酸酯水解活性降低的突变最好是没有伴随着与野生型酸性磷酸酶相比核苷-5’-磷酸酯生成活性实质上降低的突变，即使在核苷-5’-磷酸酯生成活性降低的情况下，只要磷酸酯水解活性降低的程度较大，其结果是磷酸酯水解活性/核苷-5’-磷酸酯生成活性的比值低于野生型酸性磷酸酶的突变即可。就磷酸酯水解活性降低的程度而言，活性降低到野生型酶的约40％以下的即可。
在后述的实施例中，蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷酸酶的氨基酸序列与摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶有很高的同源性，序列编号4所示氨基酸序列中的第72位的甘氨酸残基和第151位的异亮氨酸残基分别相当于序列编号11所示氨基酸序列中的第74位的甘氨酸残基和第153位的异亮氨酸残基。而且，除蟑螂埃希氏菌JCM1650以外，来源于苏氏普罗威登氏菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO14939和无花果沙雷氏菌IAM13540等微生物的酸性磷酸酶的氨基酸序列，与摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶的同源性也很高，并都分别含有与序列编号4所示氨基酸序列中的第72位的甘氨酸残基和第151位的异亮氨酸残基相当的氨基酸残基，可以用同样的方法获得突变型酸性磷酸酶基因。与序列编号4所示氨基酸序列中的第72位的甘氨酸残基和第151位的异亮氨酸残基相当的氨基酸残基，在来源于苏氏普罗威登氏菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010和植生克雷伯氏菌IFO14939的酸性磷酸酶中，为序列表序列编号18、20或22中所示氨基酸序列中的第92位的甘氨酸残基和第171位的异亮氨酸残基，在来源于无花果沙雷氏菌IAM13540的酸性磷酸酶中，为序列表序列编号24中所示的氨基酸序列中的第88位的甘氨酸残基和第167位的异亮氨酸残基。
<4> 将酸性磷酸酶基因导入宿主
将用上述方法获得的含有编码有酸性磷酸酶活性的蛋白质的基因的DNA片断，在适当的载体中再次重组后导入宿主细胞，能够获得高水平表达酸性磷酸酶活性的重组细菌。在这个过程中，如用编码野生型酸性磷酸酶的基因，则表达野生型酸性磷酸酶；如用编码突变型酸性磷酸酶的基因，则表达突变型酸性磷酸酶。
宿主包括上文列举的HB101、JM109、DH5等大肠杆菌菌株，除此之外，能使构建的重组DNA的复制起点和酸性磷酸酶基因具有功能的、重组DNA可以复制且酸性磷酸酶基因可以表达的细菌，都可用作宿主。一个最优选的宿主是大肠杆菌JM109。
用于整合编码酸性磷酸酶的基因的载体只需能在宿主中复制而没有特殊的限制。在以大肠杆菌作为宿主的情况下，可以举出能够在此细菌中自主复制的质粒作为例子，例如，可以使用ColE1系质粒、p15A系质粒、R因子系质粒、噬菌体系质粒等。具体的实例为，pBR322(《基因》(Gene)，2卷，95页(1977))、pUC19(《基因》(Gene)，33卷，103页(1985))、pUC119(《酶学方法》(Methods in Enzymology)，153卷，3页(1987))、pACYC184(《细菌学杂志》(J.Bacteriol)，134卷，1141页(1978))、pSC101(《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，70卷，3240页(1973))等。
在含有编码酸性磷酸酶的基因的DNA片断含有在宿主中有功能的启动子的情况下，将DNA片断原封不动与载体连接即可。在上述DNA片断不含启动子的情况下，在上述基因的上游连接lac、trp、PL等在宿主微生物内起作用的其它启动子亦可。即使在上述DNA片断含有启动子的情况下，为了有效地表达编码酸性磷酸酶的基因，也可与其它启动子置换。
将含有编码酸性磷酸酶的基因的DNA片断与载体连接而成的重组DNA导入宿主的方法没有特殊的限制，使用常规方法就可以进行。在使用大肠杆菌作为宿主时，可以使用氯化钙法(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，53卷，159页(1970))、Hanahan法(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，166卷，557页(1983))、SEM法(《基因》(Gene)，96卷，23页(1990))、Chung等的方法(《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，86卷，2172页(1989))、电穿孔法(《核酸研究》(Nucleic AcidsRes.)，16卷，6127页(1988))等方法。
而且，可以按上述方法将酸性磷酸酶基因插入到能自主复制的载体DNA中并导入宿主，以染色体外DNA的形式保持在宿主中，也可以用转导、转座子(《生物技术》(Biotechnol.)，第1卷，417页(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985)或同源重组(《分子遗传学实验》(Experiments in Molecular Genetics)，Cold Spring Harbor Lab.(1972))的方法将酸性磷酸酶基因整合到宿主微生物的染色体中。
<5> 在重组微生物中表达酸性磷酸酶基因
将按上述方法得到的、导入了含有编码酸性磷酸酶的基因的重组DNA的转化子培养于含有碳源、氮源、无机离子、及如果必要时含有机营养源的适当培养基中，转化子能够在菌体中高水平地表达酸性磷酸酶活性。适宜于使用的碳源包括葡萄糖等碳水化合物、甘油等醇类、有机酸及其它；使用的氮源包括氨气、氨水、铵盐及其它；必要时适宜于使用的无机离子包括镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子、锰离子及其它离子；适宜于使用的有机营养源包括维生素、氨基酸等，以及含有它们的酵母抽提物、蛋白胨、肉抽提物、玉米浆、酪素分解物、大豆水解物等。而且，在培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)等启动子依赖的表达诱导剂时，酸性磷酸酶的表达量会上升。
培养条件也没有特殊的限制，例如，在需氧条件下，将pH和温度适当控制在pH5～8和25～40℃的范围内，培养12～48小时左右即可。
接着，从培养物中回收菌体，破碎菌体获得无细胞抽提液，从中能够纯化酸性磷酸酶。纯化可采用<1>中所述常用的酶纯化技术加以适当组合。纯化并不一定必须是完全纯化，除去参与底物核苷降解的酶等夹杂物即可。
<6> 核苷-5’-磷酸酯的制造
将上述<1>中获得的酸性磷酸酶或上述<5>中所示的用基因工程技术大量表达基因所获得的野生型酸性磷酸酶或突变型酸性磷酸酶，与核苷和选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)的磷酸供体进行接触反应，可在反应液中生成核苷-5’-磷酸酯。这时，为了得到高的生产性，将反应液的pH调节在3.0～5.5的弱酸性范围内非常重要。
而且，在用基因工程技术大量表达编码酸性磷酸酶的基因时，特别是大量表达编码磷酸酯水解活性降低了的突变型酸性磷酸酶的基因时，使用含有转化子的菌体的培养物、从该培养物分离回收的菌体、以及对该菌体进行固定化处理、丙酮处理、冷冻干燥处理等所得到的菌体处理物，来代替纯化的酸性磷酸酶，都能够廉价而有效地生成核苷-5’-磷酸酯。
所用核苷包括，次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、嘌呤核苷、6-甲氧嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、6-氟嘌呤核苷、6-硫代嘌呤核苷、2-氨基-6-硫代嘌呤核苷和巯基鸟嘌呤核苷等嘌呤类核苷；尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、5-氨基尿嘧啶核苷、5-羟基尿嘧啶核苷、5-溴尿嘧啶核苷和6-氮尿嘧啶核苷等嘧啶类核苷。在反应中这些天然型核苷和非天然型核苷的5’位置被特异性地磷酸化，生成各自对应的核苷-5’-磷酸酯。
反应液中加入的核苷的浓度最好为1～20g/dl。在使用难溶于水的核苷时，加入硼酸或二甲基亚砜等表面活性剂会使反应收率升高。
可以使用的磷酸供体包括：焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸或它们的混合物、或它们的钠盐、钾盐或这些盐的混合物等聚磷酸(盐)；磷酸苯酯二钠、磷酸苯酯二钾、O，O-缩水二磷酸苯酯或它们的混合物等磷酸苯酯(盐)；氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂或它们的混合物等氨甲酰磷酸(盐)。磷酸供体的使用浓度由用作磷酸受体的核苷的浓度来决定。通常最好为核苷的1～5倍量。
反应通常在20～60℃(优选为30～40℃)的温度、pH3.5～6.5(优选为pH4.0～5.0)的弱酸性条件下提供优选的结果。在反应中可任选采用静置或搅拌的方法。反应时间根据所用的酶的活性、底物浓度等条件的不同可为1～100小时。
从反应后的混合物中收集分离所生成的核苷-5’-磷酸酯，可以采用使用合成吸附树脂的方法和使用沉淀剂的方法以及其它常规的收集分离方法。
                   附图的简单说明
图1显示在使用来源于摩氏摩根氏菌的酶的反应中，反应pH与5’-次黄嘌呤核苷酸生成量之间的关系。
图2显示在使用来源于蟑螂埃希氏菌的酶的反应中，反应pH与5’-次黄嘌呤核苷酸生成量之间的关系。
图3显示含有编码酸性磷酸酶的基因的摩氏摩根氏菌染色体DNA片断的限制酶图谱。
图4显示在使用来源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的携带菌株的反应中5’-次黄嘌呤核苷酸的生成量。
图5显示在使用来源于摩氏摩根氏菌的野生型酸性磷酸酶基因的携带菌株和突变型酸性磷酸酶基因的携带菌株的反应中5’-次黄嘌呤核苷酸的生成量。
图6显示含有编码酸性磷酸酶的基因的蟑螂埃希氏菌染色体DNA片断的限制酶图谱。
图7显示在使用来源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶基因的携带菌株的反应中5’-次黄嘌呤核苷酸的生成量。
图8显示在使用来源于蟑螂埃希氏菌的野生型酸性磷酸酶基因的携带菌株和突变型酸性磷酸酶基因的携带菌株的反应中5’-次黄嘌呤核苷酸的生成量。
图9显示含有编码酸性磷酸酶的基因的产气肠杆菌染色体DNA片断的限制酶图谱。
图10显示含有编码酸性磷酸酶的基因的植生克雷伯氏菌染色体DNA片断的限制酶图谱。
图11显示含有编码酸性磷酸酶的基因的无花果沙雷氏菌染色体DNA片断的限制酶图谱。
图12用氨基酸的单字母表示法显示由摩氏摩根氏菌、蟑螂埃希氏菌、苏氏普罗威登氏菌、产气肠杆菌、植生克雷伯氏菌、和无花果沙雷氏菌的酸性磷酸酶基因的碱基序列推导的蛋白质的氨基酸序列。这些氨基酸序列分别在序列表序列编号4、11、18、20、22和24中用三字母表示法显示。在图中，周在序列下加*号显示所有氨基酸序列中共同的氨基酸残基。
                     优选实施例的说明
下面用实施例来具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
磷酸转移活性的测定以次黄嘌呤核苷为底物在下列条件下进行。含有次黄嘌呤核苷40umol/ml、焦磷酸钠100umol/ml、乙酸钠缓冲液(pH5.0)100umol/ml和酶的反应液(1ml)在pH5.0、30℃的条件下反应10分钟。加入2N的盐酸200ul使反应停止，然后离心除去沉淀，对反应中生成的5’-次黄嘌呤核苷酸进行定量。将在此标准反应条件下1分钟内生成1umol的5’-次黄嘌呤核苷酸的酶量定为1单位。
磷酸酯水解活性的测定是以5’-次黄嘌呤核苷酸为底物在下列条件下进行。在含有5’-次黄嘌呤核苷酸10umol/ml、MES/NaOH缓冲液(pH6.0)100umol/ml和含酶的反应液(1ml)在30℃的条件下反应10分钟，加入2N的盐酸200ul使反应停止，然后离心除去沉淀，对水解反应中生成的次黄嘌呤核苷进行定量。将在此标准反应条件下1分钟内生成1 umol的次黄嘌呤核苷的酶量定为1单位。
次黄嘌呤核苷和5’-次黄嘌呤核苷酸用高效液相色谱(HPLC)在下述条件下进行分析。
柱：Cosmosil 5C 18-AR(4.6×150mm)(nacalai tesque公司出品)
流动相：5mM磷酸钾缓冲液(pH2.8)/甲醇＝95/5
流速：1.0ml/min
温度：室温
检出：UV245nm
在用次黄嘌呤核苷以外的核苷为原料的核苷-5’-磷酸酯的生成反应中，原料核苷和生成的核苷-5’-磷酸酯也用与上述同样的HPLC进行分析。
实施例1来源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的纯化和性质
将50ml含有蛋白胨1g/dl、酵母抽提物0.5g/dl和氯化钠1g/dl的营养培养基(pH7.0)加入500ml的坂口瓶中，在120℃加热灭菌20分钟。在瓶中接种一白金耳摩氏摩根氏菌NCIMB10466的斜面培养物，在30℃振荡培养16小时。离心培养液回收约3,000g的菌体。后者悬浮于1L的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，在4℃进行超声波处理20分钟破碎菌体。离心除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。
在此无细胞抽提液中加入硫酸铵至30％饱和。离心除去生成的沉淀，然后在上清液中继续加入硫酸铵至60％饱和。离心收集生成的沉淀，将其溶解在100mM的磷酸钾缓冲液中。
这种粗酶液用5L的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析四次，然后上样至用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopearl650M柱(4.1×22cm)中，用800ml的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱，磷酸转移活性存在于通过的组分中，回收该组分。
在此活性组分中加入硫酸铵至35％饱和，并用35％硫酸铵饱和的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopearl柱(3.1×26cm)吸附。用35％饱和至20％饱和的磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性梯度进行洗脱。
收集活性组分，用1L的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，然后用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(5×6.5cm)吸附。用50mM至300mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性梯度进行洗脱。
收集活性组分，并超滤浓缩。将此酶液注入HiLoad TM 16/60Superdex200柱(Pharmacia公司出品)，用含有100mM氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)以1.0ml/分的流速进行洗脱。
按照上述操作，最终从无细胞抽提液中得到纯化约550倍的显示磷酸转移活性的酶，回收率约为10％。此纯化过程中的比活性和回收率如表1所示。此酶样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中是均一的。
                          表1
    过程   总活性(单位)   总蛋白(mg)   比活性(单位/mg)   回收率(％)
1.无细胞抽提液2.硫酸铵分级(30～60％)3.DEAE-Toyopearl4.Butyl-Toyopearl5.羟基磷灰石6.Superdex200     59756851739411263   127,200122,21036,4981,1215024     0.0050.0050.0140.3512.2442.630     1009587661910
纯化后的酶具有以下性质。
(1)作用：将磷酸从聚磷酸等磷酸供体转移至核苷，生成核苷-5’-磷酸酯。也显示逆向的磷酸酯水解作用。
(2)底物特异性：在磷酸转移反应中，可以用作磷酸供体的有焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、磷酸苯酯二钠、磷酸苯酯二钾、O，O-缩水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂等。可以用作磷酸受体的有嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、和胞嘧啶核苷等。另一方面，可在磷酸酯水解反应中接受作用的有焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等无机磷酸；磷酸苯酯二钠、磷酸苯酯二钾、O，O-缩水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂等磷酸酯；以及5’-嘌呤核苷酸、5’-次黄嘌呤核苷酸、5’-鸟嘌呤核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸、5’-黄嘌呤核苷酸、5’-尿嘧啶核苷酸、5’-胞嘧啶核苷酸等5’-核苷酸。
(3)最适pH：5.2(磷酸转移反应)、6.5(磷酸酯水解反应)
(4)pH稳定性：pH3.0～12.0(30℃、处理60分钟)
(5)最适温度：35℃左右
(6)温度稳定性：30℃以内稳定(pH7.0、处理30分钟)
(7)金属离子和抑制剂的影响：本酶的活性在加入金属离子时，不会出现活化现象，Ag2+、Pb2-、Hg2+和Cu2+会抑制本酶的活性，而且碘乙酸也会抑制本酶的活性。
(8)分子量：用高效液相色谱(TSKgel G-3000SW，Toyo Soda公司出品)计算出的分子量约为190,000。
(9)亚单位分子量：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测算出的亚单位分子量约为25,000。
本酶不仅有将磷酸基团转移至核苷的磷酸转移活性，还显示逆向的磷酸酯水解活性，而且本酶显示的磷酸酯水解活性比磷酸转移活性高20倍以上。其它性质也与摩根氏菌属的细菌产生的已知酸性磷酸酶一致(《微生物学》(Microbiology)，140卷，1341-1350页(1994))，因此，本酶显然是一种酸性磷酸酶。
将焦磷酸钠10g/dl和次黄嘌呤核苷2g/dl溶解在pH分别为5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的乙酸钠缓冲液中，然后加入上述酶样品至50单位/dl。分别维持各自的pH，在30℃反应6小时，测定随时间延续生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量。而且，生成的次黄嘌呤核苷酸仅为5’-次黄嘌呤核苷酸，完全没有发现2’-次黄嘌呤核苷酸和3’-次黄嘌呤核苷酸副产物的生成。结果如图1所示。5’-次黄嘌呤核苷酸的生成速率在pH5.0时达到最大，5’-次黄嘌呤核苷酸的最大积累量随pH的降低而升高。5’-次黄嘌呤核苷酸的生产在pH4.0的反应条件下最有效率，3小时的反应能生成积累2.60g/dl的5’-次黄嘌呤核苷酸。
实施例2使用来源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶样品
       对各种核苷进行的磷酸化反应
将焦磷酸钠10g/dl和作为磷酸受体的次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷2g/dl溶解在乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中加入实施例1的酶样品至50单位/dl，将pH维持在pH4.0，在30℃反应3小时。反应中生成的核苷-5’-酯的量如表2所示。
而且，生成的核苷酸仅为核苷-5’-酯，完全没有发现核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副产物的生成。
                        表2
    核苷       生成物   生成量(g/dl)
  次黄嘌呤核苷鸟嘌呤核苷尿嘧啶核苷胞嘧啶核苷   5’-次黄嘌呤核苷酸5’-鸟嘌呤核苷酸5’-尿嘧啶核苷酸5’-胞嘧啶核苷酸     2.601.901.300.98
实施例3使用来源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶样品以各种磷
       酸化合物为磷酸供体生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将次黄嘌呤核苷2g/dl和作为磷酸供体的三聚磷酸钠、聚磷酸钠(商品名：Polygon P，千代田化学(株)制品)、磷酸苯酯二钠或氨甲酰磷酸二钠10g/dl溶解在乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中加入实施例1中制备的酶样品至50单位/dl，将pH维持在pH4.0，在30℃反应3小时。反应中生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量如表3所示。
不管使用哪种磷酸供体都能有效地生成和积累5’-次黄嘌呤核苷酸，但在以聚磷酸钠作磷酸供体时，5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量最高。
                         表3
  磷酸供体 生成的5’-次黄嘌呤核苷酸(g/dl)
  三聚磷酸钠聚磷酸钠磷酸苯酯二钠氨甲酰磷酸钠              2.102.722.332.54
实施例4来源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶的纯化和性质
将50ml含有蛋白胨1g/dl、酵母抽提物0.5g/dl和氯化钠1g/dl的营养培养基(pH7.0)加入500ml的坂口瓶中，在120℃加热灭菌20分钟。在瓶中接种一白金耳蟑螂埃希氏菌JCM1650的斜面培养物，在30℃振荡培养16小时。离心培养液回收菌体，将此菌体约3,300g悬浮于1L的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，在4℃进行超声波处理20分钟破碎菌体。离心除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。
在此无细胞抽提液中加入硫酸铵至30％饱和。离心除去生成的沉淀，然后在上清液中继续加入硫酸铵至60％饱和。离心收集生成的沉淀，并溶解在100mM的磷酸钾缓冲液中。
这种粗酶液用5L的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析四次，然后上样至用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopearl650M柱(6.2×35cm)中，并用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱，磷酸转移活性存在于通过的组分中，回收该组分。
在此活性组分中加入硫酸铵至35％饱和，并用含有35％饱和硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopearl柱(5.0×22.5cm)吸附。用35％饱和至20％饱和的磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性梯度进行洗脱。
收集活性组分，用1L的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，然后用100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(3.0×7.0cm)吸附。用50mM至100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性梯度进行洗脱，收集活性组分。
将此酶液用1L的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)透析，然后用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)平衡的CM-Toyopearl柱(2.0×14.0cm)吸附。用含有0mM至300mM的氯化钾的磷酸钾缓冲液(pH6.0)的线性梯度进行洗脱，收集活性组分。
按照上述操作，最终从无细胞抽提液中得到了纯化约600倍的显示磷酸转移活性的酶，回收率约为16％。此纯化过程中的比活性和回收率如表4所示。此酶样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中是均一的。
                                        表4
       过程 总活性(单位)   总蛋白(mg)       比活性(单位/mg)  回收率(％)
1.无细胞抽提液2.硫酸铵分级(30～60％)3.DEAE-Toyopearl4.Butyl-Toyopearl5.羟基磷灰石6.CM-Toyopearl   3653403182329659   160,650138,89530,4406619643        0.0020.0020.0100.3471.0001.365    1009387632616
纯化后的酶具有以下性质。
(1)作用：将磷酸从聚磷酸等磷酸供体转移至核苷，生成核苷-5’-磷酸酯。也显示逆向的磷酸酯水解作用。
(2)底物特异性：在磷酸转移反应中，可以用作磷酸供体的有：焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、磷酸苯酯二钠、磷酸苯酯二钾、O，O-缩水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂等。可作为磷酸受体的有：嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、和胞嘧啶核苷等。另一方面，可在磷酸酯水解反应中接受作用的有：焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等无机磷酸；磷酸苯酯二钠、磷酸苯酯二钾、O，O-缩水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂等磷酸酯；以及5’-嘌呤核苷酸、5’-次黄嘌呤核苷酸、5’-鸟嘌呤核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸、5’-黄嘌呤核苷酸、5’-尿嘧啶核苷酸、5’-胞嘧啶核苷酸等5’-核苷酸。
(3)最适pH：5.2(磷酸转移反应)、6.5(磷酸酯水解反应)
(4)pH稳定性：pH3.5～12.0(30℃、处理60分钟)
(5)最适温度：35℃左右
(6)温度稳定性：至40℃稳定(pH7.0、处理30分钟)
(7)金属离子和抑制剂的影响：本酶的活性在加入金属离子时，不会出现活化现象，Fe2+、Ag2+、Pb2+、Hg2+和Cu2+会抑制本酶的活性，而且碘乙酸也会抑制本酶的活性。
(8)分子量：用高效液相色谱(TSKgel G-3000SW，Toyo Soda公司出品)计算出的分子量约为188,000。
(9)亚单位分子量：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳计算出的亚单位分子量约为24,500。
本酶与从摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的无细胞抽提液中纯化的酶一样，不仅有将磷酸基团转移至核苷的磷酸转移活性，还显示逆向的磷酸酯水解活性，而且本酶显示的磷酸酯水解活性比磷酸转移活性高30倍以上。因此，本酶显然是一种酸性磷酸酶。
将焦磷酸钠15g/dl和次黄嘌呤核苷3g/dl溶解在pH分别为5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的乙酸钠缓冲液中，在它们中加入上述酶样品至50单位/dl。分别维持各自的pH，在30℃反应6小时，测定随时间延续生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量。生成的次黄嘌呤核苷酸仅为5’-次黄嘌呤核苷酸，完全没有发现2’-次黄嘌呤核苷酸和3’-次黄嘌呤核苷酸副产物的生成。结果如图2所示。5’-次黄嘌呤核苷酸的生成速率在pH5.0时达到最大，5’-次黄嘌呤核苷酸的最大积累量随pH的降低而升高。5’-次黄嘌呤核苷酸的生产在pH4.0的反应条件下最有效率，在30℃、pH4.0的条件下反应3小时能生成积累1.56g/dl的5’-次黄嘌呤核苷酸。
实施例5使用来源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶样品对各种核
                  苷进行的磷酸化反应
将焦磷酸钠15g/dl与次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷3g/dl溶解在乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中加入实施例4的酶样品至50单位/dl，将pH维持在pH4.0，在35℃反应3小时。所生成的核苷-5’-酯的量如表5所示。
生成的核苷酸仅为核苷-5’-酯，完全没有发现核苷-2’-酯和核苷-3’-酯的生成。
                         表5
    核苷       生成物   生成量(g/dl)
次黄嘌呤核苷鸟嘌呤核苷尿嘧啶核苷胞嘧啶核苷   5’-次黄嘌呤核苷酸5’-鸟嘌呤核苷酸5’-尿嘧啶核苷酸5’-胞嘧啶核苷酸     1.561.051.871.22
实施例6使用来源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶样品以各种磷
        酸化合物为磷酸供体生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将次黄嘌呤核苷2g/dl和作为磷酸供体的三聚磷酸钠、聚磷酸钠(商品名：Polygon P，千代田化学(株)出品)、磷酸苯酯二钠或氨甲酰磷酸二钠10g/dl溶解在乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中加入实施例4中制备的酶样品至50单位/dl，将pH维持在pH4.0，在35℃反应3小时。生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量如表6所示。
不管使用哪种磷酸供体都能有效地生成和积累5’-次黄嘌呤核苷酸，在以聚磷酸钠作磷酸供体时，5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量最高。
                       表6
  磷酸供体   生成的5’-次黄嘌呤核苷酸(g/dl)
  三聚磷酸钠聚磷酸钠磷酸苯酯二钠氨甲酰磷酸二钠           1.201.791.501.53
实施例7从摩氏摩根氏菌的染色体中分离编码酸性磷
                 酸酶的基因
(1)N末端氨基酸序列的测定
按照实施例1记载的方法从摩氏摩根氏菌NCIMB10466的无细胞抽提液中纯化的酸性磷酸酶，用DITC膜(Milligen/Biosearch公司生产)吸附，使用Prosequencer6625(Milligen/Biosearch公司生产)确定N末端的氨基酸序列。测得序列表序列编号1中所示的20个残基的N末端氨基酸序列。
(2)分离含有编码酸性磷酸酶的基因的DNA片断
按照Murray和Thomson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8页(1980))从摩氏摩根氏菌NCIMB10466的培养菌体中制备染色体DNA。用限制酶Sau3AI部分消化此染色体DNA，然后用蔗糖密度梯度离心法分离3～6kbp的DNA片断。将质粒载体pUC118(宝酒造社生产)用限制酶BamHI切断，与部分消化的染色体DNA片断连接。DNA连接使用DNA连接试剂盒(宝酒造社生产)，并按其指定的方法进行。接着，将得到的DNA混合物按常规方法转化大肠杆菌JM109(宝酒造社生产)。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上繁殖，制备成基因文库。
在转化子繁殖的琼脂培养基表面倒入含有4mM对硝基苯磷酸和100mM MES/NaOH缓冲液(pH6.5)的反应液，在30℃保温15分钟。表达磷酸酶活性的细菌能释放出对硝基苯呈黄色，以此为指标选择转化子。对含有约20,000株转化子的基因表达文库进行筛选，结果获得了30株表达磷酸酶活性的转化子。
对表达磷酸酶活性的30株转化子进行单菌落分离，并接种于2.5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中，在37℃培养16小时。从培养液中收集菌体，并向其中加入含有次黄嘌呤核苷2g/dl和焦磷酸钠10g/dl的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)50μl，在30℃反应16小时。用HPLC分析法检测5’-次黄嘌呤核苷酸的生成，选择带有磷酸转移活性的菌株。结果获得了5株能显示磷酸转移活性、预计携带有含编码目的酸性磷酸酶的基因的DNA片断的转化子。
实施例8来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因
               的碱基序列的测定
从一株实施例7中获得的预计携带有含来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因的DNA片断的转化子中，用碱溶菌法(《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Cold Spring Harbour Laboratory Press，25页(1989))制备质粒，对插入的DNA片断进行分析。并将此质粒命名为pMPI501。所测定的插入DNA片断的限制酶图谱如图3所示。
进一步用亚克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的区域，结果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶HindIII和限制酶EcoRI切割产生的1.2kbp大小的片断中。因此，为测定碱基序列，将此1.2kbp的片断结合到用HindIII和EcoRI切割的pUC118中构建质粒DNA。将此质粒DNA命名为pMPI505并用常规方法转化大肠杆菌JM109(宝酒造(社)生产)，然后涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基中获得转化子。
用碱溶菌法从携带pMPI505的大肠杆菌JM109(宝酒造生产)转化子中制备质粒，进行碱基序列的测定。碱基序列的测定使用TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biochemical公司生产)按照Sanger等的方法(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，143卷，161页(1980))进行。所测定的开放阅读框的碱基序列参见序列表序列编号2。而且，由此碱基序列推导的蛋白质的氨基酸序列参见序列表序列编号3。在此氨基酸序列中存在与纯化的酶的N末端氨基酸序列完全一致的序列。纯化的酶的N末端从序列编号3中显示的序列的第21位丙氨酸残基开始，因此序列编号3中所示的氨基酸序列是前体蛋白质的序列，可以认为由第1位的甲硫氨酸残基至第20位的丙氨酸残基组成的肽在翻译后被除去。由此推导出的成熟蛋白质的氨基酸序列参见序列编号4。由氨基酸序列计算出预计的成熟蛋白质的分子量为24.9千道尔顿，这和纯化的酶的SDS-PAGE的结果一致。由上述结果以及携带含有本片断的质粒的转化子均显示磷酸转移活性，可以确定本开放阅读框是编码目的酸性磷酸酶的区域。
分别用碱基序列和氨基酸序列与已知序列进行同源性比较，使用的数据库是EMBL和SWISS-PORT。比较的结果为，序列表序列编号2中所示的碱基序列与已知的来源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因(Thaller，M.C.等，《微生物学》(Microbiology)，140卷，1341页(1994))，除了第54位的G是A、第72位的G是A、第276位的T是G、第378位的T是C、第420位的G是T、第525位的C是G、第529位的C是T、第531位的G是A之外，序列一致，而且证明，序列表序列编号4中所示的氨基酸序列与来源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶是相同的。即，编码由序列表序列编号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，是摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因。
并且，前体蛋白质由249个氨基酸组成，由此序列预计的蛋白质的分子量为27.0千道尔顿。
携带pMPI505的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ13143，并于平成8年2月23日(1996年2月23日)交与工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本茨城县筑波市东一丁目1番3号)依据布达佩斯条约进行了国际保藏，给予的保藏编号是FERM BP-5422。
实施例9通过表达来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷
             酸酶基因来增加其活性
将实施例8中构建的大肠杆菌JM109/pMPI505接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。从该培养液中离心收集菌体，用生理盐水洗涤一次。用5ml的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)悬浮菌体，在4℃进行超声波处理20分钟破碎菌体。离心处理液除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。
测定所获得的无细胞抽提液的磷酸转移活性，用质粒pUC118按同样方法转化的大肠杆菌JM109及摩氏摩根氏菌野生株制备的无细胞抽提液的活性作为对照，结果如表7所示。在大肠杆菌JM109/pUC118中没有检测到磷酸转移活性，在摩氏摩根氏菌野生株中磷酸转移活性也很低。另一方面，大肠杆菌JM109/pMPI505显示的磷酸转移比活性比摩氏摩根氏菌野生株高150倍，这一结果显示，导入的DNA片断在大肠杆菌中能够高水平地表达酸性磷酸酶。
                           表7
  菌株     磷酸转移活性(单位/mg)
  摩氏摩根氏菌NCIMB10466大肠杆菌JM109/pUC118大肠杆菌JM109/pMPI505            0.008未检出1.250
实施例10使用携带有来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性
磷酸酶基因的菌株由次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将焦磷酸钠12g/dl和次黄嘌呤核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中按干燥菌体重量100mg/dl加入上述大肠杆菌JM109/pMPI505的菌体。将pH维持在4.0，在30℃反应6小时，测定随时间延续生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量。生成的次黄嘌呤核苷酸仅为5’-次黄嘌呤核苷酸，完全没有发现2’-次黄嘌呤核苷酸和3’-次黄嘌呤核苷酸副产物的生成。结果参见图4。酸性磷酸酶基因携带菌株能表达显著量的酸性磷酸酶，使用这种菌株由焦磷酸和次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸的反应非常有效，能在短时间内生产和积累5’-次黄嘌呤核苷酸。但是，随着反应时间的延续，生成积累的5’-次黄嘌呤核苷酸会因降解而减少。
实施例11磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的制备
如实施例9和10所示，携带酸性磷酸酶基因的菌株能够表达显著量的酸性磷酸酶，使用这种菌株由焦磷酸和次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸的反应非常有效，能在短时间内生产和积累5’-次黄嘌呤核苷酸。但是，也证明生成的5’-次黄嘌呤核苷酸由于酸性磷酸酶自身有磷酸酯水解活性而受到降解，5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量不会超过一定的程度。因此，对实施例7中克隆的、来源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因，用PCR法按照位点特异的突变方法使之突变，进行酶的改造。
使用DNA合成仪(Applied Biosystem公司生产，394型)按照磷亚酰胺法分别合成含有序列表序列编号5、6和7中所示序列的寡核苷酸MUT500、MUT510和MUT520。
使用实施例8中制备的质粒pMPI5051ng作为模板、M13引物-RV(宝酒造社生产)和MUT510寡核苷酸各2.5μmol作为引物、以及Taq DNA聚合酶(宝酒造社生产)2.5单位，在100μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化钾50mM和氯化镁1.5mM的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中加入上述物质，使用94℃，30秒、55℃，2分钟、72℃，3分钟的循环参数，进行25个循环的PCR反应。PCR使用PJ2000型热循环仪(宝酒造社生产)进行。另外，使用质粒DNA pMPI5051ng作为模板、M13引物-M4(宝酒造社生产)和MUT500寡核苷酸各2.5μmol作为引物，按同样的条件进行PCR反应。每次的反应液用Microspin柱S-400(Pharmacia公司生产)凝胶过滤进行纯化，以除去引物。
在95μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化钾50mM和氯化镁1.5mM的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中分别加入每种PCR反应液1ul，在94℃加热10分钟，然后冷却60分钟至37℃，然后在37℃保温15分钟使异源双链形成。加入Taq DNA聚合酶2.5单位在72℃反应3分钟，使异源双链完成。接着，在此反应液中加入M13引物-RV和M13引物-M4各2.5μmol，使用94℃，30秒、55℃，2分钟、72℃，3分钟的循环参数，进行10个循环的PCR反应。
第二轮PCR反应的产物用HindIII和EcoRI切割，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。将此DNA片断连接到用HindIII和EcoRI切割的pUC118中，所得到的质粒DNA按常规方法转化大肠杆菌JM109(宝酒造生产)。并将其涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的L琼脂培养基上，获取转化子。用碱溶菌法从转化子中制备质粒，进行碱基序列的测定以证实目的碱基已被置换。碱基序列的测定使用Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biochemical生产)按照Sanger等的方法(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，143卷，161页(1980))进行。由此制备了编码成熟蛋白质第72位的甘氨酸残基(GGT)被天冬氨酸残基(G*AT)置换的突变型酸性磷酸酶的突变型基因。含有这种突变型基因的质粒命名为pMPI510。
使用pMPI505作为模板、MUT500和MUT520寡核苷酸作为引物，按照同样的操作，制备了编码成熟蛋白质第151位的异亮氨酸残基(ATC)被苏氨酸残基(A*CC)置换的突变型酸性磷酸酶的突变型基因。含有这种突变型基因的质粒命名为pMPI520。继而使用pMPI510作为模板，MUT500和MUT520寡核苷酸作为引物，按照同样的操作制备了编码成熟蛋白质的第72位的甘氨酸残基(GGT)被天冬氨酸残基(G*AT)置换、第151位的异亮氨酸残基(ATC)被苏氨酸残基(A*CC)置换的突变型酸性磷酸酶的突变型基因。含有这种突变型基因的质粒命名为pMPI530。
将导入了上述含有各种突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pMPI510、大肠杆菌JM109/pMPI520、大肠杆菌JM109/pMPI530和导入了含有野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pMPI505接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。从培养液中离心收集菌体，用生理盐水洗涤一次。菌体用5ml的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)悬浮，在4℃超声波处理20分钟破碎菌体。离心处理液除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。在pH4.0的条件下测定所得到的无细胞抽提液的磷酸酯水解活性和磷酸转移活性，并与野生型菌株的活性进行比较。
野生型和突变型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性和磷酸转移活性的测定结果列于表8。突变型酸性磷酸酶与野生型酸性磷酸酶相比，磷酸酯水解活性和磷酸转移活性都降低，磷酸酯水解活性降低的程度更大，结果，突变型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性/磷酸转移活性的比值低于野生型酸性磷酸酶的比值。
                               表8
   质粒 磷酸酯水解活性(单位/mg) 磷酸转移活性(单位/mg) 水解活性/转移活性(相对值)
  pMPI505pMPI510pMPI520pMPI530     5.910.592.241.07     0.6250.0900.5830.318     9.45(100)6.55(69)3.84(40)3.36(35)
实施例12使用携带有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的
      菌株由次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将导入了含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pMPI510、大肠杆菌JM109/pMPI520、大肠杆菌JM109/pMPI530和导入了含有野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pMPI505分别接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。
将焦磷酸钠12g/dl和次黄嘌呤核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中按干燥菌体重量100mg/dl加入上述培养获得的大肠杆菌各菌株的菌体。将pH维持在4.0，在30℃反应22小时，测定随时间延续生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量。结果如图5所示。
在图5中，纵轴代表5’-次黄嘌呤核苷酸的浓度(mg/dl)，横轴代表反应时间(h)，而实心圆形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pMPI505，实心三角形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pMPI510，空心圆形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pMPI520，空心四角形代表大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pMPI530，以此表示使用各菌时反应的进程。
在使用携带磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株由次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸的反应中，所生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的分解速率降低，其结果，5’-次黄嘌呤核苷酸的收率和积累量升高。第72位的甘氨酸和第151位的异亮氨酸分别被天冬氨酸和苏氨酸置换的突变型酸性磷酸酶基因的携带菌株大肠杆菌JM109/pMPI530的5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量最高。
实施例13使用携带有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的
         菌株生产各种核苷-5’-磷酸酯
将导入了含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pMPI530接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。
将焦磷酸钠12g/dl及用作磷酸受体的次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，在其中按干燥菌体重量100mg/dl加入上述菌体。将pH维持在4.0，30℃反应22小时，生成的核苷-5’-磷酸酯的量列于表9。生成的核苷酸仅为核苷-5’-磷酸酯，完全没有发现核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯。
                             表9
      核苷     生成物     生成量(g/dl)
    次黄嘌呤核苷鸟嘌呤核苷尿嘧啶核苷胞嘧啶核苷   5’-次黄嘌呤核苷酸5’-鸟嘌呤核苷酸5’-尿嘧啶核苷酸5’-胞嘧啶核苷酸       10.016.7211.907.82
实施例14使用携带磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌
     株以各种磷酸化合物为磷酸供体生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将导入了含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pMPI530接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，37℃培养16小时。
将次黄嘌呤核苷6g/dl和作为磷酸供体的三聚磷酸钠、聚磷酸钠(商品名：Polygon P，千代田化学(株)出品)、磷酸苯酯二钠或氨甲酰磷酸二钠10g/dl溶解在乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，在其中按干燥菌体重量100mg/dl加入上述菌体。将pH维持在4.0，在30℃反应22小时。生成的核苷-5’-磷酸酯的量列于表10。不管使用哪种磷酸供体都能有效地生成和积累5’-次黄嘌呤核苷酸，在以聚磷酸作磷酸供体时，5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量最高。
                          表10
    磷酸供体 生成的5’-次黄嘌呤核苷酸(g/dl)
    三聚磷酸钠聚磷酸钠磷酸苯酯二钠氨甲酰磷酸二钠            8.9311.459.629.89
实施例15从蟑螂埃希氏菌的染色体中分离编码酸性磷酸酶的基
                       因
(1)N末端氨基酸序列的测定
从蟑螂埃希氏菌JCM1650的无细胞抽提液中纯化的酸性磷酸酶，用DITC膜(Milligen/Biosearch公司生产)吸附，使用Prosequencer6625(Milligen/Biosearch公司生产)确定N末端的氨基酸序列。序列表序列编号8中所示的15个残基的N末端氨基酸序列得到了测定。
(2)编码酸性磷酸酶的基因片断的分离
按照Murray和Thomson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8页(1980))从蟑螂埃希氏菌JCM1650的培养菌体中制备染色体DNA。用限制酶Sau3AI部分消化此染色体DNA，然后用蔗糖密度梯度离心法分离3～6kbp的DNA片断。将质粒载体pUC118(宝酒造社生产)用限制酶BamHI切断，与部分消化的染色体DNA片断连接。DNA连接使用DNA连接试剂盒(宝酒造社生产)，并按其指定的方法进行。接着，将得到的DNA混合物按常规方法转化大肠杆菌JM109(宝酒造社生产)。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上繁殖，制备成基因文库。
在转化子繁殖的琼脂培养基表面倒入含有4mM对硝基苯磷酸和100mM MES/NaOH缓冲液(pH6.5)的反应液，在30℃保温15分钟。表达磷酸酶活性的细菌能释放出对硝基苯并显黄色，以此为指标选择转化子。对含有约8,000株转化子的染色体基因表达文库进行筛选，结果获得了14株表达磷酸酶活性的转化子。
对表达磷酸酶活性的14株转化子进行单菌落分离，并接种于2.5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中，在37℃培养16小时。从培养液中收集菌体，并向其中加入50μl含有次黄嘌呤核苷2g/dl和焦磷酸钠10g/dl的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)，在30℃反应16小时。用HPLC分析法检测5’-次黄嘌呤核苷酸的生成，选择带有磷酸转移活性的菌株。结果获得了3株能显示磷酸转移活性、预计携带有目的酸性磷酸酶基因片断的转化子。
实施例16来源于蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷酸酶基因的
             碱基序列的测定
从实施例15中获得的预计携带有含来源于蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷酸酶基因的DNA片断的一株转化子中，用碱溶菌法制备质粒，对插入的DNA片断进行分析。将此质粒命名为pEPI301。所测得的插入DNA片断的限制酶图谱如图6所示。
进一步用亚克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的区域，结果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶ClaI和BamHI切割产生的2.4kbp大小的片断中。因此，为测定碱基序列，将此片断结合到用ClaI和BamHI切割的pBluescript KS(+)(Stratagene公司生产)中构建质粒。将此质粒DNA命名为pEPI305，用常规方法转化大肠杆菌JM109(宝酒造生产)，然后涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的L琼脂培养基中获得转化子。
用碱溶菌法从携带pEPI305的大肠杆菌JM109(宝酒造生产)转化子中制备质粒，进行碱基序列的测定。所测定的开放阅读框的碱基序列参见序列表序列编号9。由此碱基序列推导的蛋白质的氨基酸序列参见序列表序列编号10。在此氨基酸序列中存在与纯化的酶的N末端氨基酸序列完全一致的序列。纯化的酶的N末端从序列编号10的序列的第19位的亮氨酸残基开始，因此序列编号10中所示的氨基酸序列是前体蛋白质的序列，可以认为由第1位的甲硫氨酸残基至第18位的丙氨酸残基组成的肽在翻译后被除去。由此推导出的成熟蛋白质的氨基酸序列参见序列编号11。由此计算出预计的成熟蛋白质的分子量为25.1千道尔顿，这和纯化的酶的SDS-PAGE的结果一致。由上述结果以及携带含有本片断的质粒的转化子能显示磷酸转移活性，可以确定本开放阅读框是编码目的酸性磷酸酶的区域。
即，编码由序列表序列编号11中所表示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因是蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷酸酶基因。
分别用碱基序列和氨基酸序列与下列已知序列进行同源性比较，使用的数据库是EMBL和SWISS-PORT。结果证明序列表序列编号8所示的蛋白质和编码它的DNA均为新型。该基因编码的前体蛋白质由249个氨基酸组成，由此序列预计的蛋白质的分子量为27.0千道尔顿。
将该蛋白质的氨基酸序列分别与下列已知序列进行同源性比较。结果为，该蛋白质显示与苏氏普罗威登氏菌(Providencia stuartii)的酸性磷酸酶有77.4％的同源性，与实施例8的摩氏厚根氏菌(Morganellamorganii)的酸性磷酸酶有77.1％的同源性，与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的酸性磷酸酶有44.3％的同源性。
并且，携带pEPI305的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ13144，并于平成8年2月23日(1996年2月23日)交与工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本茨城县筑波市东一丁目1番3号)依据布达佩斯条约进行了国际保藏，给予的保藏编号是FERM BP-5423。
实施例17通过表达来源于蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷酸酶
                基因来增加其活性
将实施例16中制成的大肠杆菌JM109/pEPI305接种于50ml含有氨苄青霉素100ug/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。离心培养液收集菌体，用生理盐水洗涤一次。用5ml的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)悬浮菌体，在4℃进行超声波处理20分钟破碎菌体。离心处理液除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。
测定所获得的无细胞抽提液的磷酸转移活性，用pBlueseript KS(+)按同样方法转化的大肠杆菌JM109及蟑螂埃希氏菌野生株制备无细胞抽提液的活性作为对照，结果如表11所示。在大肠杆菌JM109/pBluescript KS(+)中没有检测到磷酸转移活性，在蟑螂埃希氏菌野生株中磷酸转移活性也很低。另一方面，大肠杆菌JM109/pEPI305显示的磷酸转移比活性比蟑螂埃希氏菌野生株高120倍，这一结果显示，导入的DNA片断在大肠杆菌中能够高水平地表达酸性磷酸酶。
                                 表11
    菌株   磷酸转移活性(单位/mg)
 蟑螂埃希氏菌JCM1650大肠杆菌JM109/pBluescript KS(+)大肠杆菌JM109/pEPI305        0.002未检出0.264
实施例18使用携带有来源于蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷
酸酶基因的菌株由次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将焦磷酸钠12g/dl和次黄嘌呤核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中按干燥菌体重量200mg/dl加入上述大肠杆菌JM109/pEPI305的菌体。将pH维持在4.0，在35℃反应10小时，测定随时间延续生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量。生成的次黄嘌呤核苷酸仅为5’-次黄嘌呤核苷酸，完全没有发现2’-次黄嘌呤核苷酸和3’-次黄嘌呤核苷酸的生成。结果如图7所示。使用此菌株由焦磷酸和次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸的反应非常有效，能在短时间内生产和积累5’-次黄嘌呤核苷酸。
实施例19磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的制备
正如实施例17和18中所示，携带来源于蟑螂埃希氏菌JCM1650酸性磷酸酶基因的菌株能够表达显著量的酸性磷酸酶，使用这种菌株由焦磷酸和次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸的反应非常有效，能在短时间内生产和积累5’-次黄嘌呤核苷酸。但是，也证明生成的5’-次黄嘌呤核苷酸由于酸性磷酸酶自身有磷酸酯水解活性而受到降解，5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量不会超过某种程度。因此，在实施例15中克隆的来源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶基因中用PCR方法按照位点特异的突变方法导入突变，进行酶的改造。
使用DNA合成仪(Applied Biosystem公司生产，394型)按照磷亚酰胺法分别合成序列表序列编号12、13和14中所示的寡核苷酸MUT300、MUT310和MUT320。
使用实施例16中制备的质粒pEPI3051ng作为模板、M13引物-RV(宝酒造社生产)和MUT310寡核苷酸各2.5umol作为引物、以及Taq DNA聚合酶(宝酒造社生产)2.5单位，在100μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化钾50mM和氯化镁1.5mM的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中加入上述物质，使用94℃，30秒、55℃，2分钟、72℃，3分钟的循环参数，进行25个循环的PCR反应。PCR使用PJ2000型热循环仪(宝酒造社生产)进行。另外，使用质粒pEPI3051ng作为模板、M13引物-M3(宝酒造社生产)和MUT300寡核苷酸各2.5umol作为引物，按同样的条件进行PCR反应。各反应液用Microspin柱S-400(Pharmacia公司生产)凝胶过滤进行纯化，以除去引物。
在95μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化钾50mM和氯化镁1.5mM的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中分别加入每种PCR反应液1μl，在94℃加热10分钟，然后冷却60分钟至37℃，然后在37℃保温15分钟使异源双链形成。加入Taq DNA聚合酶2.5单位在72℃反应3分钟，使异源双链完成。接着，在此反应液中加入M13引物-RV和M13引物-M3各2.5μmol，使用94℃，30秒、55℃，2分钟、72℃，3分钟的循环参数，进行10个循环的PCR反应。
第二轮PCR反应的产物用ClaI和BamHI切割，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。将此DNA片断连接到用ClaI和BamHI切割的pBluescript KS(+)中，所得到的质粒DNA按常规方法转化大肠杆菌JM109(宝酒造生产)。并将其涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的L琼脂培养基上，获取转化子。
用碱溶菌法从转化子中制备质粒，进行碱基序列的测定。证实目的碱基已被置换。由此制备了编码成熟蛋白质第74位的甘氨酸残基(GGG)被天冬氨酸残基(G*A*T)置换的突变型酸性磷酸酶的突变型基因。含有这种突变型基因的质粒命名为pEPI310。
使用pEPI305作为模板、MUT300和MUT320寡核苷酸作为引物，按照同样的操作，制备了编码成熟蛋白质第153位的异亮氨酸残基(ATC)被苏氨酸残基(A*CC)置换的突变型酸性磷酸酶的突变型基因。含有这种突变型基因的质粒命名为pEPI320。并且，使用pEPI310作为模板，MUT300和MUT320作为引物按照同样的操作制备了编码成熟蛋白质的第74位的甘氨酸残基(GGG)被天冬氨酸残基(G*A*T)置换、第153位的异亮氨酸残基(ATC)被苏氨酸残基(A*CC)置换的突变型酸性磷酸酶的基因。含有这种突变型基因的质粒命名为pEPI330。
将导入了上述含有各酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI310、大肠杆菌JM109/pEPI320、大肠杆菌JM109/pEPI330和导入了含有野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。离心培养液收集菌体，用生理盐水洗涤一次。菌体用5ml的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)悬浮，在4℃超声波处理20分钟破碎菌体。离心处理液除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。在pH4.0的条件下测定所得到的无细胞抽提液的磷酸酯水解活性和磷酸转移活性，并与野生型菌株的活性进行比较。
野生型和突变型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性和磷酸转移活性的测定结果如表12所示。突变型酸性磷酸酶与野生型酸性磷酸酶相比，磷酸酯水解活性和磷酸转移活性都较低，且磷酸酯水解活性降低的程度大一些，结果，突变型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性/磷酸转移活性的比值低于野生型酸性磷酸酶的比值。
                              表12
  质粒 磷酸酯水解活性(单位/mg)   磷酸转移活性(单位/mg) 水解活性/转移活性(相对值)
 pEPI305pEPI310pEPI320pEPI330     2.380.260.880.42     0.1320.0190.1230.070     18.03(100)13.68(76)7.15(39)6.00(33)
实施例20使用携带有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的
       菌株由次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将导入了含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI310、大肠杆菌JM109/pEPI320、大肠杆菌JM109/pEPI330和导入了含有野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，37℃培养16小时。
将焦磷酸钠12g/dl和次黄嘌呤核苷6g/dl溶解在乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中按干燥菌体重量200mg/dl加入上述培养获得的大肠杆菌各菌株的菌体。将pH维持在4.0，在35℃反应32小时，测定随时间延续生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的量。结果如图8所示。
在图8中，纵轴代表5’-次黄嘌呤核苷酸的浓度(mg/dl)，横轴代表反应时间(h)，而实心圆形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI305，实心三角形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI310，空心圆形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI320，空心四角形代表大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI330，以此来显示使用各菌时的反应进程。
在使用携带磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株由次黄嘌呤核苷生产5’-次黄嘌呤核苷酸的反应中，所生成的5’-次黄嘌呤核苷酸的分解速率降低，其结果是，5’-次黄嘌呤核苷酸的收率和积累量升高。第74位的甘氨酸和第153位的异亮氨酸分别被天冬氨酸和苏氨酸置换的突变型酸性磷酸酶基因的携带菌株-大肠杆菌JM109/pEPI330的5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量最高。
实施例21使用携带有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的
            菌株生产各种核苷-5’-磷酸酯
将导入了含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330接种于50ml含有氨苄青霉素100ug/ml和IPTG1mM的L培养基中，37℃培养16小时。
将焦磷酸钠12g/dl及用作磷酸受体的次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，在其中按干燥菌体重量200mg/dl加入上述菌体。将pH维持在4.0，在35℃反应32小时。生成的核苷-5’-磷酸酯的量列于表13。生成的核苷酸仅为核苷-5’-磷酸酯，完全没有发现核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯的生成。
                         表13
  核苷   生成物   生成量(g/dl)
  次黄嘌呤核苷鸟嘌呤核苷尿嘧啶核苷胞嘧啶核苷   5’-次黄嘌呤核苷酸5’-鸟嘌呤核苷酸5’-尿嘧啶核苷酸5’-胞嘧啶核苷酸     7.454.778.936.60
实施例22使用携带磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌
     株以各种磷酸化合物为磷酸供体生产5’-次黄嘌呤核苷酸
将导入了含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330接种于50ml含有氨苄青霉素100ug/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。
将次黄嘌呤核苷6g/dl和作为磷酸供体的三聚磷酸钠、聚磷酸钠(商品名：Polygon P，千代田化学(株)出品)、磷酸苯酯二钠或氨甲酰磷酸二钠12g/dl溶解在100mM的乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，在其中按干燥菌体重量200mg/dl加入上述菌体。将pH维持在4.0，在35℃反应32小时。生成的核苷-5’-磷酸酯的量如表14所示。不管使用哪种磷酸俱体都能有效地生成和积累5’-次黄嘌呤核苷酸，在以聚磷酸作磷酸供体时，5’-次黄嘌呤核苷酸的积累量最高。
                          表14
  磷酸供体 生成的5’-次黄嘌呤核苷酸(g/dl)
  三聚磷酸钠聚磷酸钠磷酸苯酯二钠氨甲酰磷酸二钠      5.968.847.607.73
实施例23从苏氏普罗威登氏菌的染色体中分离编码酸性磷酸酶
              的基因并测定其碱基序列
以已知的苏氏普罗威登氏菌的酸性磷酸酶基因的碱基序列(EMBL登记号X64820)为基础，合成含有序列表序列编号15和16中所示的序列的、设计用于PCR扩增该酸性磷酸酶基因的寡核苷酸引物PRP1和PRP2。
按照Murry和Thomson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8页(1980))从苏氏普罗威登氏菌ATCC29851的培养菌体中制备染色体DNA。使用这种染色体DNA 0.1ng作为模板、PRP1和PRP2寡核苷酸各2.5umol作为引物、以及Taq DNA聚合酶(宝酒造社生产)2.5单位，在100μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化钾50mM和氯化镁1.5mM的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中加入上述物质，使用94℃，30秒、55℃，2分钟、72℃，3分钟的循环参数，进行30个循环的PCR反应。对反应液进行琼脂糖电泳，并用玻璃粉(宝酒造社生产)回收约为1kbp的扩增DNA片断。用BamHI切割该DNA片断，然后将其结合到用BamHI切割的pUC118中，此质粒被命名为pPRP100。
测定导入了pPRP100的大肠杆菌JM109/pPRP100的磷酸酯水解活性和磷酸转移活性。结果为，该菌不仅显示磷酸酯水解活性，还显示向核苷转移磷酸的磷酸转移活性。
用碱溶菌法从大肠杆菌JM109/pPRP100中制备质粒，进行碱基序列的测定。所测定的开放阅读框的碱基序列和由此碱基序列推导出的蛋白质的氨基酸序列参见序列表序列编号17和序列编号18。这个开放阅读框的碱基序列和已知的苏氏普罗威登氏菌的酸性磷酸酶基因的碱基序列完全一致。
实施例24从产气肠杆菌、植生克雷伯氏菌、和无花果沙雷氏菌
 的染色体中分离编码酸性磷酸酶的基因并测定其碱基序列
按照Murry和Thompson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8页(1980))从产气肠杆菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO14939和无花果沙雷氏菌IAM13540的培养菌体中制备各菌的染色体DNA。接着，使用与实施例7(2)同样的方法，分别制成含有约20,000株大肠杆菌JM109转化子的染色体基因表达文库。筛选表达文库的结果，可获得显示磷酸转移活性的转化子。可以认为这些转化子携带有来源于各自菌株的酸性磷酸酶基因。
从一株被认为携带有来源于产气肠杆菌IFO12010的酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109转化子中用碱溶菌法制备质粒，对插入的DNA片断进行分析。将此质粒命名为pENP100。所确定的来源于产气肠杆菌IFO12010的插入DNA片断的限制酶图谱如图9所示。
用亚克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的区域，结果提示，该酸性磷酸酶包含在用限制酶Sal I和限制酶Kpn I切割产生的1.6kbp的片断中。因此，为测定碱基序列，将此Sal I-Kpn I片断结合到用Sal I和Kpn I切割的pUC118中构建质粒DNA。将此质粒命名为pENP110。
用同样的方法，从一株被认为携带有来源于植生克雷伯氏菌IFO14939的酸性磷酸酶基因片断的大肠杆菌JM109转化子中用碱溶菌法制备质粒，对插入的DNA片断进行分析。将此质粒命名为pKLP100。所确定的来源于植生克雷伯氏菌IFO14939的插入DNA片断的限制酶图谱如图10所示。
用亚克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的区域，结果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶Kpn I和限制酶EcoRI切割产生的2.2kbp的片断中。因此，为测定碱基序列，将此Kpn I-EcoRI片断结合到用Kpn I和EcoRI切割的pUC118中构建质粒DNA。将此质粒命名为pKLP110。
同样，从一株被认为携带有来源于无花果沙雷氏菌IAM 13540的酸性磷酸酶基因片断的大肠杆菌JM109转化子中用碱溶菌法制备质粒，对插入的DNA片断进行分析。将此质粒命名为pSEP100。所确定的来源于无花果沙雷氏菌IAM13540的插入DNA片断的限制酶图谱如图11所示。
用亚克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的区域，结果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶HindIII切割产生的1.4kbp的片断中。因此，为测定碱基序列，将此HindIII片断结合到用HindIII切割的pUC118中构建质粒DNA。将此质粒命名为pSEP110。
从分别导入了pENP110、pKLP110和pSEP110的大肠杆菌JM109/pENP110、大肠杆菌JM109/pKLP110和大肠杆菌JM109/pSEP110转化子中，用碱溶菌法分别制备质粒，按照实施例8的方法，测定插入片断的碱基序列。所确定的来源于产气肠杆菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO14939和无花果沙雷氏菌IAM13540的插入片断的开放阅读框的碱基序列分别参见序列表序列编号19、21、23，由它们推导出的氨基酸序列分别参见序列表序列编号20、22、24。由于携带含有各DNA片断的质粒的转化子显示磷酸转移活性，因此可以确定这些开放阅读框为目的酸性磷酸酶基因。
将碱基序列、氨基酸序列分别与下列已知序列进行同源性比较。使用的数据库是EMBL和SWISS-PORT。结果表明序列表序列编号19、21和23所示的基因都是新基因。而且，分别可以推导出，来源于产气肠杆菌IFO12010的基因编码的蛋白质由248个氨基酸组成，来源于植生克雷伯氏菌IFO14939的基因编码的蛋白质由248个氨基酸组成，来源于无花果沙雷氏菌IAM13540的基因编码的蛋白质由244个氨基酸组成。这些蛋白质与摩氏摩根氏菌和蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶的情况相同，可能是前体蛋白质。
另外，由这些碱基序列预计的蛋白质的氨基酸序列，与实施例8中推导出的摩氏摩根氏菌NCIMB10466、实施例16中推导出的蟑螂埃希氏菌JCM1650以及已知的苏氏普罗威登氏菌(EMBL登记号X64820)的酸性磷酸酶的前体蛋白质的氨基酸序列一起，用氨基酸的单字母表示法列于图12。在图中序列下加*号者表示在所有氨基酸序列中共同的氨基酸残基。
如图12所示，来源于6种菌株的酸性磷酸酶的氨基酸序列的同源性非常高，在所有氨基酸序列中有130个氨基酸残基是共同的。由此，预计这些酸性磷酸酶具有非常类似的功能。
实施例25通过表达来源于苏氏普罗威登氏菌、产气肠杆菌、植生克雷伯氏菌、和无花果沙雷氏菌的酸性磷酸酶基因来增加其活性
将实施例23中构建的大肠杆菌JM109/pPRP100、实施例24中构建的大肠杆菌JM109/pENP110、大肠杆菌JM109/pKLP110和大肠杆菌JM109/pSEP110分别接种于50ml含有氨苄青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培养基中，在37℃培养16小时。从离心培养液收集菌体，用生理盐水洗涤一次。用5ml的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)悬浮菌体，在4℃进行超声波处理20分钟破碎菌体。离心处理液除去不溶性组分，制备无细胞抽提液。
测定所获得的无细胞抽提液的磷酸转移活性，用苏氏普罗威登氏菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO14939、无花果沙雷氏菌IAM13540以及用pUC118按同样方法转化的大肠杆菌JM109制备无细胞抽提液，以它们的活性作为对照，结果列于表15。所有野生株的磷酸转移活性都很低。而在大肠杆菌JM109/pUC118中没有检测到磷酸转移活性。另一方面，导入了酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109转化子显示的磷酸转移活性全都比野生株高，这一结果显示，导入的DNA片断在大肠杆菌中能够高水平地表达酸性磷酸酶。
                        表15
菌株 磷酸转移活性(单位/mg)
苏氏普罗威登氏菌ATCC29851产气肠杆菌IFO12010植生克雷伯氏菌IFO14939无花果沙雷氏菌IAM13540大肠杆菌JM109/pUC118大肠杆菌JM109/pPRP100大肠杆菌JM109/pENP110大肠杆菌JM109/pKLP110大肠杆菌JM109/pSEP110     0.0060.0020.0020.001未检出0.8330.3010.2530.123
                    产业上的应用范围
根据本发明，使酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的条件下作用于核苷和选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)的磷酸供体，能够廉价而有效地制造核苷-5’-磷酸酯。特别是使用本发明所提供的含有使磷酸酯水解活性降低的突变的酸性磷酸酶，能够更有效地制造核苷-5’-磷酸酯。
                           序列表(1)一般信息(i)申请人：味之素株式会社(ii)发明名称：核苷-5’-磷酸酯的制造方法(iii)序列数：24(iv)通讯地址：
(A)联系人：
(B)街道：
(C)城市：
(D)州：
(E)国家：
(F)邮政编码：(v)计算机可读形式
(A)介质类型：
(B)计算机：
(C)操作系统：
(D)软件：(vi)现申请数据：
(A)申请编号：
(B)申请日：
(C)分类：(vii)代理人/事务所信息：
(A)姓名：
(B)登录编号：
(C)整理编号：(ix)通讯信息
(A)电话号码：
(B)传真号码：(2)序列编号1的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：20个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(v)片断类型：N末端片断(vi)来源：
(A)生物名：摩氏摩根氏(Morganella morganii)
(B)菌株名：NCIMB10466(xi)序列表述：SEQ ID NO：1：Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr1               5                  10                  l5Leu Lys Asn Glu
         20(2)序列编号2的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：750个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物名：摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)
(B)菌株名：NCIMB10466(ix)序列特征
(A)特征表示符号：CDS
(B)存在位置：1..747(ix)序列特征
(A)特征表示符号：sig_peptide
(B)存在位置：1..60(ix)序列特征
(A)特征表示符号：mat_peptide
(B)存在位置：61..747(xi)序列表述：SEQ ID NO：2：ATG AAG AAG AAT ATT ATC GCC GGT TGT CTG TTC TCA CTG TTT TCC CTT    48Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu-20                 -15                 -10                 -5TCC GCG CTG GCC GCG ATC CCG GCG GGC AAC GAT GCC ACC ACC AAG CCG    96Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
              1               5                  10GAT TTA TAT TAT CTG AAA AAT GAA CAG GCT ATC GAC AGC CTG AAA CTG    144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu
     15                  20                  25TTA CCG CCA CCG CCG GAA GTC GGC AGT ATT CAG TTT TTA AAT GAT CAG    192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln
 30                  35                  40GCA ATG TAT GAG AAA GGC CGT ATG CTG CGCAAT ACC GAG CGC GGA AAA     240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys45                  50                  55                  60CAG GCA CAG GCA GAT GCT GAC CTG GCC GCA GGG GGT GTG GCA ACC GCA    288Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala
             65                  70                  75TTT TCA GGG GCA TTC GGC TAT CCG ATA ACC GAA AAA GAC TCT CCG GAG    336Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu
         80                  85                  90CTG TAT AAA CTG CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGT GAT CTT GCC    384Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
     95                 100                 105ACC CGC TCC GCC AAA GAA CAT TAC ATG CGC ATC CGG CCG TTT GCG TTT    432Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
110                 115                 120TAC GGC ACA GAA ACC TGT AATACC AAA GAT CAG AAA AAA CTC TCC ACC     480Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr125                 130                 135                 140AAC GGA TCT TAC CCG TCA GGT CAT ACG TCT ATC GGC TGG GCA ACC GCA    528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
            145                 150                 155CTG GTG CTG GCG GAA GTG AAC CCG GCA AAT CAG GAT GCG ATT CTG GAA    576Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu
        160                 165                 170CGG GGT TAT CAG CTC GGA CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAT CAC TGG    624Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    175                 180                 185CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG ATT GTC GGT TCA GCC GCT GTC GCG    672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala
190                 195                 200ACA TTA CAT TCC GAT CCG GCA TTT CAG GCG CAG TTA GCG AAA GCC AAA    720Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys205                 210                 215                 220CAG GAA TTT GCA CAA AAA TCA CAG AAA TAA                            750Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys
            225             229(2)序列编号3的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：249个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)
(B)菌株名：NCIMB10466(xi)序列表述：SEQ ID NO：3：Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu-20                 -15                 -10                 -5Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
              1               5                  10Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu GlnAla Ile Asp Ser Leu Lys Leu
     15                  20                 25Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln
 30                  35                  40Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys45                  50                  55                  60Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val  Ala Thr Ala
             65                  70                   75Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu
         80                  85                  90Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
     95                 100                 105Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
110                 115                 120Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr125                 130                 135                 140Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
            145                 150                 155Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu
        160                 165                 170Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    175                 180                 185Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala
190                 195                 200Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys205                 210                 215                 220Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys
            225             229(2)序列编号4的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：229个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)
(B)菌株名：NCIMB10466
(xi)序列表述：SEQ ID NO：4：Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr1               5                  10                  15Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro
         20                  25                  30Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu
     35                  40                  45Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gln Ala Gln Ala
 50                  55                  60Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala65                  70                  75                  80Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu
             85                  90                  95Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
        100                 105                 110Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu
    115                 120                 125Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Ser Tyr
130                 135                 140Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala145                 150                 155                 160Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gln
            165                 170                 175Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val
        180                 185                 190Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser
    195                 200                 205Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Ala
210                 215                 220Gln Lys Ser Gln Lys225             229(2)序列编号5的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：20个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸合成DNA(iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：5：ATTACCATGATTACGAATTC        20(2)序列编号6的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：21个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸合成DNA  (iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：6：GCGGTTGCCAC ATCCCCTGC G            21(2)序列编号7的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：21个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸  合成DNA(iv)反义链(xi)序列表述：SEQ ID NO：7：TTGCCCAGCC GGTAGACGTA T            21(2)序列编号8的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：15个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(v)片断类型：N末端片断(vi)来源：
(A)生物名：蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)
(B)菌株名：JCM 1650(xi)序列表述：SEQ ID NO：8：Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu1               5                  10                  15(2)序列编号9的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：750个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物名：蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)
(B)菌株名：JCM1650(ix)序列特征：
(A)特征表示符号：CDS
(B)存在位置：1..747(ix)序列特征：
(A)特征表示符号：sig_peptide
(B)存在位置：1..54(ix)序列特征：
(A)特征表示符号：mat_peptide
(B)存在位置：55..747(xi)序列表述：SEQ ID NO：9：ATG AAA AAA CGT GTT CTG GCA GTT TGT TTT GCC GCA TTG TTC TCT TCT     48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser-18         -15                 -10                 -5CAG GCC CTG GCG CTG GTC GCT ACC GGC AAC GAC ACT ACC ACG AAA CCG     96Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro
    1               5                   10GAT CTC TAC TAC CTC AAG AAC AGT GAA GCC ATT AAC AGC CTG GCG CTG    144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu15                  20                  25                  30TTG CCG CCA CCA CCG GCG GTG GGC TCC ATT GCG TTT CTC AAC GAT CAG    192Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln
            35                  40                  45GCC ATG TAT GAA CAG GGG CGC CTG CTG CGC AAC ACC GAA CGC GGT AAG    240Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
        50                  55                  60CTG GCG GCG GAA GAT GCA AAC CTG AGC AGT GGC GGG GTG GCG AAT GCT    288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala
      65                70                  75TTC TCC GGC GCG TTT GGT AGC CCG ATC ACC GAA AAA GAC GCC CCG GCG    336Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala
80                  85                  90CTG CAT AAA TTA CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAC GCC GGG GAT CTG GCG    384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95                  100                 105                 110ACC CGC AGC GCG AAA GAT CAC TAT ATG CGC ATT CGT CCG TTC GCG TTT    432Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
            115                 120                 125TAT GGG GTC TCT ACC TGT AAT ACC ACC GAG CAG GAC AAA CTG TCC AAA    480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys
        130                 135                 140AAT GGC TCT TAT CCG TCC GGG CAT ACC TCT ATC GGC TGG GCT ACT GCG    528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
    145                 150                 155CTG GTG CTG GCA GAG ATC AAC CCT CAG CGC CAG AAC GAG ATC CTG AAA    576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys
160                  165                170CGC GGT TAT GAG CTG GGC CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAC CAC TGG    624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trpl75                 180                 185                 190CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG GTA GTG GGA TCT GCC GTT GTG GCG    672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala
            195                 200                 205ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCG TTC CAG CAG CAG TTG CAG AAA GCG AAG    720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys
        210                 215                 220GCC GAA TTC GCC CAG CAT CAG AAG AAA TAA                            750Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys
    225                 230(2)序列编号10的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：249个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)
(B)菌株名：JCM1650(xi)序列表述：SEQ ID NO：10：Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser-18         -15                 -10                 -5Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro
    1               5                   10Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu15                  20                  25                  30Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln
            35                  40                  45Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
        50                  55                  60Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala
    65                  70                  75Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala
80                  85                  90Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95                  100                 105                 110Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
            115                 120                 125Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys
        130                 135                 140Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
    145                 150                 155Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn GLu Ile Leu Lys
160                 165                 170Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175                 180                 185                 190Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala
            195                 200                 205Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys
        210                 215                 220Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys
    225                 230(2)序列编号11的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：231个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)
(B)菌株名：JCM1650(xi)序列表述：SEQ ID NO：11：Leu Ala Leu Val Ala Thr Gl y Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu1               5                   10                  15Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu Leu Pro
         20                  25                  30Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met
     35                  40                  45Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala
 50                  55                  60Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala Phe Ser65                  70                  75                  80Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala Leu His
             85                  90                  95Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg
        100                 105                 110Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly
    115                 120                 125Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys Asn Gly
130                 135                 140Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val145                 150                 155                 160Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Gly
            165                 170                 175Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser
        180                 185                 190Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala Thr Leu
    195                 200                 205His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys Ala Glu
210                 215                 220Phe Ala Gln His Gln Lys Lys225                 230(2)序列编号12的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：20个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸合成DNA(iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：12：CCTCGAGGTC GACGGTATCG           20(2)序列编号13的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：21个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸合成DNA(iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：13：ATTCGCCACA TCGCCACTGC  T       21(2)序列编号14的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：22个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型  (ii)序列种类：其它核酸合成DNA(iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：14：TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG       22(2)序列编号15的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：25个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸合成DNA(iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：15：CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT      25(2)序列编号16的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：25个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：其它核酸合成DNA(iv)反义链：(xi)序列表述：SEQ ID NO：16：CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA      25(2)序列编号17的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：747个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物名：苏氏普罗威登氏菌
(B)菌株名：ATCC29851(ix)序列特征
(A)特征表示符号：CDS
(B)存在位置：1..744(xi)序列表述：SEQ ID NO：17：ATG AAA AAA CTA TTA GCA GTA TTC TGC GCA GGG GCT TTT GTT TCA ACC     48Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr1               5                  10                  15AGT GTA TTT GCG GCG ATC CCT CCC GGC AAT GAT GTG ACA ACT AAA CCC     96Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro
         20                  25                  30GAT CTT TAT TAT TTA AAA AAC TCA CAG GCT ATT GAT AGT TTA GCG TTA    144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
     35                  40                  45TTG CCG CCA CCA CCT GAA GTG GGC AGT ATC TTA TTT TTA AAC GAC CAA    192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln
 50                  55                  60GCG ATG TAT GAA AAA GGC CGT TTA TTG CGA AAT ACT GAG CGT GGA GAA    240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu65                  70                  75                  80CAA GCC GCT AAG GAT GCT GAT CTG GCT GCG GGC GGT GTT GCG AAC GCA      288Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
             85                  90                  95TTT TCT GAA GCT TTT GGT TAT CCC ATT ACC GAA AAG GAT GCG CCT GAA      336Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu
        100                 105                 110ATT CAT AAA TTG CTG ACG AAT ATG ATT GAA GAT GCG GGG GAT TTA GCA      384Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
    115                 120                 125ACT CGC TCA GCC AAA GAG AAA TAC ATG CGC ATT CGT CCA TTT GCG TTC      432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130                 135                 140TAC GGT GTT GCT ACC TGT AAC ACG AAA GAT CAG GAC AAA TTA TCT AAG      480Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys145                 150                 155                 160AAT GGC TCT TAT CCT TCT GGA CAC ACC GCA ATT GGC TGG GCA TCT GCA      528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala
            165                 170                 175CTC GTA TTG TCA GAA ATT AAC CCA GAA AAC CAA GAT AAA ATT TTA AAA      576Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys
        180                 185                 190CGT GGT TAT GAA CTT GGC CAA AGC CGA GTC ATC TGT GGT TAC CAT TGG      624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    195                 200                 205CAA AGT GAT GTT GAT GCA GCT CGT ATC GTT GCA TCG GGT GCG GTA GCA      672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala
210                 215                 220ACT TTA CAC TCC AAC CCT GAA ITC CAA AAA CAG TTA CAA AAA GCC AAA      720Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys225                 230                 235                 240GAC GAA TTT GCT AAA CTG AAA AAA TAGAsp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys
            245(2)序列编号18的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：248个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：苏氏普罗威登氏菌
(B)菌株名：ATCC29851(xi)序列表述：SEQ ID NO：18：Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr1               5                  10                  15Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro
         20                  25                  30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
     35                  40                  45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln
 50                  55                  60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu65                  70                  75                  80Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
             85                  90                  95Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu
        100                 105                 110Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
    115                 120                 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130                 135                 140Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys145                 150                 155                 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala
            165                 170                 175Leu Val Leu Set Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys
        180                 185                 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    195                 200                 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala
210                 215                 220Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys225                 230                 235                 240Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys
            245(2)序列编号19的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：747个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物名：产气肠杆菌
(B)菌株名：IFO12010(ix)序列特征
(A)特征表示符号：CDS
(B)存在位置：1..744(xi)序列表述：SEQ ID NO：19：ATG AAA AAG CGC GTT CTC GCC CTC TGC CTC GCC AGC CTG TTT TCC GTT       48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1               5                  10                  15AAC GCT TTC GCG CTG GTC CCT GCC GGC AAT GAT GCA ACC ACC AAA CCG       96Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
         20                  25                  30GAT CTC TAT TAT CTG AAA AAT GCA CAG GCC ATC GAT AGT CTG GCG CTG      144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
     35                  40                  45TTG CCG CCG CCG CCG GAA GTT GGC AGC ATC GCA TTT TTA AAC GAT CAG      192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln
 50                  55                  60GCG ATG TAT GAG AAA GGA CGG CTG TTG CGC AAT ACC GAA CGT GGC AAG      240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65                  70                  75                  80CTG GCG GCT GAA GAT GCT AAC CTG AGC GCC GGC GGC GTC GCG AAT GCC      288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
             85                  90                  95TTC TCC AGC GCT TTT GGT TCG CCC ATC ACC GAA AAA GAC GCG CCG CAG      336Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln
        100                 105                 110TTA CAT AAG CTG CTG ACA AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGC GAT CTG GCC      384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
    115                 120                 125ACC CGC AGC GCG AAA GAG AAA TAT ATG CGC ATT CGC CCG TTT GCG TTC      432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130                 135                 140TAC GGC GTT TCA ACC TGT AAC ACT ACC GAG CAG GAC AAG CTG TCG AAA      480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145                 150                 155                 160AAC GGA TCT TAC CCT TCC GGC CAT ACC TCT ATC GGT TGG GCA ACC GCG    528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
            165                 170                 173CTG GTA CTG GCG GAG ATC AAT CCG CAG CGG CAA AAC GAA ATT CTC AAA    576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys
        180                 185                 190CGC GGC TAT GAA TTG GGC GAA AGC CGG GTT ATC TGC GGC TAT CAT TGG    624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    195                 200                 205CAG AGC GAT GTC GAT GCG GCG CGG ATA GTC GGC TCG GCG GTG GTG GCG    672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210                 215                 220ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCC TTC CAA CAG CAG TTG CAG AAA GCA AAG    720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225                 230                 235                 240GAT GAA TTC GCC AAA ACG CAG AAG TAA                                747Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys
            245(2)序列编号20的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：248个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：产气肠杆菌
(B)菌株名：IFO12010(xi)序列表述：SEQ ID NO：20：Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1               5                  10                  15Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
         20                  25                  30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
     35                  40                  45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln
 50                  55                  60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65                  70                  75                  80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
             85                  90                  95Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln
        100                 105                 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
    115                 120                 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130                 135                 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145                 150                 155                 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
            165                 170                 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys
        180                 185                 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    195                 200                 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210                 215                 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225                 230                 235                 240Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys
            245(2)序列编号21的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：747个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物名：植生克雷伯氏菌
(B)菌株名：IFO14939(ix)序列特征
(A)特征表示符号：CDS
(B)存在位置：1..744(xi)序列表述：SEQ ID NO：21：ATG AAA AAG CGT GTA CTC GCC CTT TGC CTT GCC AGC CTC TTT TCA GTTMet Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1               5                  10                  15AGC GCC TTT GCG CTG GTT CCC GCC GGC AAT GAT GCC ACC ACC AAG CCCSer Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
         20                  25                  30GAT CTC TAG TAT CTG AAA AAT GCC CAG GCC ATT GAG AGC CTG GCG CTGAsp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
     35                  40                  45TTG CCA CCG CCG CCG GAA GTG GGC AGC ATT GCG TTT TTA AAC GAT CAGLeu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln
 50                  55                  60GCG ATG TAT GAG AAA GGC CGT CTG CTG CGC GCC ACC GCC CGC GGC AAG      240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys65                  70                  75                  80TTG GCG GCA GAA GAT GCC AAC CTG AGC GCG GGT GGC GTG GCC AAC GCC      288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
             85                  90                  95TTC TCC GCA GCA TTC GGC TCC CCG ATC AGC GAA AAA GAC GCC CCG GCG      336Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala
        100                 105                 110CTG CAC AAA CTG CTC ACC AAC ATG ATT GAA GAC G CG GGC GAT CTG GCG      384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
    115                 120                 125ACC CGA GGC GCG AAA GAG AAG TAT ATG CGT ATT CGT CCG TTT GCC TTC       432Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130                 135                 140TAC GGC GTG TCC ACC TGC AAT ACC ACC GAA CAG GAT AAG CTG TCG AAA       480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145                 150                 155                 160AAC GGC TCC TAC CCT TCC GGA CAC ACC TCT ATC GGC TGC GCG ACC GCC       528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
            165                 170                 175CTG GTG CTG GCC GAA ATC AAC CCG CAG CGC CAG AAT GAG ATT CTC AAG       576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys
        180                 185                 190CGC GGC TAT GAG CTC GGT GAA AGT CGG GTG ATC TGC GGT TAC CAC TGG       624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    195                 200                 205CAG AGC GAT GTT GAC GCC GCG CGG ATT GTC GGC TCG GCG GTG GTT GCA      672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210                 215                 220ACC CTG CAT ACC AAT CCG GCC TTC CAG CAG CAG CTG CAA AAA GCC AAA    720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225                 230             235                     240GAC GAG TTT GCG AAA CAG CAG AAA TAG                                747Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys
            245(2)序列编号22的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：248个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：植生克雷伯氏菌
(B)菌株名：IFO14939(xi)序列表述：SEQ ID NO：22：Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1               5                  10                  15Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
          20                 25                  30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala I le Asp Ser Leu Ala Leu
     35                  40                   45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln
 50                  55                  60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys65                  70                  75                  80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
             85                  90                  95Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala
        100                 105                 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
    115                 120                 125Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130                 135                 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145                 150                 155                 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
            165                 170                 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys
        180                 185                 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
    195                 200                 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210                 215                 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225                 230                 235                 240Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys
            245(2)序列编号23的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：735个碱基
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物名：无花果沙雷氏菌
(B)菌株名：IAM13540(ix)序列特征
(A)特征表示符号：CDS
(B)存在位置：1..732(xi)序列表述：SEQ ID NO：23：ATG AAA AAA ATA TTA TTA GCC ACA TTA AGC TGC GCC GCG TTG ACG CAG    48Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln1               5                  10                  15TTT TCC TTT GCC GCC AAA GAT GTC ACT ACC CAC CCT GAG GTT TAT TTT    96Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe
         20                  25                  30CTG CAA GAA TCA CAG TCC ATC GAC AGC CTG GCA CTA TTG CCG CCG CCG    144Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro
     35                  40                  45CCG GCG ATG GAC AGC ATT GAT TTC CTG AAT GAC AAA GCG CAA TAC GAC    192Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp
 50                  55                  60GCC GGG AAA ATA GTG CGC AAT ACT CCG CGT GGC AAG CAG GCT TAT GAT    240Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp65                  70                  75                  80GAC GCC CAC GTT GCC GGG GAC GGC GTT GCC GCC GCA TTT TCC AAC GCC    288Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala
             85                  90                  95TTC GGC CTA GAA ATA GCC CAA CGG AAA ACG CCG GAG CTG TTT AAG CTG    336Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu
        100                 105                 110GTG ATG AAA ATG CGT GAA GAC GCC GGC GAT TTG GCG ACC CGC AGC GCC    384Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
    115                 120                 125AAA AAT CAC TAT ATG CGC ATT CGC CCC TTT GCG TTT TAT AAC GAA GCG    432Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala130                  135                 140ACC TGC CGA CCG GAC GAA GAA AGC ACC CTG TCG AAG AAC GGT TCT TAC    480Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr145                 150                 155                 160CCT TCC GGC CAT ACC ACC ATC GGC TGG GCG ACC GCG CTG GTG CTG GCT    528Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
            165                 170                 175GAA ATC AAC CCC GCC AGG CAG GGT GAA ATC CTG CAG CGC GGC TAT GAT    576Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp
        180                 185                 190ATG GGC CAA AGC CGG GTT ATC TGC GGT TAT CAC TGG CAA AGC GAC GTG    624Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val
    195                 200                 205ACT GCG GCG CGC ATG GCG GCG TCG GCC ATG GTG GCG CGT TTG CAT GCC    672Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala
210                 215                 220GAA CCC ACC TTC GCC GCC CAG CTG CAA AAG GCC AAA GAC GAA TTC AAC    720Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn225                 230                 235                 240GGC CTG AAA AAG TAA                                                735Gly Leu Lys Lys(2)序列编号24的序列信息：(i)序列性质：
(A)序列长度：244个氨基酸
(B)序列类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线型(ii)序列种类：蛋白质(vi)来源：
(A)生物名：无花果沙雷氏菌
(B)菌株名：IAM13540(xi)序列表述：SEQ ID NO：24：Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Glnl               5                  10                  15Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe
         20                  25                  30Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro
     35                  40                  45Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp
 50                  55                  60Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp65                  70                  75                  80Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala
             85                  90                  95Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu
        100                 105                 110Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
    115                 120                 125Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala
130                 135                 140Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr145                 150                 155                 160Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
            165                 170                 175Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp
        180                 185                 190Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val
    195                 200                 205Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala
210                 215                 220Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn225             230                     235                 240Gly Leu Lys Lys

Claims (10)

1.一种核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其特征在于使酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的条件下作用于核苷和选自聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)和氨甲酰磷酸(盐)的磷酸供体，来生成核苷-5’-磷酸酯，并收集生成物。
2.权利要求1中记载的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中酸性磷酸酶含有序列表序列编号4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列，或者在这些氨基酸序列之一的序列中具有一个或多个氨基酸置换、缺失、插入或转移的氨基酸序列，并且所述序列具有磷酸酶活性。
3.权利要求1中记载的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中酸性磷酸酶含有序列表序列编号4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列或者在这些氨基酸序列之一的序列中具有一个或多个氨基酸置换、缺失、插入或转移的氨基酸序列，并且具有相当于序列表序列编号4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸残基和/或第151位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换的氨基酸置换，其具有磷酸酶活性，但磷酸酯水解活性降低。
4.权利要求3中记载的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中上述氨基酸置换是序列表序列编号4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸残基和/或第151位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换、序列表序列编号11中所示的氨基酸序列中第74位的甘氨酸残基和/或第153位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换、序列表序列编号18、20或22中所示的氨基酸序列中第92位的甘氨酸残基和/或第171位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换、序列表序列编号24中所示的氨基酸序列中第88位的甘氨酸残基和/或第167位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换。
5.一种突变酸性磷酸酶，含有序列表序列编号4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列或者在这些氨基酸序列之一的序列中具有一个或多个氨基酸置换、缺失、插入或转移的氨基酸序列，并且具有相当于序列表序列编号4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸残基和/或第151位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换的氨基酸置换，其具有磷酸酶活性，但磷酸酯水解活性降低
6.权利要求5中记载的突变型酸性磷酸酶，其中上述氨基酸置换是序列表序列编号4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸残基和/或第151位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换、序列表序列编号11中所示的氨基酸序列中第74位的甘氨酸残基和/或第153位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换、序列表序列编号18、20或22中所示的氨基酸序列中第92位的甘氨酸残基和/或第171位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换、序列表序列编号24中所示的氨基酸序列中第88位的甘氨酸残基和/或第167位的异亮氨酸残基被其它氨基酸残基置换。
7.含有序列表序列编号11、20、22和24中所示的任何一种氨基酸序列的酸性磷酸酶。
8.编码权利要求5-7任何一项中记载的酸性磷酸酶的基因。
9.含有权利要求8中记载的基因的重组DNA。
10.携带权利要求9中记载的重组DNA的微生物。
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