JP3180349B2 - ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法 - Google Patents
ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造
法に関する。また、本発明は、ヌクレオシド−５′−燐
酸エステルの製造において有用な新規な酸性フォスファ
ターゼ、該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、
該遺伝子を含む組換えDNA、該組換えDNAを保有する微生
物に関する。ヌクレオシド−５′−燐酸エステルは、調
味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
法に関する。また、本発明は、ヌクレオシド−５′−燐
酸エステルの製造において有用な新規な酸性フォスファ
ターゼ、該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、
該遺伝子を含む組換えDNA、該組換えDNAを保有する微生
物に関する。ヌクレオシド−５′−燐酸エステルは、調
味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
背景技術 ヌクレオシドを生化学的に燐酸化してヌクレオシド−
５′−燐酸エステルを製造する方法としては、燐酸供与
体として、パラニトロフェニル燐酸を用いる方法（特公
昭39−29858号）、無機燐酸を用いる方法（特公昭42−1
186号）、ポリ燐酸を用いる方法（特開昭53−56390
号）、アセチル燐酸を用いる方法（特開昭56−82098
号）、アデノシン三燐酸（ATP）を用いる方法（特開昭6
3−230094号）が知られている。しかしながら、これら
の方法にあっては使用する基質が高価であったり、反応
副生物が生じたりするために、安価かつ効率的にヌクレ
オシド−５′−燐酸エステルの生産を行うには満足のい
くものではなかった。
５′−燐酸エステルを製造する方法としては、燐酸供与
体として、パラニトロフェニル燐酸を用いる方法（特公
昭39−29858号）、無機燐酸を用いる方法（特公昭42−1
186号）、ポリ燐酸を用いる方法（特開昭53−56390
号）、アセチル燐酸を用いる方法（特開昭56−82098
号）、アデノシン三燐酸（ATP）を用いる方法（特開昭6
3−230094号）が知られている。しかしながら、これら
の方法にあっては使用する基質が高価であったり、反応
副生物が生じたりするために、安価かつ効率的にヌクレ
オシド−５′−燐酸エステルの生産を行うには満足のい
くものではなかった。
そこで、本発明者らは、特定の微生物菌体を、酸性条
件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐
酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択
される燐酸供与体に作用させることにより、２′−、
３′−ヌクレオチド異性体の副生を伴うことなく、ヌク
レオシド−５′−燐酸エステルを効率よく生成する方法
を開発した（特開平７−231793号）。
件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐
酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択
される燐酸供与体に作用させることにより、２′−、
３′−ヌクレオチド異性体の副生を伴うことなく、ヌク
レオシド−５′−燐酸エステルを効率よく生成する方法
を開発した（特開平７−231793号）。
しかしながら、この方法においても、使用する微生物
菌体にわずかながら存在するヌクレオシド分解活性のた
めに反応中に基質が一部分解され、また、反応を継続す
ると生成蓄積したヌクレオシド−５′−燐酸エステルが
分解するため、反応液中に副生物が生成するとともに、
十分な収率が得られなかった。さらに、菌体あたりの燐
酸転移活性が低いため、高濃度の基質を添加して反応を
行えない等の欠点があった。
菌体にわずかながら存在するヌクレオシド分解活性のた
めに反応中に基質が一部分解され、また、反応を継続す
ると生成蓄積したヌクレオシド−５′−燐酸エステルが
分解するため、反応液中に副生物が生成するとともに、
十分な収率が得られなかった。さらに、菌体あたりの燐
酸転移活性が低いため、高濃度の基質を添加して反応を
行えない等の欠点があった。
発明の開示 本発明の目的は、安価かつ効率的なヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの製造方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、ヌクレオシド−５′−燐酸
エステルの製造方法において有用な酵素、該酵素をコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含む組換えDNA及び該組換えD
NAを保有する微生物を提供することである。
５′−燐酸エステルの製造方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、ヌクレオシド−５′−燐酸
エステルの製造方法において有用な酵素、該酵素をコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含む組換えDNA及び該組換えD
NAを保有する微生物を提供することである。
本発明者らは、従来の方法よりも効率の良いヌクレオ
シド−５′−燐酸エステルの製造方法を開発するために
種々の検討を加えた結果、微生物の無細菌抽出液より精
製した酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌ
クレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）
及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐
酸供与体に作用させることにより、高収率で効率良くヌ
クレオシド−５′−燐酸エステルを生産することができ
ることを発見した。さらに、種々の細菌より酸性フォス
ファターゼをコードする野生型遺伝子を、モルガネラ属
細菌及びエシェリヒア属細菌より燐酸エステル加水分解
活性が低下した変異型酸性フォスファターゼをコードす
る遺伝子を取得することに成功し、遺伝子工学的手法に
より該遺伝子を大量発現させることによりヌクレオシド
−５′−燐酸エステルの生産性が飛躍的に向上すること
を見いだし、本発明を完成するに至った。
シド−５′−燐酸エステルの製造方法を開発するために
種々の検討を加えた結果、微生物の無細菌抽出液より精
製した酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌ
クレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）
及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐
酸供与体に作用させることにより、高収率で効率良くヌ
クレオシド−５′−燐酸エステルを生産することができ
ることを発見した。さらに、種々の細菌より酸性フォス
ファターゼをコードする野生型遺伝子を、モルガネラ属
細菌及びエシェリヒア属細菌より燐酸エステル加水分解
活性が低下した変異型酸性フォスファターゼをコードす
る遺伝子を取得することに成功し、遺伝子工学的手法に
より該遺伝子を大量発現させることによりヌクレオシド
−５′−燐酸エステルの生産性が飛躍的に向上すること
を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、酸性フォスファターゼ、好まち
くはヌクレオチダーゼ活性が低下した酸性フォスファタ
ーゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びにポリ燐
酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸
（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させ
てヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成せしめ、こ
れを採取することを特徴とするヌクレオシド−５′−燐
酸エステルの製造法を提供するものである。
くはヌクレオチダーゼ活性が低下した酸性フォスファタ
ーゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びにポリ燐
酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸
（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させ
てヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成せしめ、こ
れを採取することを特徴とするヌクレオシド−５′−燐
酸エステルの製造法を提供するものである。
また、本発明は、燐酸エステル加水分解活性が低下し
た変異型酸性フォスファターゼ、該酸性フォスファター
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えDNA、並
びに該組換えDNAを保有する微生物を提供するものであ
る。
た変異型酸性フォスファターゼ、該酸性フォスファター
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えDNA、並
びに該組換えDNAを保有する微生物を提供するものであ
る。
また、本発明は、エシェリヒア属、エンテロバクター
属細菌、クレブシエラ属細菌及びセラチア属細菌に由来
する新規酸性フォスファターゼ、これらをコードする遺
伝子、該遺伝子を含む組換えDNA、並びに該組換えDNAを
保有する微生物を提供するものである。
属細菌、クレブシエラ属細菌及びセラチア属細菌に由来
する新規酸性フォスファターゼ、これらをコードする遺
伝子、該遺伝子を含む組換えDNA、並びに該組換えDNAを
保有する微生物を提供するものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞酸性フォスファターゼの取得 本発明において使用される酸性フォスファターゼは、
pH3.0〜5.5の条件下で、ヌクレオシドへの、ポリ燐酸
（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）
よりなる群より選択される燐酸供与体からの、燐酸基の
転移によりヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成す
る反応を触媒するものであれば制限はない。このような
酸性ホスファターゼとしては、微生物に由来するものが
好ましく、特に好適な例として、モルガネラ属、エシェ
リヒア属、プロビデンシア属、エンテロバクター属、ク
レブシエラ属又はセラチア続に属する細菌が、当該酵素
活性を有しており、これら細菌に由来する酵素がある。
そのような細菌の代表例として以下のような菌株を挙げ
ることができる。
pH3.0〜5.5の条件下で、ヌクレオシドへの、ポリ燐酸
（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）
よりなる群より選択される燐酸供与体からの、燐酸基の
転移によりヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成す
る反応を触媒するものであれば制限はない。このような
酸性ホスファターゼとしては、微生物に由来するものが
好ましく、特に好適な例として、モルガネラ属、エシェ
リヒア属、プロビデンシア属、エンテロバクター属、ク
レブシエラ属又はセラチア続に属する細菌が、当該酵素
活性を有しており、これら細菌に由来する酵素がある。
そのような細菌の代表例として以下のような菌株を挙げ
ることができる。
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）NCIMB
10466 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO31
68 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO38
48 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）J
CM1650 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）A
TCC33429 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）A
TCC33430 プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stua
rtii）ATCC29851 プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stua
rtii）ATCC33672 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aer
ogenes）IFO12010 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aer
ogenes）IFO13534 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella plantic
ola）IFO14939 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella plantic
ola）IAM1133 セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）IAM13540 セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）IAM
12143 なお、酸性フォスファターゼ（EC3.1.3.2）は、本
来、燐酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触
媒する酵素であり、燐酸転移反応により生成するヌクレ
オシド−５′−燐酸エステルを分解するヌクレオチダー
ゼ活性（以下、「燐酸エステル加水分解活性」という）
を有している。本発明のヌクレオシド−５′−燐酸エス
テルの製造法においては、このような酸性フォスファタ
ーゼでも使用することができるが、高い収率でヌクレオ
シド−５′−燐酸エステルを得るためには、上記の細菌
が産生する野生型の酸性フォスファターゼに比べて燐酸
エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファ
ターゼ（以下、短に「変異型酸性フォスファターゼ」と
もいう）を使用することが望ましい。
10466 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO31
68 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO38
48 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）J
CM1650 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）A
TCC33429 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）A
TCC33430 プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stua
rtii）ATCC29851 プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stua
rtii）ATCC33672 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aer
ogenes）IFO12010 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aer
ogenes）IFO13534 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella plantic
ola）IFO14939 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella plantic
ola）IAM1133 セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）IAM13540 セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）IAM
12143 なお、酸性フォスファターゼ（EC3.1.3.2）は、本
来、燐酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触
媒する酵素であり、燐酸転移反応により生成するヌクレ
オシド−５′−燐酸エステルを分解するヌクレオチダー
ゼ活性（以下、「燐酸エステル加水分解活性」という）
を有している。本発明のヌクレオシド−５′−燐酸エス
テルの製造法においては、このような酸性フォスファタ
ーゼでも使用することができるが、高い収率でヌクレオ
シド−５′−燐酸エステルを得るためには、上記の細菌
が産生する野生型の酸性フォスファターゼに比べて燐酸
エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファ
ターゼ（以下、短に「変異型酸性フォスファターゼ」と
もいう）を使用することが望ましい。
変異型酸性フォスファターゼは、後述するように、酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子を直接変異させ
ることによって得られる変異型遺伝子を発現させること
によって得られるが、酸性フォスファターゼを産生する
微生物を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変
異に用いられている変異剤により処理し、燐酸エステル
加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼを
産生するようになった微生物を培養することによって
も、変異型酸性フォスファターゼを得ることができる。
性フォスファターゼをコードする遺伝子を直接変異させ
ることによって得られる変異型遺伝子を発現させること
によって得られるが、酸性フォスファターゼを産生する
微生物を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変
異に用いられている変異剤により処理し、燐酸エステル
加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼを
産生するようになった微生物を培養することによって
も、変異型酸性フォスファターゼを得ることができる。
上記のような微生物から酸性フォスファターゼ活性を
有する蛋白質を得るには、該活性を有する菌体を適当な
培地で培養し、増殖した菌体を回収し、当該菌体を破砕
して無細胞抽出液を調製して、これより必要に応じ精製
すればよい。
有する蛋白質を得るには、該活性を有する菌体を適当な
培地で培養し、増殖した菌体を回収し、当該菌体を破砕
して無細胞抽出液を調製して、これより必要に応じ精製
すればよい。
微生物を培養する培地には格別の制限はなく、通常の
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要ならば有機栄養源
を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコー
ス、シュクロース等の糖類、グリセロール等のアルコー
ル類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源として
は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシウム
イオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マン
ガンイオンその他の必要に応じ適宜使用される。有機栄
養源としては、ビタミン、アミノ酸等、又はこれらを含
有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティ
ープリカー、カゼイン分解物、大豆加水分解物等が適宜
用いられる。
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要ならば有機栄養源
を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコー
ス、シュクロース等の糖類、グリセロール等のアルコー
ル類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源として
は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシウム
イオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マン
ガンイオンその他の必要に応じ適宜使用される。有機栄
養源としては、ビタミン、アミノ酸等、又はこれらを含
有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティ
ープリカー、カゼイン分解物、大豆加水分解物等が適宜
用いられる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件
下にてpH5〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度
を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行なえばよ
い。
下にてpH5〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度
を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行なえばよ
い。
増殖した菌体は、遠心分離等により培養液から回収す
ることができる。回収した菌体から無細胞抽出液を調製
するには、通常の方法が用いられる。すなわち、菌体を
超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて
破砕し、遠心分離により菌体残渣を除去することにより
無細胞抽出液が得られる。
ることができる。回収した菌体から無細胞抽出液を調製
するには、通常の方法が用いられる。すなわち、菌体を
超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて
破砕し、遠心分離により菌体残渣を除去することにより
無細胞抽出液が得られる。
無細胞抽出液から酸性フォスファターゼを精製するに
は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラまフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿等、酵素
の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用いら
れる。精製は、完全精製である必要は必ずしもなく、基
質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が除
去できればよい。
は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラまフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿等、酵素
の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用いら
れる。精製は、完全精製である必要は必ずしもなく、基
質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が除
去できればよい。
＜２＞酸性フォスファターゼ遺伝子の取得 酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質をコードす
る構造遺伝子を含むDNA断片は、当該酵素活性を有する
微生物等の細胞からクローニングすることができる。ク
ローニング方法としては、例えば、酵素活性を指標とし
て染色体遺伝子発現ライブラリーを探索する方法、当該
蛋白質に対する抗体を作成して染色体遺伝子発現ライブ
ラリーを探索する方法、精製された蛋白質のＮ末端等の
アミノ酸配列を解析し、これを基にプローブを作成し遺
伝子ライブラリーを探索する方法等がある。
る構造遺伝子を含むDNA断片は、当該酵素活性を有する
微生物等の細胞からクローニングすることができる。ク
ローニング方法としては、例えば、酵素活性を指標とし
て染色体遺伝子発現ライブラリーを探索する方法、当該
蛋白質に対する抗体を作成して染色体遺伝子発現ライブ
ラリーを探索する方法、精製された蛋白質のＮ末端等の
アミノ酸配列を解析し、これを基にプローブを作成し遺
伝子ライブラリーを探索する方法等がある。
具体的には、上記のモルガネラ・モルガニ、エシェリ
ヒア・ブラッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、
エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プラ
ンティコラ、セラチア・フィカリア、又はセルチア・マ
ルセセンスの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
は、それぞれの微生物の染色体遺伝子発現ライブラリー
を作成し、フォスファターゼ活性を指標として該ライブ
ラリーを探索することによりクローニングできる。
ヒア・ブラッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、
エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プラ
ンティコラ、セラチア・フィカリア、又はセルチア・マ
ルセセンスの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
は、それぞれの微生物の染色体遺伝子発現ライブラリー
を作成し、フォスファターゼ活性を指標として該ライブ
ラリーを探索することによりクローニングできる。
すなわち、まず、上記細菌より染色体DNAを調製し、
これを適当な制限酵素で部分分解した後、エシェリヒア
・コリで自律複製できるベクターに連結し、得られた組
換えDNAを用いてエシェリヒア・コリを形質転換するこ
とにより染色体遺伝子発現ライブラリーが作成できる。
染色体DNAを切断する際に、切断反応時間等を調節して
切断の程度を調整すれば、幅広い種類の制限酵素が使用
できる。また、遺伝子のクローニングに使用するベクタ
ーとしては、エシェリヒア・コリで自律複製できるベク
ターであればいかなるものでも構わない。例えば、pUC1
9、pUC118、pHSG298、pBR322、pBluescript II等が用い
られる。
これを適当な制限酵素で部分分解した後、エシェリヒア
・コリで自律複製できるベクターに連結し、得られた組
換えDNAを用いてエシェリヒア・コリを形質転換するこ
とにより染色体遺伝子発現ライブラリーが作成できる。
染色体DNAを切断する際に、切断反応時間等を調節して
切断の程度を調整すれば、幅広い種類の制限酵素が使用
できる。また、遺伝子のクローニングに使用するベクタ
ーとしては、エシェリヒア・コリで自律複製できるベク
ターであればいかなるものでも構わない。例えば、pUC1
9、pUC118、pHSG298、pBR322、pBluescript II等が用い
られる。
ベクターと、酸性フォスファターゼをコードする遺伝
子を含むDNA断片を連結して組換え体DNAを調製するに
は、染色体DNAを切断するときに用いる制限酵素と同じ
もの、又は染色体DNA断片の切断面に相補する切断面を
生じる制限酵素を用いてあらかじめベクターを切断し、
T4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いてDNA断片との連結を
行えばよい。作成した組換えDNAの受容菌としては、ベ
クターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよ
く、例えばHB101、JM109、DH5等のエシェリヒア・コリ
菌株が用いられる。
子を含むDNA断片を連結して組換え体DNAを調製するに
は、染色体DNAを切断するときに用いる制限酵素と同じ
もの、又は染色体DNA断片の切断面に相補する切断面を
生じる制限酵素を用いてあらかじめベクターを切断し、
T4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いてDNA断片との連結を
行えばよい。作成した組換えDNAの受容菌としては、ベ
クターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよ
く、例えばHB101、JM109、DH5等のエシェリヒア・コリ
菌株が用いられる。
かくして得られる形質転換体を寒天培地上に生育させ
コロニーを形成させた後、培地表面にｐ−ニトロフェニ
ル燐酸を含む反応液を注ぎ反応を行うと、フォスファタ
ーゼ活性を発現した株は、ｐ−ニトロフェノールを遊離
して黄色を示す。前記反応を酸性条件下で行い、呈色を
指標として形質転換体を選択することにより、目的の酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むDNA断片
を保有する形質転換体を選択することができる。
コロニーを形成させた後、培地表面にｐ−ニトロフェニ
ル燐酸を含む反応液を注ぎ反応を行うと、フォスファタ
ーゼ活性を発現した株は、ｐ−ニトロフェノールを遊離
して黄色を示す。前記反応を酸性条件下で行い、呈色を
指標として形質転換体を選択することにより、目的の酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むDNA断片
を保有する形質転換体を選択することができる。
次いで、選択された形質変換体より組換えDNAを回収
し、ベクターに連結されている酸性フォスファターゼを
コードする遺伝子を含むDNA断片の構造を解析する。酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子の塩基配列は、
モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の遺伝子の場合、
配列表配列番号２に、エシェリヒア・ブラッタエJCM165
0由来の遺伝子の場合、配列表配列番号９に、プロビデ
ンシア・スチュアルティATCC29851由来の遺伝子の場
合、配列表配列番号17に、エンテロバクター・アエロゲ
ネスIFO12010由来の遺伝子の場合、配列表配列番号19
に、クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来の遺伝
子の場合、配列表配列番号21に、セラチア・フィカリア
IAM13540由来の遺伝子の場合、配列表配列番号23にそれ
ぞれ示される。
し、ベクターに連結されている酸性フォスファターゼを
コードする遺伝子を含むDNA断片の構造を解析する。酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子の塩基配列は、
モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の遺伝子の場合、
配列表配列番号２に、エシェリヒア・ブラッタエJCM165
0由来の遺伝子の場合、配列表配列番号９に、プロビデ
ンシア・スチュアルティATCC29851由来の遺伝子の場
合、配列表配列番号17に、エンテロバクター・アエロゲ
ネスIFO12010由来の遺伝子の場合、配列表配列番号19
に、クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来の遺伝
子の場合、配列表配列番号21に、セラチア・フィカリア
IAM13540由来の遺伝子の場合、配列表配列番号23にそれ
ぞれ示される。
上記遺伝子によりコードされると推定される酸性ホス
ファターゼのアミノ酸配列を、配列表配列番号４、11、
18、20、22及び24に示す。上記の遺伝子によってコード
される酸性ホスファターゼは、本発明に好適に使用する
ことができる。さらに、上記遺伝子によってコードされ
る酸性ホスファターゼのアミノ酸配列のいずれかと実質
的に相同であるアミノ酸配列を有する酸性ホスファター
ゼも、本発明に好適に使用することができる。「実質的
に相同」とは、酸性ホスファターゼのアミノ酸配列が、
ヌクレオシド−５′−燐酸エステル生成活性（以下、
「燐酸転移活性」という）を失わないような１又は２以
上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転移を含んで
いてもよいことを意味する。
ファターゼのアミノ酸配列を、配列表配列番号４、11、
18、20、22及び24に示す。上記の遺伝子によってコード
される酸性ホスファターゼは、本発明に好適に使用する
ことができる。さらに、上記遺伝子によってコードされ
る酸性ホスファターゼのアミノ酸配列のいずれかと実質
的に相同であるアミノ酸配列を有する酸性ホスファター
ゼも、本発明に好適に使用することができる。「実質的
に相同」とは、酸性ホスファターゼのアミノ酸配列が、
ヌクレオシド−５′−燐酸エステル生成活性（以下、
「燐酸転移活性」という）を失わないような１又は２以
上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転移を含んで
いてもよいことを意味する。
＜３＞変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
の取得 上記で得られる野生型酸性フォスファターゼは、隣接
エステル加水分解活性を有するため、ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの製造においては、反応時間の経過
とともに生産物の分解を伴い、反応収率を低下させる要
因となることがある。このような場合、燐酸エステル加
水分解活性が低下するように酸性フォスファターゼをコ
ードする遺伝子に人為的に変異を起こさせればよい。
の取得 上記で得られる野生型酸性フォスファターゼは、隣接
エステル加水分解活性を有するため、ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの製造においては、反応時間の経過
とともに生産物の分解を伴い、反応収率を低下させる要
因となることがある。このような場合、燐酸エステル加
水分解活性が低下するように酸性フォスファターゼをコ
ードする遺伝子に人為的に変異を起こさせればよい。
DNAの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異
法としては、PCRを用いる方法（Higuchi,R.,61,in PCR
technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press（1989）;
Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382（1987））、ファ
ージを用いる方法（Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in
Enzymol.,154,350（1987）;Kunkel,T.A.et al.,Meth.in
Enzymol.,154,367（1987））などがある。
法としては、PCRを用いる方法（Higuchi,R.,61,in PCR
technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press（1989）;
Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382（1987））、ファ
ージを用いる方法（Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in
Enzymol.,154,350（1987）;Kunkel,T.A.et al.,Meth.in
Enzymol.,154,367（1987））などがある。
燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォ
スファターゼの例としては、配列表配列番号４、11、1
8、20、22又は24に示されるアミノ酸配列と実質的に相
同であるアミノ酸配列を含み、かつ、野生型酸性フォス
ファターゼの燐酸エステル加水分解活性を低下させる変
異を有する変異型酸性フォスファターゼが挙げられる。
具体的には、モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の酵
素の場合、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列に
おいて72番目のグリシン残基及び／又は151番目のイソ
ロイシン残基が他のアミノ酸残基に置換したものが挙げ
られる。後述の実施例では、72番目のグリシン残基をア
スパラギン酸残基に、151番目のイソロイシン残基をス
レオニン残基に置換した変異型酸性フォスファターゼ遺
伝子取得の例を示した。また、エシェリヒア・ブラッタ
エJCM1650由来の酵素の場合、配列表配列番号11に示さ
れるアミノ酸配列において74番目のグリシン残基及び／
又は153番目のイソロイシン残基が他のアミノ酸残基に
置換したものが挙げられる。後述の実施例では、74番目
のグリシン残基をアスパラギン酸残基に、153番目のイ
ソロイシン残基をスレオニン残基に置換した変異型酸性
フォスファターゼ遺伝子取得を例を示した。
スファターゼの例としては、配列表配列番号４、11、1
8、20、22又は24に示されるアミノ酸配列と実質的に相
同であるアミノ酸配列を含み、かつ、野生型酸性フォス
ファターゼの燐酸エステル加水分解活性を低下させる変
異を有する変異型酸性フォスファターゼが挙げられる。
具体的には、モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の酵
素の場合、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列に
おいて72番目のグリシン残基及び／又は151番目のイソ
ロイシン残基が他のアミノ酸残基に置換したものが挙げ
られる。後述の実施例では、72番目のグリシン残基をア
スパラギン酸残基に、151番目のイソロイシン残基をス
レオニン残基に置換した変異型酸性フォスファターゼ遺
伝子取得の例を示した。また、エシェリヒア・ブラッタ
エJCM1650由来の酵素の場合、配列表配列番号11に示さ
れるアミノ酸配列において74番目のグリシン残基及び／
又は153番目のイソロイシン残基が他のアミノ酸残基に
置換したものが挙げられる。後述の実施例では、74番目
のグリシン残基をアスパラギン酸残基に、153番目のイ
ソロイシン残基をスレオニン残基に置換した変異型酸性
フォスファターゼ遺伝子取得を例を示した。
従って、これらの変異型酸性フォスファターゼをコー
ドするように、上記の部位特異的変異法により、野生型
遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行えばよい。
なお、燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異は、
野生型酸性フォスファターゼと比較してヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生成活性の実質的な低下を伴わな
い変異であることが望ましく、ヌクレオシド−５′−燐
酸エステルの生成活性が低下する場合であっても、燐酸
エステル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その
結果、燐酸エステル加水分解活性／ヌクレオシド−５′
−燐酸生成活性の比が野生型酸性フォスファターゼより
低くなるような変異であればよい。燐酸エステル加水分
解活性の低下の程度としては、野生型酵素の約40％以下
程度まで活性が低下すればよい。
ドするように、上記の部位特異的変異法により、野生型
遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行えばよい。
なお、燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異は、
野生型酸性フォスファターゼと比較してヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生成活性の実質的な低下を伴わな
い変異であることが望ましく、ヌクレオシド−５′−燐
酸エステルの生成活性が低下する場合であっても、燐酸
エステル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その
結果、燐酸エステル加水分解活性／ヌクレオシド−５′
−燐酸生成活性の比が野生型酸性フォスファターゼより
低くなるような変異であればよい。燐酸エステル加水分
解活性の低下の程度としては、野生型酵素の約40％以下
程度まで活性が低下すればよい。
後述の実施例のように、エシェリヒア・ブラッタエJC
M1650の酸性フォスファターゼのアミノ酸配列は、モル
ガネラ・モルガニNCIMB10466の酸性フォスファターゼと
高い相同性を有しており、配列番号４に示されるアミノ
酸配列において72番目のグリシン残基及び151番目のイ
ソロイシン残基は、それぞれ配列番号11に示されるアミ
ノ酸配列における74番目のグリシン残基及び153番目の
イソロイシン残基に相当する。また、エシェリヒア・ブ
ラッタエJCM1650以外にも、プロビデンシア・スチュア
ルティATCC29851、エンテロバクター・アエロゲネスIFO
12010、クレブシエラ・プランティコラIFO14939及びセ
ラチア・フィカリアIAM13540等に微生物に由来する酸性
フォスファターゼのアミノ酸配列も、モルガネラ・モル
ガニNCIMB10466の酸性フォスファターゼと相同性が高
く、それぞれ配列番号４に示されるアミノ酸配列におい
て72番目のグリシン残基及び151番目のイソロイシン残
基に相当するアミノ酸残基を有しており、同様にして変
異型酸性フォスファターゼ遺伝子を得ることができる。
配列番号４に示されるアミノ酸配列における72番目のグ
リシン残基及び151番目のイソロイシン残基に相当する
アミノ酸残基は、プロビデンシア・スチュアルティATCC
29851、エンテロバクター・アエロゲネスIFO12010及び
クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来の酸性ホス
ファターゼでは、配列表配列番号18、20又は22に示すア
ミノ酸配列において、92番目のグリシン残基及び171番
目のイソロイシン残基であり、セラチア・フィカリアIA
M13540由来の酸性ホスファターゼでは、配列表配列番号
24に示すアミノ酸配列において、88番目のグリシン残基
及び167番目のイソロイシン残基である。
M1650の酸性フォスファターゼのアミノ酸配列は、モル
ガネラ・モルガニNCIMB10466の酸性フォスファターゼと
高い相同性を有しており、配列番号４に示されるアミノ
酸配列において72番目のグリシン残基及び151番目のイ
ソロイシン残基は、それぞれ配列番号11に示されるアミ
ノ酸配列における74番目のグリシン残基及び153番目の
イソロイシン残基に相当する。また、エシェリヒア・ブ
ラッタエJCM1650以外にも、プロビデンシア・スチュア
ルティATCC29851、エンテロバクター・アエロゲネスIFO
12010、クレブシエラ・プランティコラIFO14939及びセ
ラチア・フィカリアIAM13540等に微生物に由来する酸性
フォスファターゼのアミノ酸配列も、モルガネラ・モル
ガニNCIMB10466の酸性フォスファターゼと相同性が高
く、それぞれ配列番号４に示されるアミノ酸配列におい
て72番目のグリシン残基及び151番目のイソロイシン残
基に相当するアミノ酸残基を有しており、同様にして変
異型酸性フォスファターゼ遺伝子を得ることができる。
配列番号４に示されるアミノ酸配列における72番目のグ
リシン残基及び151番目のイソロイシン残基に相当する
アミノ酸残基は、プロビデンシア・スチュアルティATCC
29851、エンテロバクター・アエロゲネスIFO12010及び
クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来の酸性ホス
ファターゼでは、配列表配列番号18、20又は22に示すア
ミノ酸配列において、92番目のグリシン残基及び171番
目のイソロイシン残基であり、セラチア・フィカリアIA
M13540由来の酸性ホスファターゼでは、配列表配列番号
24に示すアミノ酸配列において、88番目のグリシン残基
及び167番目のイソロイシン残基である。
＜４＞酸性フォスファターゼ遺伝子の宿主への導入 上記のようにして得られる酸性フォスファターゼ活性
を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むDNA断片は、
適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させるこ
とにより、酸性フォスファターゼ活性を高レベルに発現
した組換え菌を得ることができる。その際、野生型酸性
ホスファターゼをコードする遺伝子を用いれば、野生型
酸性ホスファターゼが、変異型酸性ホスファターゼをコ
ードする遺伝子を用いれば、変異型酸性ホスファターゼ
が発現される。
を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むDNA断片は、
適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させるこ
とにより、酸性フォスファターゼ活性を高レベルに発現
した組換え菌を得ることができる。その際、野生型酸性
ホスファターゼをコードする遺伝子を用いれば、野生型
酸性ホスファターゼが、変異型酸性ホスファターゼをコ
ードする遺伝子を用いれば、変異型酸性ホスファターゼ
が発現される。
宿主としては、上記したHB101、JM109、DH5等のエシ
ェリヒア・コリ菌株が挙げられるが、これ以外にも、構
築した組換えDNAの複製起点と酸性フォスファターゼ遺
伝子が機能し、組換えDNAが複製可能でかつ酸性フォス
ファターゼ遺伝子の発現が可能な細菌ならば、すべて宿
主として利用できる。最も好ましい宿主の１つはエシェ
リヒア・コリJM109である。
ェリヒア・コリ菌株が挙げられるが、これ以外にも、構
築した組換えDNAの複製起点と酸性フォスファターゼ遺
伝子が機能し、組換えDNAが複製可能でかつ酸性フォス
ファターゼ遺伝子の発現が可能な細菌ならば、すべて宿
主として利用できる。最も好ましい宿主の１つはエシェ
リヒア・コリJM109である。
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を組み込む
ベクターとしては、宿主において複製可能なものであれ
ば特に制限はない。宿主としてエシェリヒア・コリを用
いる場合には当該細菌で自律複製できるプラスミドを挙
げることができる。例えば、ColE1系プラスミド、p15A
系プラスミド、Ｒ因子系プラスミド、ファージ系プラス
ミド等を用いることができる。具体的に例示すれば、pB
R322（Gene,2,95（1977））、pUC19（Gene,33,103（198
5））、pUC119（Methods in Enzymology,153,3（198
7））、pACYC184（J.Bacteriol,134,1141（1978））、p
SC101（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,70,3240（1973））
等が挙げられる。
ベクターとしては、宿主において複製可能なものであれ
ば特に制限はない。宿主としてエシェリヒア・コリを用
いる場合には当該細菌で自律複製できるプラスミドを挙
げることができる。例えば、ColE1系プラスミド、p15A
系プラスミド、Ｒ因子系プラスミド、ファージ系プラス
ミド等を用いることができる。具体的に例示すれば、pB
R322（Gene,2,95（1977））、pUC19（Gene,33,103（198
5））、pUC119（Methods in Enzymology,153,3（198
7））、pACYC184（J.Bacteriol,134,1141（1978））、p
SC101（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,70,3240（1973））
等が挙げられる。
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むDNA
断片が、宿主で機能可能なプロモーターを含んでいる場
合には、そのままベクターに連結すればよい。前記DNA
断片がプロモーターを含まない場合には、前記遺伝子の
上流に、lac、trp、PL等の宿主微生物内で働く他のプロ
モーターを連結すればよい。前記DNA断片がプロモータ
ーを含んでいる場合であっても、酸性フォスファターゼ
をコードする遺伝子を効率的に発現させるために、他の
プロモーターと置換してもよい。
断片が、宿主で機能可能なプロモーターを含んでいる場
合には、そのままベクターに連結すればよい。前記DNA
断片がプロモーターを含まない場合には、前記遺伝子の
上流に、lac、trp、PL等の宿主微生物内で働く他のプロ
モーターを連結すればよい。前記DNA断片がプロモータ
ーを含んでいる場合であっても、酸性フォスファターゼ
をコードする遺伝子を効率的に発現させるために、他の
プロモーターと置換してもよい。
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むDNA
断片とベクターとを連結させてなる組換えDNAを宿主に
導入する方法としては特に制限はなく、通常の方法によ
り行うことができる。宿主としてエシェリヒア・コリを
用いる場合には、塩化カルシウム法（J.Mol.Biol.,53,1
59（1970））、Hanahan法（J.Mol.Biol.166,557（198
3））、SEM法（Gene,96,23（1990））、Chungらの方法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,2172（1989））、電
気穿孔法（Nucleic Acids Res.,16,6127（1988））など
の方法を用いることができる。
断片とベクターとを連結させてなる組換えDNAを宿主に
導入する方法としては特に制限はなく、通常の方法によ
り行うことができる。宿主としてエシェリヒア・コリを
用いる場合には、塩化カルシウム法（J.Mol.Biol.,53,1
59（1970））、Hanahan法（J.Mol.Biol.166,557（198
3））、SEM法（Gene,96,23（1990））、Chungらの方法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,2172（1989））、電
気穿孔法（Nucleic Acids Res.,16,6127（1988））など
の方法を用いることができる。
また、上記のように、酸性フォスファターゼ遺伝子を
自律複製可能なベクターDNAに挿入したものを宿主に導
入し、染色体外DNAとして宿主に保持させてもよいが、
酸性フォスファターゼ遺伝子を、トランスダクション、
トランスポゾン（Biotechnol.,1,4171983））、Muファ
ージ（特開平２−109985）または相同組換え（Experime
nts in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.
（1972））を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込
んでもよい。
自律複製可能なベクターDNAに挿入したものを宿主に導
入し、染色体外DNAとして宿主に保持させてもよいが、
酸性フォスファターゼ遺伝子を、トランスダクション、
トランスポゾン（Biotechnol.,1,4171983））、Muファ
ージ（特開平２−109985）または相同組換え（Experime
nts in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.
（1972））を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込
んでもよい。
＜５＞組換え菌による酸性フォスファターゼ遺伝子の発
現 上記のようにして得られる酸性フォスファターゼをコ
ードする遺伝子を含む組換えDNAを導入した形質転換体
は、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要ならば有機
栄養源を含む適当な培地で培養することにより酸性フォ
スファターゼ活性を高レベルで菌体内に発現することが
できる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グ
リセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウム
イオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応
じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、ア
ミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、
大豆加水分解物、その他が適宜用いられる。また、培地
にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）等の、プロモーターに応じた発現誘導剤を添加する
ことにより、酸性フォスファターゼ活性の発現量が上昇
する場合がある。
現 上記のようにして得られる酸性フォスファターゼをコ
ードする遺伝子を含む組換えDNAを導入した形質転換体
は、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要ならば有機
栄養源を含む適当な培地で培養することにより酸性フォ
スファターゼ活性を高レベルで菌体内に発現することが
できる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グ
リセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウム
イオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応
じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、ア
ミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、
大豆加水分解物、その他が適宜用いられる。また、培地
にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）等の、プロモーターに応じた発現誘導剤を添加する
ことにより、酸性フォスファターゼ活性の発現量が上昇
する場合がある。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件
下にてpH5〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度
を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行なえばよ
い。
下にてpH5〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度
を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行なえばよ
い。
次いで、培養物から菌体を回収し、破砕により無細胞
抽出液を取得し、これから酸性フォスファターゼを精製
することができる。精製には上記＜１＞に述べたような
酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用
いられる。精製は完全精製である必要は必ずしもなく、
基質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が
除去できればよい。
抽出液を取得し、これから酸性フォスファターゼを精製
することができる。精製には上記＜１＞に述べたような
酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用
いられる。精製は完全精製である必要は必ずしもなく、
基質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が
除去できればよい。
＜６＞ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造 上記＜１＞で取得した酸性フォスファターゼ又は上記
＜５＞に示したような遺伝子工学的手法により遺伝子を
大量発言させて得られる野生型酸性フォスファターゼも
しくは変異型酸性ホスファターゼを、ヌクレオシド並び
にポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル
燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に接触
反応させることにより、反応液中にヌクレオシド−５′
−燐酸エステルを生成することができる。この際、高い
生産性を得るには、反応液のpHを3.0〜5.5の範囲に弱酸
性に調製することが重要である。
＜５＞に示したような遺伝子工学的手法により遺伝子を
大量発言させて得られる野生型酸性フォスファターゼも
しくは変異型酸性ホスファターゼを、ヌクレオシド並び
にポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル
燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に接触
反応させることにより、反応液中にヌクレオシド−５′
−燐酸エステルを生成することができる。この際、高い
生産性を得るには、反応液のpHを3.0〜5.5の範囲に弱酸
性に調製することが重要である。
また、遺伝子工学的手法により酸性フォスファターゼ
をコードする遺伝子を大量発言させた場合、特に、燐酸
エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファ
ターゼをコードする遺伝子を大量発現させた場合には、
精製した酸性フォスファターゼに替えて、形質転換体の
菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、
該菌体を固定化処理、アゼトン処理、凍結乾燥処理等し
た菌体処理物を使用することによっても、安価かつ効率
的にヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成すること
ができる。
をコードする遺伝子を大量発言させた場合、特に、燐酸
エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファ
ターゼをコードする遺伝子を大量発現させた場合には、
精製した酸性フォスファターゼに替えて、形質転換体の
菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、
該菌体を固定化処理、アゼトン処理、凍結乾燥処理等し
た菌体処理物を使用することによっても、安価かつ効率
的にヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成すること
ができる。
使用するヌクレオシドとしては、プリンヌクレオシド
類として、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサン
トシン、プリンリボシド、６−メトキシプリンリボシ
ド、2,6−ジアミノプリンリボシド、６−フルオロプリ
ンリボシド、６−チオプリンリボシド、２−アミノ−６
−チオプリンリボシド、メルカプトグアノシン等、ピリ
ミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シチジン、５
−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ブモ
ロウリジン、６−アザウリジン等が挙げられる。反応に
よりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオ
シドの５′位が特異的に燐酸化され、それぞれ対応する
ヌクレオシド−５′−燐酸エステルが生成する。
類として、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサン
トシン、プリンリボシド、６−メトキシプリンリボシ
ド、2,6−ジアミノプリンリボシド、６−フルオロプリ
ンリボシド、６−チオプリンリボシド、２−アミノ−６
−チオプリンリボシド、メルカプトグアノシン等、ピリ
ミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シチジン、５
−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ブモ
ロウリジン、６−アザウリジン等が挙げられる。反応に
よりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオ
シドの５′位が特異的に燐酸化され、それぞれ対応する
ヌクレオシド−５′−燐酸エステルが生成する。
反応液に添加するヌクレオシドの濃度は１〜20g/dlが
望ましい。水に難溶性のヌクレオシドを使用する場合に
は、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活
性剤を添加すると反応収率が向上する場合がある。
望ましい。水に難溶性のヌクレオシドを使用する場合に
は、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活
性剤を添加すると反応収率が向上する場合がある。
燐酸供与体として用いられるポリ燐酸（塩）として
は、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメ
タ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそれらの混合物、又は
それらのナトリウム塩、カリウム塩もしくはそれらの塩
混合物などが、フェニル燐酸（塩）としては、フェニル
燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、O,O−ジ
フェニル燐酸無水物もしくはそれらの混合物などが、カ
ルバミル燐酸（塩）としては、カルバミル燐酸ジナトリ
ウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジア
ンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムもしくはそれら
の混合物などが使用可能である。燐酸供与体の使用濃度
は、燐酸受容体であるヌクレオシドの濃度によって決定
される。通常、ヌクレオシドの１〜５倍量が望ましい。
は、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメ
タ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそれらの混合物、又は
それらのナトリウム塩、カリウム塩もしくはそれらの塩
混合物などが、フェニル燐酸（塩）としては、フェニル
燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、O,O−ジ
フェニル燐酸無水物もしくはそれらの混合物などが、カ
ルバミル燐酸（塩）としては、カルバミル燐酸ジナトリ
ウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジア
ンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムもしくはそれら
の混合物などが使用可能である。燐酸供与体の使用濃度
は、燐酸受容体であるヌクレオシドの濃度によって決定
される。通常、ヌクレオシドの１〜５倍量が望ましい。
反応は通常、温度20〜60℃、好ましくは30〜40℃で、
pH3.5〜6.5、好ましくはpH4.0〜5.0の弱酸性側が好結果
を与える。反応には静置又は撹はんのずれの方法も採用
し得る。反応時間は、使用する酵素の活性、基質濃度な
どの条件によって異なるが、１〜100時間である。
pH3.5〜6.5、好ましくはpH4.0〜5.0の弱酸性側が好結果
を与える。反応には静置又は撹はんのずれの方法も採用
し得る。反応時間は、使用する酵素の活性、基質濃度な
どの条件によって異なるが、１〜100時間である。
このようにして生成したヌクレオシド−５′−燐酸エ
ステルを反応終了混合物より採取分離するには、合成吸
着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常
の採取分離方法が採用できる。
ステルを反応終了混合物より採取分離するには、合成吸
着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常
の採取分離方法が採用できる。
図面の簡単な説明 図１はモルガネラ・モルガニ由来の酵素を用いた反応
において反応pHと５−′イノシン酸生成量との関係を示
す図である。
において反応pHと５−′イノシン酸生成量との関係を示
す図である。
図２はエシェリヒア・ブラッタエ由来の酵素を用いた
反応において反応pHと５′−イノシン酸生成量との関係
を示す図である。
反応において反応pHと５′−イノシン酸生成量との関係
を示す図である。
図３は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むモルガネラ・モルガニの染色体DNA断片の制限酵素
地図を示す図である。
含むモルガネラ・モルガニの染色体DNA断片の制限酵素
地図を示す図である。
図４は、モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファ
ターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシ
ン酸の生産量を示す図である。
ターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシ
ン酸の生産量を示す図である。
図５は、モルガネラ・モルガニ由来の野生型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシン
酸の生産量を示す図である。
スファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシン
酸の生産量を示す図である。
図６は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むエシェリヒア・ブラッタエの染色体DNA断片の制限
酵素地図を示す図である。
含むエシェリヒア・ブラッタエの染色体DNA断片の制限
酵素地図を示す図である。
図７は、エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イ
ノシン酸の生産量を示す図である。
ファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イ
ノシン酸の生産量を示す図である。
図８は、エシェリヒア・ブラッタエ由来の野生型酸性
フォスファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノ
シン酸の生産量を示す図である。
フォスファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノ
シン酸の生産量を示す図である。
図９は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むエンテロバクター・アエロゲネスの染色体DNA断片
の制限酵素地図を示す図である。
含むエンテロバクター・アエロゲネスの染色体DNA断片
の制限酵素地図を示す図である。
図10は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むクレブシエラ・プランティコラの染色体DNA断片の
制限酵素地図を示す図である。
含むクレブシエラ・プランティコラの染色体DNA断片の
制限酵素地図を示す図である。
図11は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むセラチア・フィカリアの染色体DNA断片の制限酵素
地図を示す図である。
含むセラチア・フィカリアの染色体DNA断片の制限酵素
地図を示す図である。
図12は、モルガネラ・モルガニ、エシェリヒア・ブラ
ッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロバ
クター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコラ
及びセラチア・フィカリアの酸性フォスファターゼ遺伝
子の塩基配列より予想される蛋白質のアミノ酸配列をア
ミノ酸の一文字表記で示した図である。これらのアミノ
酸配列は、各々配列表配列番号４、11、18、20、22及び
24に３文字表記で示されている。図中ですべてのアミノ
酸配列において共通のアミノ酸残基を配列の下に＊で示
した。
ッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロバ
クター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコラ
及びセラチア・フィカリアの酸性フォスファターゼ遺伝
子の塩基配列より予想される蛋白質のアミノ酸配列をア
ミノ酸の一文字表記で示した図である。これらのアミノ
酸配列は、各々配列表配列番号４、11、18、20、22及び
24に３文字表記で示されている。図中ですべてのアミノ
酸配列において共通のアミノ酸残基を配列の下に＊で示
した。
好適な実施例の説明 以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの例に限定されるものではない。
明はこれらの例に限定されるものではない。
燐酸転移活性の測定は、イノシンを基質として次の条
件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム
100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）100μmol
/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH5.0、30℃で10分
反応を行った。2N塩酸200μｌを添加して反応を停止し
た後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移反応により
生成した５′−イノシン酸を定量した。この標準反応条
件にて１分間に１μmolの５′−イノシン酸を生成する
酵素量を1unitと定めた。
件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム
100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）100μmol
/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH5.0、30℃で10分
反応を行った。2N塩酸200μｌを添加して反応を停止し
た後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移反応により
生成した５′−イノシン酸を定量した。この標準反応条
件にて１分間に１μmolの５′−イノシン酸を生成する
酵素量を1unitと定めた。
また、燐酸エステル加水分解活性の測定は、５′−イ
ノシン酸を基質として次の条件で行った。５′−イノシ
ン酸10μmol/ml、メス/NaOH緩衝液（pH6.0）100μmol/m
l及び酵素を含む反応液（1ml）で30℃で10分反応を行っ
た。2N塩酸200μｌを添加して反応を停止した後、遠心
分離により沈澱を除き、加水分解反応により生成したイ
ノシンを定量した。この標準反応条件にて１分間に１μ
molのイノシンを生成する酵素量を1unitと定めた。
ノシン酸を基質として次の条件で行った。５′−イノシ
ン酸10μmol/ml、メス/NaOH緩衝液（pH6.0）100μmol/m
l及び酵素を含む反応液（1ml）で30℃で10分反応を行っ
た。2N塩酸200μｌを添加して反応を停止した後、遠心
分離により沈澱を除き、加水分解反応により生成したイ
ノシンを定量した。この標準反応条件にて１分間に１μ
molのイノシンを生成する酵素量を1unitと定めた。
なお、イノシン及び５′−イノシン酸は、高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）により、下記の条件にて分析
した。
ロマトグラフィー（HPLC）により、下記の条件にて分析
した。
カラム:Cosmosil5C18−AR（4.6×150mm）〔ナカライ
テスク社製品〕 移動相:5mM燐酸カリウムバッファー（pH2.8）／メタ
ノール＝95/5 流速:1.0ml/min 温度：室温 検出:UV245nm また、イノシン以外のヌクレオシドを原料とするヌク
レオシド−５′−燐酸エステルの生成反応においても、
原料のヌクレオシド及び生成したヌクレオシド−５′−
燐酸エステルは、上記と同様にHPLCにより分析した。
テスク社製品〕 移動相:5mM燐酸カリウムバッファー（pH2.8）／メタ
ノール＝95/5 流速:1.0ml/min 温度：室温 検出:UV245nm また、イノシン以外のヌクレオシドを原料とするヌク
レオシド−５′−燐酸エステルの生成反応においても、
原料のヌクレオシド及び生成したヌクレオシド−５′−
燐酸エステルは、上記と同様にHPLCにより分析した。
実施例１ モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファ
ターゼの精製と性質 ペプトン1g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩1g/dlを
含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに
入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培
養したモルガネラ・モルガニNCIMB10466を一白金耳接種
し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離に
より回収した菌体約3,000gを1Lの100mM燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理
を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画
分を除き、無細胞抽出液を調製した。
ターゼの精製と性質 ペプトン1g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩1g/dlを
含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに
入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培
養したモルガネラ・モルガニNCIMB10466を一白金耳接種
し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離に
より回収した菌体約3,000gを1Lの100mM燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理
を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画
分を除き、無細胞抽出液を調製した。
この無細胞抽出液に30％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを添加した。遠心分離により生成した沈澱を除去
した後、上清液に60％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離で集め、10
0mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。
ニウムを添加した。遠心分離により生成した沈澱を除去
した後、上清液に60％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離で集め、10
0mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。
この粗酵素液を100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.
0）5Lに対し４回透析した後、20mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラ
ム（φ4.1×22cm）にチャージし、800mlの20mΜ燐酸カ
リウムバッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活性
は、素通り画分にあったので、当該画分を回収した。
0）5Lに対し４回透析した後、20mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラ
ム（φ4.1×22cm）にチャージし、800mlの20mΜ燐酸カ
リウムバッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活性
は、素通り画分にあったので、当該画分を回収した。
この活性画分に35％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、35％硫安飽和の20mΜ燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡したブチルトヨパールカラム（φ
3.1×26cm）に吸着させた。35％飽和から20％飽和燐酸
カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶
出した。
ムを添加し、35％硫安飽和の20mΜ燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡したブチルトヨパールカラム（φ
3.1×26cm）に吸着させた。35％飽和から20％飽和燐酸
カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶
出した。
活性画分を集め、50mΜ燐酸カリウムバッファー（pH
7.0）1Lに対し透析した後、50mΜ燐酸カリウムバッファ
ー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム
（φ５×6.5cm）に吸着させた。50mMから300mΜ燐酸カ
リウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出
した。
7.0）1Lに対し透析した後、50mΜ燐酸カリウムバッファ
ー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム
（φ５×6.5cm）に吸着させた。50mMから300mΜ燐酸カ
リウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出
した。
活性画分を集め、限外ろ過により濃縮した。この酵素
をHiLoad TM16/60Superdex200カラム（ファルマシア社
製品）に注入し、100mM食塩を含む50mΜ燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）、流速1.0ml/分にて溶出した。
をHiLoad TM16/60Superdex200カラム（ファルマシア社
製品）に注入し、100mM食塩を含む50mΜ燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）、流速1.0ml/分にて溶出した。
以上の操作によって、燐酸転移活性を示す酵素を無細
胞抽出液より最終的に約10％の回収率で約550倍に精製
した。この精製過程における比活性及び回収率を表１に
示す。この酵素標品は、SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動において均一であった。
胞抽出液より最終的に約10％の回収率で約550倍に精製
した。この精製過程における比活性及び回収率を表１に
示す。この酵素標品は、SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動において均一であった。
精製された酵素は次の性質を有していた。
（１）作用：ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシド
に燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを
生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示
す。
に燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを
生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示
す。
（２）基質特異性：燐酸転移反応においてはピロ燐酸、
トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサ
メタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジ
カリウム、O,O−ジフェニル酸無水物、カルバミル燐酸
ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル
燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムなどが
燐酸供与体となる。また、燐酸受容体としてはプリンリ
ボシド、イソシン、グアノシン、アデノシン、ギサント
シン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容体となる。一
方、燐酸エステル加水分解反応においては、ピロ燐酸、
トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサ
メタ燐酸等の無機燐酸、また、フェニル燐酸ジナトリウ
ム、フェニル燐酸ジカリウム、O,O−ジフェニル燐酸無
水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジ
カリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル
燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、さらに、５′−プリ
ンリボシド、５′−イノシン酸、５′−グアニル酸、
５′−アデニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジ
ル酸、５′−シチジル酸等の５′−ヌクレオチドが作用
を受ける。
トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサ
メタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジ
カリウム、O,O−ジフェニル酸無水物、カルバミル燐酸
ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル
燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムなどが
燐酸供与体となる。また、燐酸受容体としてはプリンリ
ボシド、イソシン、グアノシン、アデノシン、ギサント
シン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容体となる。一
方、燐酸エステル加水分解反応においては、ピロ燐酸、
トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサ
メタ燐酸等の無機燐酸、また、フェニル燐酸ジナトリウ
ム、フェニル燐酸ジカリウム、O,O−ジフェニル燐酸無
水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジ
カリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル
燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、さらに、５′−プリ
ンリボシド、５′−イノシン酸、５′−グアニル酸、
５′−アデニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジ
ル酸、５′−シチジル酸等の５′−ヌクレオチドが作用
を受ける。
（３）至適pH:5.2（燐酸転移反応）、6.5（燐酸エステ
ル加水分解反応） （４）pH安定性:pH3.0〜12.0（30℃、60分処理） （５）至適温度:35℃付近 （６）温度安定性:30℃まで安定（pH7.0、30分処理） （７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属
イオン添加による活性化現象は見られず、Ag2+、Pb2+、
Hg2+及びCu2+によって阻害される。また、ヨード酢酸に
よって阻害される。
ル加水分解反応） （４）pH安定性:pH3.0〜12.0（30℃、60分処理） （５）至適温度:35℃付近 （６）温度安定性:30℃まで安定（pH7.0、30分処理） （７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属
イオン添加による活性化現象は見られず、Ag2+、Pb2+、
Hg2+及びCu2+によって阻害される。また、ヨード酢酸に
よって阻害される。
（８）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSKgel G
−3000SW、東ソー社製品）により約190,000と算出され
る。
−3000SW、東ソー社製品）により約190,000と算出され
る。
（９）サブユニット分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により約25,000と算出される。
ル電気泳動により約25,000と算出される。
本酵素はヌクレオシドへの燐酸転移活性だけでなく、
逆に燐酸エステルを加水分解する活性も示し、しかも燐
酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性に比べて20倍
以上高い活性を示した。また、その他の性質もモルガネ
ラ属の菌が産生する既知の酸性フォスファターゼとよく
一致することから（Microbiology,140,1341−1350（199
4））、本酵素は酸性フォスファターゼであることが明
らかとなった。
逆に燐酸エステルを加水分解する活性も示し、しかも燐
酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性に比べて20倍
以上高い活性を示した。また、その他の性質もモルガネ
ラ属の菌が産生する既知の酸性フォスファターゼとよく
一致することから（Microbiology,140,1341−1350（199
4））、本酵素は酸性フォスファターゼであることが明
らかとなった。
ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及びイノシン2g/dlをpH5.
5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリウムバッフ
ァーに溶解し、これに上記の酵素標品を50units/dlとな
るように添加した。各pHを維持しながら30℃で６時間反
応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測
定した。なお、生成したイノシン酸は、５′−イノシン
酸のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副
生は全く認められなかった。結果を図１に示す。５′−
イノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大となったが、
５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低い方が高く
なった。５′−イノシン酸の生産にはpH4.0の反応条件
が最も効率がよく、３時間の反応で2.60g/dlの５′−イ
ノシン酸が生成蓄積した。
5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリウムバッフ
ァーに溶解し、これに上記の酵素標品を50units/dlとな
るように添加した。各pHを維持しながら30℃で６時間反
応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測
定した。なお、生成したイノシン酸は、５′−イノシン
酸のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副
生は全く認められなかった。結果を図１に示す。５′−
イノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大となったが、
５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低い方が高く
なった。５′−イノシン酸の生産にはpH4.0の反応条件
が最も効率がよく、３時間の反応で2.60g/dlの５′−イ
ノシン酸が生成蓄積した。
実施例２ モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファ
ターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及び燐酸受容体としてイノ
シン、グアノシン、ウリジン又はシチジンを2g/dlを酢
酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに実
施例１の酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pH
を4.0に維持しながら、30℃で３時間反応させた。反応
により生成したヌクレオシド−５′−エステルの量を表
２に示す。
ターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及び燐酸受容体としてイノ
シン、グアノシン、ウリジン又はシチジンを2g/dlを酢
酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに実
施例１の酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pH
を4.0に維持しながら、30℃で３時間反応させた。反応
により生成したヌクレオシド−５′−エステルの量を表
２に示す。
なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシド−５′−
エステルのみでヌクレオシド−２′−エステル及びヌク
レオシド−３′−エステルの副生は全く認められなかっ
た。
エステルのみでヌクレオシド−２′−エステル及びヌク
レオシド−３′−エステルの副生は全く認められなかっ
た。
実施例３ モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファ
ターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体とする
５′−イノシン酸の生産 イノシン2g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナ
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又
はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウム
バッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例１で調製
した酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.
0に維持しながら30℃で３時間反応させた。反応により
生成した５′−イノシン酸の量を表３に示す。
ターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体とする
５′−イノシン酸の生産 イノシン2g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナ
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又
はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウム
バッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例１で調製
した酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.
0に維持しながら30℃で３時間反応させた。反応により
生成した５′−イノシン酸の量を表３に示す。
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−
イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナトリウムを燐
酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄
積量が高かった。
イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナトリウムを燐
酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄
積量が高かった。
実施例４ エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォス
ファターゼの精製と性質 ペプトン1g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩1g/dlを
含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに
入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培
養したエシェリヒア・ブラッタエJCM1650を一白金耳接
種し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離
により菌体を回収した。この菌体約3,300gを1Lの100mM
燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20
分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分
離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
ファターゼの精製と性質 ペプトン1g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩1g/dlを
含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに
入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培
養したエシェリヒア・ブラッタエJCM1650を一白金耳接
種し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離
により菌体を回収した。この菌体約3,300gを1Lの100mM
燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20
分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分
離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
この無細胞抽出液に30％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを添加した。遠心分離により生成した沈澱を除去
した後、上清液に60％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離により回収
し、100mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。
ニウムを添加した。遠心分離により生成した沈澱を除去
した後、上清液に60％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離により回収
し、100mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。
この粗酵素液を100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.
0）5Lに対し４回透析した後、20mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡化したDEAE−トコパール650Mカラ
ム（φ6.2×35cm）にチャージし、20mΜ燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活性は素通り
画分にあったので、当該画分を回収した。
0）5Lに対し４回透析した後、20mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡化したDEAE−トコパール650Mカラ
ム（φ6.2×35cm）にチャージし、20mΜ燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活性は素通り
画分にあったので、当該画分を回収した。
この活性画分に35％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、これを35％飽和硫酸アンモニウムを含む20
mΜ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したブチ
ルトヨパールカラム（φ5.0×22.5cm）に吸着させた。
これを35％飽和から20％飽和燐酸カリウムバッファー
（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。
ムを添加し、これを35％飽和硫酸アンモニウムを含む20
mΜ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したブチ
ルトヨパールカラム（φ5.0×22.5cm）に吸着させた。
これを35％飽和から20％飽和燐酸カリウムバッファー
（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。
活性画分を集め、100mΜ燐酸カリウムバッファー（pH
7.0）1Lに対し透析した後、100mΜ燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラ
ム（φ3.0×7.0cm）に吸着させた。これを50mMから100m
Μ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾
配で溶出し、活性画分を集めた。
7.0）1Lに対し透析した後、100mΜ燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラ
ム（φ3.0×7.0cm）に吸着させた。これを50mMから100m
Μ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾
配で溶出し、活性画分を集めた。
この酵素液を10mΜ燐酸カリウムバッファー（pH6.0）
1Lに対し透析した後、10mΜ燐酸カリウムバッファー（p
H6.0）で平衡化したCM−Toyopearlカラム（φ2.0×14.0
cm）に吸着させた。これを0mΜから300mΜ塩化カリウム
を含む燐酸カリウムバッファー（pH6.0）の直線的な濃
度勾配で溶出した。この活性画分を集めた。
1Lに対し透析した後、10mΜ燐酸カリウムバッファー（p
H6.0）で平衡化したCM−Toyopearlカラム（φ2.0×14.0
cm）に吸着させた。これを0mΜから300mΜ塩化カリウム
を含む燐酸カリウムバッファー（pH6.0）の直線的な濃
度勾配で溶出した。この活性画分を集めた。
以上の操作によって、燐酸転移活性を示す酵素を無細
胞抽出液より最終的に約16％の回収率で約600倍に精製
した。この精製過程における比活性及び回収率を表４に
示す。この酵素標品は、SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動において均一であった。
胞抽出液より最終的に約16％の回収率で約600倍に精製
した。この精製過程における比活性及び回収率を表４に
示す。この酵素標品は、SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動において均一であった。
精製された酵素は次の性質を有していた。
（１）作用：ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシド
に燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを
生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示
す。
に燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを
生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示
す。
（２）基質特異性：燐酸転移反応においてはピロ燐酸、
トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサ
メタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジ
カリウム、O,O−ジフェニル酸無水物、カルバミル燐酸
ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル
燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムなどが
燐酸供与体となる。また燐酸受容体としてはプリンリボ
シド、イソシン、グアノシン、アデノシン、キサントシ
ン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容体となる。一方、
燐酸エステル加水分解反応においては、ピロ燐酸、トリ
ポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ
燐酸等の無機燐酸、また、フェニル燐酸ジナトリウム、
フェニル燐酸ジカリウム、O,O−ジフェニル燐酸無水
物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカ
リウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐
酸ジリチウム等の燐酸エステル、そして５′−プリンリ
ボチド、５′−イソシン酸、５′−グアニル酸、５′−
アデニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジル酸、
５′−シチジル酸等の５′−ヌクレオチドが作用を受け
る。
トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサ
メタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジ
カリウム、O,O−ジフェニル酸無水物、カルバミル燐酸
ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル
燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムなどが
燐酸供与体となる。また燐酸受容体としてはプリンリボ
シド、イソシン、グアノシン、アデノシン、キサントシ
ン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容体となる。一方、
燐酸エステル加水分解反応においては、ピロ燐酸、トリ
ポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ
燐酸等の無機燐酸、また、フェニル燐酸ジナトリウム、
フェニル燐酸ジカリウム、O,O−ジフェニル燐酸無水
物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカ
リウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐
酸ジリチウム等の燐酸エステル、そして５′−プリンリ
ボチド、５′−イソシン酸、５′−グアニル酸、５′−
アデニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジル酸、
５′−シチジル酸等の５′−ヌクレオチドが作用を受け
る。
（３）至適pH:5.2（燐酸転移反応）、6.5（燐酸エステ
ル加水分解反応） （４）pH安定性:pH3.5〜12.0（30℃、60分処理） （５）至適温度:35℃付近 （６）温度安定性:40℃まで安定（pH7.0、30分処理） （７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属
イオン添加により活性化現象は見られず、Fe2+、Ag2+、
Pb2+、Hg2+及びCu2+によって阻害される。また、ヨード
酢酸によって阻害される。
ル加水分解反応） （４）pH安定性:pH3.5〜12.0（30℃、60分処理） （５）至適温度:35℃付近 （６）温度安定性:40℃まで安定（pH7.0、30分処理） （７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属
イオン添加により活性化現象は見られず、Fe2+、Ag2+、
Pb2+、Hg2+及びCu2+によって阻害される。また、ヨード
酢酸によって阻害される。
（８）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSKgel G
−3000SW、東ソー社製品）により約188,000と算出され
る。
−3000SW、東ソー社製品）により約188,000と算出され
る。
（９）サブユニット分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により約24,500と算出される。
ル電気泳動により約24,500と算出される。
本酵素もモルガネラ・モルガニNCIMB10466の無細胞抽
出液より精製した酵素と同様にヌクレオシドへの燐酸転
移活性だけでなく、逆に燐酸エステルを加水分解する活
性も示した。しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸
転移活性に比べて30倍以上高い活性を示すことから、酸
性フォスファターゼであることが明らかとなった。
出液より精製した酵素と同様にヌクレオシドへの燐酸転
移活性だけでなく、逆に燐酸エステルを加水分解する活
性も示した。しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸
転移活性に比べて30倍以上高い活性を示すことから、酸
性フォスファターゼであることが明らかとなった。
ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン3g/dlをpH5.
5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリウムバッフ
ァーに溶解し、これに上記の酵素標品を50units/dlとな
るように添加した。各pHを維持しながら30℃で６時間反
応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測
定した。なお、生成したイノシン酸は５′−イノシン酸
のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副生
は全く認められなかった。結果を図２に示す。５′−イ
ノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大となったが、
５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低い範囲の方
が高く、５′−イノシン酸の生産はpH4.0の反応条件が
最も効率的であった。30℃、pH4.0の反応では３時間で
1.56g/dlの５′−イノシン酸が生成蓄積した。
5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリウムバッフ
ァーに溶解し、これに上記の酵素標品を50units/dlとな
るように添加した。各pHを維持しながら30℃で６時間反
応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測
定した。なお、生成したイノシン酸は５′−イノシン酸
のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副生
は全く認められなかった。結果を図２に示す。５′−イ
ノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大となったが、
５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低い範囲の方
が高く、５′−イノシン酸の生産はpH4.0の反応条件が
最も効率的であった。30℃、pH4.0の反応では３時間で
1.56g/dlの５′−イノシン酸が生成蓄積した。
実施例５ エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォス
ファターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン、グアノシ
ン、ウリジン又はシチジンを3g/dlを酢酸ナトリウムバ
ッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例４の酵素標
品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持し
ながら、35℃で３時間反応させた。生成したヌクレオシ
ド−５′−エステルの量を表５に示す。
ファターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン、グアノシ
ン、ウリジン又はシチジンを3g/dlを酢酸ナトリウムバ
ッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例４の酵素標
品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持し
ながら、35℃で３時間反応させた。生成したヌクレオシ
ド−５′−エステルの量を表５に示す。
なお、生成したヌクレオシドはヌクレオシド−５′−
エステルのみでヌクレオシド−２′−エステル及びヌク
レオシド−３′−エステルの副生は全く認められなかっ
た。
エステルのみでヌクレオシド−２′−エステル及びヌク
レオシド−３′−エステルの副生は全く認められなかっ
た。
実施例６ エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォス
ファターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体と
する５′−イノシン酸の生産 イノシン2g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナ
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又
はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウム
バッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例４で調製
した酵素標品を上記の酵素標品を50units/dlとなるよう
に添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で３時間反応
させた。生成した５′−イノシン酸の量を表６に示す。
ファターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体と
する５′−イノシン酸の生産 イノシン2g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナ
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又
はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウム
バッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例４で調製
した酵素標品を上記の酵素標品を50units/dlとなるよう
に添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で３時間反応
させた。生成した５′−イノシン酸の量を表６に示す。
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−
イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナトリウムを燐
酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄
積量が高かった。
イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナトリウムを燐
酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄
積量が高かった。
実施例７ モルガネラ・モルガニ染色体からの酸性フォ
スファターゼをコードする遺伝子の単離 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 モルガネラ・モルガニNCIMB10466の無細胞抽出液から
実施例１記載の方法に従い精製した酸性フォスファター
ゼをDITCメンブレン（Milligen/Biosearch社製）に吸着
させ、Prosequencer6625（Milligen/Biosearch社製）を
用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番
号１に示した20残基のＮ末端アミノ酸配列が決定され
た。
スファターゼをコードする遺伝子の単離 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 モルガネラ・モルガニNCIMB10466の無細胞抽出液から
実施例１記載の方法に従い精製した酸性フォスファター
ゼをDITCメンブレン（Milligen/Biosearch社製）に吸着
させ、Prosequencer6625（Milligen/Biosearch社製）を
用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番
号１に示した20残基のＮ末端アミノ酸配列が決定され
た。
（２）酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む
DNA断片の単離 モルガネラ・モルガニNCIMB10466の培養菌体からMurr
ay and Thomsonの方法（Nucl.Acid Res.,4321,8（198
0））に従い、染色体DNAを調製した。これを制限酵素Sa
u3A Iで部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離によ
り３〜6kbpのDNA断片を分画した。プラスミドベクターp
UC118（宝酒造社製）を制限酵素BamH Iで切断し、部分
分解した染色体DNA断片と連結させた。DNAの連結はDNA
ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い、指定され
た方法にて行った。次いで、得られたDNA混合物を用い
て常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造社製）
を形質転換した。形質転換をアンピシリン100μg/mlを
含むＬ寒天培地上にプレーティングして生育させ、遺伝
子ライブラリーを作成した。
DNA断片の単離 モルガネラ・モルガニNCIMB10466の培養菌体からMurr
ay and Thomsonの方法（Nucl.Acid Res.,4321,8（198
0））に従い、染色体DNAを調製した。これを制限酵素Sa
u3A Iで部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離によ
り３〜6kbpのDNA断片を分画した。プラスミドベクターp
UC118（宝酒造社製）を制限酵素BamH Iで切断し、部分
分解した染色体DNA断片と連結させた。DNAの連結はDNA
ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い、指定され
た方法にて行った。次いで、得られたDNA混合物を用い
て常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造社製）
を形質転換した。形質転換をアンピシリン100μg/mlを
含むＬ寒天培地上にプレーティングして生育させ、遺伝
子ライブラリーを作成した。
形質転換体の生育した寒天培地の表面に4mM p−ニト
ロフェニル燐酸及び100mMメス/NaOHバッファー（pH6.
5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分間保温した。フォ
スファターゼ活性を発現した菌は、ｐ−ニトロフェノー
ルを遊離して黄色を示すため、これを指標として形質転
換体を選択した。約20,000株の形質転換体の遺伝子発現
ライブラリーを探索した結果、フォスファターゼ活性を
発現した形質転換体30株が得られた。
ロフェニル燐酸及び100mMメス/NaOHバッファー（pH6.
5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分間保温した。フォ
スファターゼ活性を発現した菌は、ｐ−ニトロフェノー
ルを遊離して黄色を示すため、これを指標として形質転
換体を選択した。約20,000株の形質転換体の遺伝子発現
ライブラリーを探索した結果、フォスファターゼ活性を
発現した形質転換体30株が得られた。
フォスファターゼ活性を発現した30株の形質転換体を
単コロニー分離し、アンピシリン100μg/mlを含むＬ培
地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。培養液より
集菌した菌体にイノシン2g/dl及びピロ燐酸ナトリウム1
0g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）5
0μｌを添加し、30℃で16時間反応を行った。HPLC分析
にて５′−イノシン酸の生成を検出し、燐酸転移活性を
持つ菌株を選択した。その結果、燐酸転移活性を示し、
目的の酸性フォスファターゼ遺伝子を含むDNA断片を保
有すると予想される形質転換体５株を得ることができ
た。
単コロニー分離し、アンピシリン100μg/mlを含むＬ培
地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。培養液より
集菌した菌体にイノシン2g/dl及びピロ燐酸ナトリウム1
0g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）5
0μｌを添加し、30℃で16時間反応を行った。HPLC分析
にて５′−イノシン酸の生成を検出し、燐酸転移活性を
持つ菌株を選択した。その結果、燐酸転移活性を示し、
目的の酸性フォスファターゼ遺伝子を含むDNA断片を保
有すると予想される形質転換体５株を得ることができ
た。
実施例８ モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の酸性
フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例７で得られたモルガネラ・モルガニNCIMB10466
由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むDNA断片を保有
すると予想される形質転換体の１株より、アルカリ溶菌
法（Molecular Cloning2nd edition（J.Sambrook,E.F.F
ritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbour Laborato
ty Press,p1.25（1989））によりプラスミドを調製し、
挿入されたDNA断片の解析を行った。なお、このプラス
ミドをpMPI501と命名した。決定した挿入DNA断片の制限
酵素地図を図３に示す。
フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例７で得られたモルガネラ・モルガニNCIMB10466
由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むDNA断片を保有
すると予想される形質転換体の１株より、アルカリ溶菌
法（Molecular Cloning2nd edition（J.Sambrook,E.F.F
ritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbour Laborato
ty Press,p1.25（1989））によりプラスミドを調製し、
挿入されたDNA断片の解析を行った。なお、このプラス
ミドをpMPI501と命名した。決定した挿入DNA断片の制限
酵素地図を図３に示す。
さらにサブクローニングにより、酸性フォスファター
ゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素Hind IIIの制限
酵素EcoR Iで切り出される1.2Kbpの大きさの断片中に本
酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆され
た。そこで塩基配列の決定のために、この1.2kbpの断片
をHind III及びEcoR Iで切断したpUC118に結合したプラ
スミドDNAを構築した。pMPI505と命名したこのプラスミ
ドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝
酒造（社）製）を形質転換し、これを100μg/mlのアン
ピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質
転換体を得た。
ゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素Hind IIIの制限
酵素EcoR Iで切り出される1.2Kbpの大きさの断片中に本
酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆され
た。そこで塩基配列の決定のために、この1.2kbpの断片
をHind III及びEcoR Iで切断したpUC118に結合したプラ
スミドDNAを構築した。pMPI505と命名したこのプラスミ
ドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝
酒造（社）製）を形質転換し、これを100μg/mlのアン
ピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質
転換体を得た。
pMPI505を保有するエシェリヒア・コリJM109（宝酒造
製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミド
を調製し、塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定
は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーら
の方法（J.Mol.Biol.,143,161（1980））に従って行っ
た。決定したオープン・リーデイング・フレームの塩基
配列を配列表配列番号２に示した。また、この塩基配列
より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号
３に示した。このアミノ酸配列中に精製酵素のＮ末端ア
ミノ酸配列と完全に一致する配列が存在した。精製酵素
のＮ末端は配列番号３に示される配列の21番目のアラニ
ン残基から開始していたため、配列番号３に示されるア
ミノ酸配列は前駆体蛋白質の配列であり、１番目のメチ
オニン残基から20番目のアラニン残基までのペプチドは
翻訳後に除去されるものと考えられた。これより推定さ
れる成熟蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号４に示
した。アミノ酸配列から予測される成熟蛋白質の分子量
は24.9キロダルトンと算出され、精製酵素のSDS−PAGE
の結果とよく一致した。以上の結果及び本断片を含むプ
ラスミドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示すこと
から本オープン・リーデイング・フレームは目的の酸性
フォスファターゼをコードする領域であると同定した。
製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミド
を調製し、塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定
は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーら
の方法（J.Mol.Biol.,143,161（1980））に従って行っ
た。決定したオープン・リーデイング・フレームの塩基
配列を配列表配列番号２に示した。また、この塩基配列
より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号
３に示した。このアミノ酸配列中に精製酵素のＮ末端ア
ミノ酸配列と完全に一致する配列が存在した。精製酵素
のＮ末端は配列番号３に示される配列の21番目のアラニ
ン残基から開始していたため、配列番号３に示されるア
ミノ酸配列は前駆体蛋白質の配列であり、１番目のメチ
オニン残基から20番目のアラニン残基までのペプチドは
翻訳後に除去されるものと考えられた。これより推定さ
れる成熟蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号４に示
した。アミノ酸配列から予測される成熟蛋白質の分子量
は24.9キロダルトンと算出され、精製酵素のSDS−PAGE
の結果とよく一致した。以上の結果及び本断片を含むプ
ラスミドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示すこと
から本オープン・リーデイング・フレームは目的の酸性
フォスファターゼをコードする領域であると同定した。
塩基配列、アミノ酸配列各々について既知の配列との
相同性比較を行った。用いたデーターベースはEMBL及び
SWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号２に示
される塩基配列は、既知のモルガネラ・モルガニ由来の
酸性フォスファターゼ遺伝子（Thaller,M.C.et.al.Micr
obiology,140,1341（1994））では、54番目のＧがＡ、7
2番目のＧがＡ、276番目のＴがＧ、378番目のＴがＣ、4
20番目のＧがＴ、525番目のＣがＧ、529番目のＣがＴ、
531番目のＧがＡである以外は配列が一致し、また配列
表配列番号４に示されるアミノ酸配列は、モルガネラ・
モルガニ由来の酸性フォスファターゼと同一であること
が判明した。すなわち、配列表配列番号４に示されるア
ミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が、モル
ガネラ・モルガニNCIMB10466の酸性フォスファターゼ遺
伝子である。
相同性比較を行った。用いたデーターベースはEMBL及び
SWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号２に示
される塩基配列は、既知のモルガネラ・モルガニ由来の
酸性フォスファターゼ遺伝子（Thaller,M.C.et.al.Micr
obiology,140,1341（1994））では、54番目のＧがＡ、7
2番目のＧがＡ、276番目のＴがＧ、378番目のＴがＣ、4
20番目のＧがＴ、525番目のＣがＧ、529番目のＣがＴ、
531番目のＧがＡである以外は配列が一致し、また配列
表配列番号４に示されるアミノ酸配列は、モルガネラ・
モルガニ由来の酸性フォスファターゼと同一であること
が判明した。すなわち、配列表配列番号４に示されるア
ミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が、モル
ガネラ・モルガニNCIMB10466の酸性フォスファターゼ遺
伝子である。
なお、前駆体蛋白質は249個のアミノ酸から成り、そ
の配列から予想される蛋白質の分子量は27.0キロダルト
ンであった。
の配列から予想される蛋白質の分子量は27.0キロダルト
ンであった。
また、pMPI505をエシェリヒア・コリJM109に保持させ
た株は、AJ13143と命名され、平成８年２月23日付で工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305日本国
茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に
基づき国際寄託され、寄託番号FERM BP−5422が付与さ
れている。
た株は、AJ13143と命名され、平成８年２月23日付で工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305日本国
茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に
基づき国際寄託され、寄託番号FERM BP−5422が付与さ
れている。
実施例９ モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の酸性
フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例８にて構築したエシェリヒア・コリJM109/pMPI
505をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地5
0mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠
心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。
菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に
懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕した。処理
液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調
製した。
フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例８にて構築したエシェリヒア・コリJM109/pMPI
505をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地5
0mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠
心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。
菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に
懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕した。処理
液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調
製した。
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、プラスミド
pUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・コリJM109
及びモルガネラ・モルガニ野生株より調製した無細胞抽
出液の活性を対照として測定した結果を表７に示した。
エシェリヒア・コリJM109/pUC118では燐酸転移活性は検
出されず、モルガネラ・モルガニ野生株でも燐酸転移活
性は低かった。一方、エシェリヒア・コリJM109/pMPI50
5はモルガネラ・モルガニ野生株に比べて比活性で150倍
と高い燐酸転移活性を示しており、この結果から導入し
たDNA断片がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスフ
ァターゼを高発現していることが示された。
pUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・コリJM109
及びモルガネラ・モルガニ野生株より調製した無細胞抽
出液の活性を対照として測定した結果を表７に示した。
エシェリヒア・コリJM109/pUC118では燐酸転移活性は検
出されず、モルガネラ・モルガニ野生株でも燐酸転移活
性は低かった。一方、エシェリヒア・コリJM109/pMPI50
5はモルガネラ・モルガニ野生株に比べて比活性で150倍
と高い燐酸転移活性を示しており、この結果から導入し
たDNA断片がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスフ
ァターゼを高発現していることが示された。
実施例10 モルガネラ・モルガニNCIMB10466由来の酸性
フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから
５′−イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記のエシェリヒア・コリJM109/pMPI505の菌体を乾燥
菌体重量で100mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維
持しながら、30℃で６時間反応を行い、経時的に生成し
た５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイ
ノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸及
び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結
果を図４に示す。酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は
著量の酸性フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピ
ロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸生産反応にお
いては、非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生
成蓄積した。しかし、反応時間をのばすと生成蓄積した
５′−イノシン酸の分解による減少が認められた。
フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから
５′−イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記のエシェリヒア・コリJM109/pMPI505の菌体を乾燥
菌体重量で100mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維
持しながら、30℃で６時間反応を行い、経時的に生成し
た５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイ
ノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸及
び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結
果を図４に示す。酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は
著量の酸性フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピ
ロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸生産反応にお
いては、非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生
成蓄積した。しかし、反応時間をのばすと生成蓄積した
５′−イノシン酸の分解による減少が認められた。
実施例11 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子の作成 実施例９及び10に示したように酸性フォスファターゼ
遺伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、
本菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン
酸生産反応においては、非常に効率よく短時間で５′−
イノシン酸が生成蓄積する。しかし、生成した５′−イ
ノシン酸が酸性フォスファターゼ自体が有する燐酸エス
テル加水分解活性によって分解を受けるために５′−イ
ノシン酸の蓄積量がある程度以上は上がらないことが判
明した。そこで実施例７にてクローニングしたモルガネ
ラ・モルガニNCIMB10466由来酸性フォスファターゼ遺伝
子にPCRを用いる部位特異的変異法により変異を導入
し、酵素の改質を行った。
ファターゼ遺伝子の作成 実施例９及び10に示したように酸性フォスファターゼ
遺伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、
本菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン
酸生産反応においては、非常に効率よく短時間で５′−
イノシン酸が生成蓄積する。しかし、生成した５′−イ
ノシン酸が酸性フォスファターゼ自体が有する燐酸エス
テル加水分解活性によって分解を受けるために５′−イ
ノシン酸の蓄積量がある程度以上は上がらないことが判
明した。そこで実施例７にてクローニングしたモルガネ
ラ・モルガニNCIMB10466由来酸性フォスファターゼ遺伝
子にPCRを用いる部位特異的変異法により変異を導入
し、酵素の改質を行った。
DNA合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル3
94）を用いてホスホアミダイト法にて配列表配列番号
５、６及び７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドΜ
UT500、MUT510及びMUT520をそれぞれ合成した 鋳型として実施例８で調製したプラスミドpMPI505 1n
g、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）と
MUT510オリゴヌクレオチド各2.5μmol及びタックDNAポ
リメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、d
GTP、dTTP各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネ
シウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）1
00μｌに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分
のサイクルを25回繰り返すPCR反応を行った。PCR反応は
サーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行
った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pMPI505 1n
g、プライマーとしてM13プライマーM4（宝酒造社製）と
MUT500オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にPC
R反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカ
ラムＳ−400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過に
より精製し、プライマーを除去した。
94）を用いてホスホアミダイト法にて配列表配列番号
５、６及び７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドΜ
UT500、MUT510及びMUT520をそれぞれ合成した 鋳型として実施例８で調製したプラスミドpMPI505 1n
g、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）と
MUT510オリゴヌクレオチド各2.5μmol及びタックDNAポ
リメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、d
GTP、dTTP各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネ
シウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）1
00μｌに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分
のサイクルを25回繰り返すPCR反応を行った。PCR反応は
サーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行
った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pMPI505 1n
g、プライマーとしてM13プライマーM4（宝酒造社製）と
MUT500オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にPC
R反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカ
ラムＳ−400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過に
より精製し、プライマーを除去した。
それぞれのPCR反応液１μｌをdATP、dCTP、dGTP、dTT
P各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシウム1.
5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）95μｌに
添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却
した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。
これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72
℃で３分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次
に、この反応液にM13プライマーRV及びM13プライマーM4
各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を２分、72℃
を３分のサイクルを10回繰り返すPCR反応を行った。
P各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシウム1.
5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）95μｌに
添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却
した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。
これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72
℃で３分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次
に、この反応液にM13プライマーRV及びM13プライマーM4
各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を２分、72℃
を３分のサイクルを10回繰り返すPCR反応を行った。
２回目のPCRの生成物をHind IIIとEcoR Iで切断後フ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。
このDNAをHind III及びEcoR Iで切断したpUC118に結合
し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によりエシェ
リヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転換した。これ
を100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレ
ーテイングし、形質転換体を得た。形質転換体よりアル
カリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定
を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。
塩基配列の決定はTaq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequ
encing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い、
サンガーらの方法（J.Mol.Biol.,143,161（1980））に
従って行った。このようにして成熟蛋白質の72番目のグ
リシン残基（GGT）がアスパラギン酸残基（Ｇ＊AT）に
置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺
伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプラスミドを
pMPI510と命令した。
ェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。
このDNAをHind III及びEcoR Iで切断したpUC118に結合
し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によりエシェ
リヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転換した。これ
を100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレ
ーテイングし、形質転換体を得た。形質転換体よりアル
カリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定
を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。
塩基配列の決定はTaq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequ
encing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い、
サンガーらの方法（J.Mol.Biol.,143,161（1980））に
従って行った。このようにして成熟蛋白質の72番目のグ
リシン残基（GGT）がアスパラギン酸残基（Ｇ＊AT）に
置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺
伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプラスミドを
pMPI510と命令した。
また、鋳型としてpMPI505、プライマーとしてMUT500
とMUT520オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作によ
り、成熟蛋白質の151番目のイソロイシン残基（ATC）が
スレオニン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォスファ
ターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変異
型遺伝子を含むプラスミドをpMPI520と命名した。さら
に鋳型としてpMPI510、プライマーとしてMUT500とMUT52
0オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟
蛋白質の72番目のグリシン残基（GGT）がアスパラギン
酸残基（Ｇ＊AT）に、151番目のイソロイシン残基（AT
C）がスレオニン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォ
スファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。こ
の変異型遺伝子を含むプラスミドをpMPI530と命名し
た。
とMUT520オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作によ
り、成熟蛋白質の151番目のイソロイシン残基（ATC）が
スレオニン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォスファ
ターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変異
型遺伝子を含むプラスミドをpMPI520と命名した。さら
に鋳型としてpMPI510、プライマーとしてMUT500とMUT52
0オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟
蛋白質の72番目のグリシン残基（GGT）がアスパラギン
酸残基（Ｇ＊AT）に、151番目のイソロイシン残基（AT
C）がスレオニン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォ
スファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。こ
の変異型遺伝子を含むプラスミドをpMPI530と命名し
た。
それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI51
0、エシェリヒア・コリJM109/pMPI520、エシェリヒア・
コリJM109/pMPI530及び野生型酸性フォスファターゼ遺
伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM
109/pMPI505をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含
むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養
液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗
浄した。菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（p
H7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を
破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無
細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液の燐酸エ
ステル加水分解活性及び燐酸転移活性をpH4.0にて測定
し、野生株のものと比較した。
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI51
0、エシェリヒア・コリJM109/pMPI520、エシェリヒア・
コリJM109/pMPI530及び野生型酸性フォスファターゼ遺
伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM
109/pMPI505をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含
むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養
液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗
浄した。菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（p
H7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を
破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無
細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液の燐酸エ
ステル加水分解活性及び燐酸転移活性をpH4.0にて測定
し、野生株のものと比較した。
野生型および変異型酸性フォスファターゼの燐酸エス
テル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定した結果を表
８に示す。変異型酸性フォスファターゼは、野生型酸性
フォスファターゼと比較して、燐酸エステル加水分解活
性と燐酸転移活性がいずれも低下していたが、燐酸エス
テル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その結
果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分
解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フォスファター
ゼに比べて低くなっていた。
テル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定した結果を表
８に示す。変異型酸性フォスファターゼは、野生型酸性
フォスファターゼと比較して、燐酸エステル加水分解活
性と燐酸転移活性がいずれも低下していたが、燐酸エス
テル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その結
果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分
解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フォスファター
ゼに比べて低くなっていた。
実施例12 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イ
ノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI510、エシェ
リヒア・コリJM109/pMPI520、エシェリヒア・コリJM109
/pMPI530及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI50
5をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50m
lに接種し、37℃で16時間培養した。
ファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イ
ノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI510、エシェ
リヒア・コリJM109/pMPI520、エシェリヒア・コリJM109
/pMPI530及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI50
5をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50m
lに接種し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記の培養で得たエシェリヒア・コリ各菌体の菌体を乾
燥菌体重量で100mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に
維持しながら、30℃で22時間反応を行い、経時的に生成
した５′−イノシン酸の量を測定した。結果を図５に示
す。
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記の培養で得たエシェリヒア・コリ各菌体の菌体を乾
燥菌体重量で100mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に
維持しながら、30℃で22時間反応を行い、経時的に生成
した５′−イノシン酸の量を測定した。結果を図５に示
す。
図５中、縦軸は５′−イノシン酸の濃度（mg/dl）
を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pMPI505、黒
埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
JM109/pMPI510、白抜き円形はエシェリヒア・コリ（Esc
herichia coli）JM109/pMPI520、白抜き四角形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pMPI530の各
菌体を使用した場合の反応の推移を示す。
を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pMPI505、黒
埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
JM109/pMPI510、白抜き円形はエシェリヒア・コリ（Esc
herichia coli）JM109/pMPI520、白抜き四角形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pMPI530の各
菌体を使用した場合の反応の推移を示す。
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファター
ゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸
の生産反応においては生成した５′−イノシン酸の分解
速度が低下しており、その結果として５′−イノシン酸
の収率及び蓄積量が向上した。72番目のグリシン残基及
び151番目のイソロイシン残基がそれぞれアスパラギン
酸残基及びスレオニン残基へと置換された変異型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株エシェリヒア・コリJM109/
pMPI530が最も高い５′−イノシン酸の蓄積を示した。
ゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸
の生産反応においては生成した５′−イノシン酸の分解
速度が低下しており、その結果として５′−イノシン酸
の収率及び蓄積量が向上した。72番目のグリシン残基及
び151番目のイソロイシン残基がそれぞれアスパラギン
酸残基及びスレオニン残基へと置換された変異型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株エシェリヒア・コリJM109/
pMPI530が最も高い５′−イノシン酸の蓄積を示した。
実施例13 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いた各巣ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI530をアンピ
シリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
ファターゼ遺伝子保持株を用いた各巣ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI530をアンピ
シリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及び燐酸受容体としてイノ
シン、グアノシイン、ウリジン又はシチジン6g/dlを100
mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解し、これ
に上記の菌体を乾燥菌体重量で100mg/dlとなるように添
加し、pHを4.0に維持しながら、30℃で22時間反応させ
た。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルの量を
表９に示した。なお、ヌクレオチドはヌクレオシド−
５′−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２′−燐酸エ
ステル及びヌクレオシド−３′−燐酸エステルの副生は
全く認められなかった。
シン、グアノシイン、ウリジン又はシチジン6g/dlを100
mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解し、これ
に上記の菌体を乾燥菌体重量で100mg/dlとなるように添
加し、pHを4.0に維持しながら、30℃で22時間反応させ
た。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルの量を
表９に示した。なお、ヌクレオチドはヌクレオシド−
５′−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２′−燐酸エ
ステル及びヌクレオシド−３′−燐酸エステルの副生は
全く認められなかった。
実施例14 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いた各種燐酸化合物を燐酸
供与体とする５′−イノシン酸の生産 変動型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI530を、アン
ピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
ファターゼ遺伝子保持株を用いた各種燐酸化合物を燐酸
供与体とする５′−イノシン酸の生産 変動型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pMPI530を、アン
ピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
イノシン6g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナ
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製）、フェニル酢酸ジナトリウム又は
カルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウムバ
ッファー（pH4.5）に溶解し、これに上記の菌体を乾燥
菌体重量で100mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維
持しながら30℃で22時間反応させた。生成した５′−イ
ノシン酸の量を表10に示した。いずれの燐酸供与体を用
いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生成蓄積した
が、ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合に最も５′
−イノシン酸の蓄積量が高かった。
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製）、フェニル酢酸ジナトリウム又は
カルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウムバ
ッファー（pH4.5）に溶解し、これに上記の菌体を乾燥
菌体重量で100mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維
持しながら30℃で22時間反応させた。生成した５′−イ
ノシン酸の量を表10に示した。いずれの燐酸供与体を用
いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生成蓄積した
が、ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合に最も５′
−イノシン酸の蓄積量が高かった。
実施例15 エシェリヒア・ブラッタエ染色体からの酸性
フォスファターゼをコードする遺伝子の単離 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650の無細胞抽出液か
ら精製した酸性フォスファターゼをDITCメンブレン（ミ
リジェン／バイオサーチ社製）に吸着させ、Prosequenc
er6625（ミリジェン／バイオサーチ社製）を用いてＮ末
端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番号８に示す
15残基のＮ末端アミノ酸配列が決定された。
フォスファターゼをコードする遺伝子の単離 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650の無細胞抽出液か
ら精製した酸性フォスファターゼをDITCメンブレン（ミ
リジェン／バイオサーチ社製）に吸着させ、Prosequenc
er6625（ミリジェン／バイオサーチ社製）を用いてＮ末
端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番号８に示す
15残基のＮ末端アミノ酸配列が決定された。
（２）酸性フォスファターゼをコードする遺伝子断片の
単離 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650の培養菌体からMur
ray and Thomsonの方法（Nucl.Acid Res.,4321,8（198
0））に従い、染色体DNAを調製した。これをSau3A Iで
部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離により３〜6k
bpのDNA断片を分画した。プラスミドベクターpUC118
（宝酒造社製）をBamH Iで切断し、部分分解した染色体
DNA断片と連結させた。DNAの連結はDNAライゲーション
キット（宝酒造社製）を用い、指定された方法にて行っ
た。次いで、得られたDNA混合物を用いて常法によりエ
シェリヒア・コリJM109（宝酒造社製）を形質転換し
た。形質転換をアンピシリン100μ/mlを含むＬ寒天培地
上にプレーティングして生育させ、遺伝子ライブラリー
を作成した。
単離 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650の培養菌体からMur
ray and Thomsonの方法（Nucl.Acid Res.,4321,8（198
0））に従い、染色体DNAを調製した。これをSau3A Iで
部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離により３〜6k
bpのDNA断片を分画した。プラスミドベクターpUC118
（宝酒造社製）をBamH Iで切断し、部分分解した染色体
DNA断片と連結させた。DNAの連結はDNAライゲーション
キット（宝酒造社製）を用い、指定された方法にて行っ
た。次いで、得られたDNA混合物を用いて常法によりエ
シェリヒア・コリJM109（宝酒造社製）を形質転換し
た。形質転換をアンピシリン100μ/mlを含むＬ寒天培地
上にプレーティングして生育させ、遺伝子ライブラリー
を作成した。
形質転換体の生育した寒天培地の表面に4mM p−ニト
ロフェニル燐酸及び100mMメス/NaOHバッファー（pH6.
5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分間保温した。フォ
スファターゼ活性を発現した菌は、ｐ−ニトロフェノー
ルを遊離して黄色を示すため、これを指標として、形質
転換体を選択した。約8,000株の形質転換体の染色体遺
伝子発現ライブラリーを探索した結果、フォスファター
ゼ活性を発現した形質転換体14株が得られた。
ロフェニル燐酸及び100mMメス/NaOHバッファー（pH6.
5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分間保温した。フォ
スファターゼ活性を発現した菌は、ｐ−ニトロフェノー
ルを遊離して黄色を示すため、これを指標として、形質
転換体を選択した。約8,000株の形質転換体の染色体遺
伝子発現ライブラリーを探索した結果、フォスファター
ゼ活性を発現した形質転換体14株が得られた。
フォスファターゼ活性を発現した14株の形質転換体を
単コロニー分離し、アンピシリン100μg/mlを含むＬ培
地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。培養液より
集菌した菌体にイノシン2g/dl及びピロ燐酸ナトリウム1
0g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）5
0μｌを添加し、30℃で16時間反応を行った。HPLC分析
にて５′−イノシン酸の生成を検出し、燐酸転移活性を
持つ菌株を選択した。その結果、燐酸転移活性を示し、
目的の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると予
想される形質転換体３株を得ることができた。
単コロニー分離し、アンピシリン100μg/mlを含むＬ培
地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。培養液より
集菌した菌体にイノシン2g/dl及びピロ燐酸ナトリウム1
0g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）5
0μｌを添加し、30℃で16時間反応を行った。HPLC分析
にて５′−イノシン酸の生成を検出し、燐酸転移活性を
持つ菌株を選択した。その結果、燐酸転移活性を示し、
目的の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると予
想される形質転換体３株を得ることができた。
実施例16 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650由来酸性
フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例15で得られたエシェリヒア・ブラッタエJCM165
0由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むDNA断片を保有
すると予想される形質転換体の１株よりアルカリ溶菌法
によりプラスミドを調製し、挿入されたDNA断片の解析
を行った。このプラスミドをpMPI301と命名した。決定
した挿入DNA断片の制限酵素地図を図６に示す。
フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例15で得られたエシェリヒア・ブラッタエJCM165
0由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むDNA断片を保有
すると予想される形質転換体の１株よりアルカリ溶菌法
によりプラスミドを調製し、挿入されたDNA断片の解析
を行った。このプラスミドをpMPI301と命名した。決定
した挿入DNA断片の制限酵素地図を図６に示す。
さらにサブクローニングにより酸性フォスファターゼ
遺伝子領域を限定した結果、制限酵素Cla IとBamH Iで
切り出される2.4Kbpの大きさの断片中に本酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩
基配列の決定のために該断片をCla I及びBamH Iで切断
したpBluescript KS（＋）（ストラテジーン社製）に結
合したプラスミドDNAを構築した。pEPI305と命名したこ
のプラスミドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コ
リJM109（宝酒造製）を形質転換し、これをアンピシリ
ン100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、
形質転換体を得た。
遺伝子領域を限定した結果、制限酵素Cla IとBamH Iで
切り出される2.4Kbpの大きさの断片中に本酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩
基配列の決定のために該断片をCla I及びBamH Iで切断
したpBluescript KS（＋）（ストラテジーン社製）に結
合したプラスミドDNAを構築した。pEPI305と命名したこ
のプラスミドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コ
リJM109（宝酒造製）を形質転換し、これをアンピシリ
ン100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、
形質転換体を得た。
pMPI305を保有するエシェリヒア・コリJM109（宝酒造
製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミド
を調製し、塩基配列の決定を行った。決定したオープン
・リーデイング・フレームの塩基配列を配列表配列番号
９に示した。この塩基配列より推定される蛋白質のアミ
ノ酸配列を配列表配列番号10に示した。このアミノ酸配
列中に精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致する
配列が存在した。精製酵素のＮ末端は配列表配列番号10
の配列の19番目のロイシン残基から開始していたため、
配列番号10に示されるアミノ酸配列は前駆体蛋白質の配
列であり、１番目のメチオニン残基から18番目のアラニ
ン残基までのペプチドは翻訳後に除去されるものと考え
られた。これより推定される成熟蛋白質のアミノ酸配列
を配列表配列番号11に示した。これにより予想される成
熟蛋白質の分子量は25.1キロダルトンと算出され、精製
酵素のSDS−PAGEの結果とよく一致した。以上の結果及
び本断片を含むプラスミドを有する形質転換体が燐酸転
移活性を示すことから本オープン・リーデイング・フレ
ームは目的の酸性フォスファターゼをコードする領域で
あると同定した。
製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミド
を調製し、塩基配列の決定を行った。決定したオープン
・リーデイング・フレームの塩基配列を配列表配列番号
９に示した。この塩基配列より推定される蛋白質のアミ
ノ酸配列を配列表配列番号10に示した。このアミノ酸配
列中に精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致する
配列が存在した。精製酵素のＮ末端は配列表配列番号10
の配列の19番目のロイシン残基から開始していたため、
配列番号10に示されるアミノ酸配列は前駆体蛋白質の配
列であり、１番目のメチオニン残基から18番目のアラニ
ン残基までのペプチドは翻訳後に除去されるものと考え
られた。これより推定される成熟蛋白質のアミノ酸配列
を配列表配列番号11に示した。これにより予想される成
熟蛋白質の分子量は25.1キロダルトンと算出され、精製
酵素のSDS−PAGEの結果とよく一致した。以上の結果及
び本断片を含むプラスミドを有する形質転換体が燐酸転
移活性を示すことから本オープン・リーデイング・フレ
ームは目的の酸性フォスファターゼをコードする領域で
あると同定した。
すなわち、配列表番号11に示されるアミノ酸配列から
なる蛋白質をコードする遺伝子が、エシェリヒア・ブラ
ッタエJCM1650の酸性フォスファターゼ遺伝子である。
なる蛋白質をコードする遺伝子が、エシェリヒア・ブラ
ッタエJCM1650の酸性フォスファターゼ遺伝子である。
塩基配列、アミノ酸配列各々について既知の配列との
相同性比較を行った。用いたデーターベースはEMBL及び
SWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号８に示
される蛋白質及びそれをコードするDNAは新規であるこ
とが判明した。本遺伝子のコードする前駆体タンパク質
は249個のアミノ酸から成り、その配列から予想される
蛋白質の分子量は27.0キロダルトンであった。
相同性比較を行った。用いたデーターベースはEMBL及び
SWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号８に示
される蛋白質及びそれをコードするDNAは新規であるこ
とが判明した。本遺伝子のコードする前駆体タンパク質
は249個のアミノ酸から成り、その配列から予想される
蛋白質の分子量は27.0キロダルトンであった。
アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較
を行った結果、本蛋白質はプロビデンシア・スチュアル
ティ（Providencia stuartii）の酸性フォスファターゼ
と77.4％、実施例のモルガネラ・モルガニ（Morganella
morganii）の酸性フォスファターゼと77.1％、サルモ
ネラ・チヒムリウム（Salmonella typhimurium）の酸性
フォスファターゼと44.3％の相同性を示した。
を行った結果、本蛋白質はプロビデンシア・スチュアル
ティ（Providencia stuartii）の酸性フォスファターゼ
と77.4％、実施例のモルガネラ・モルガニ（Morganella
morganii）の酸性フォスファターゼと77.1％、サルモ
ネラ・チヒムリウム（Salmonella typhimurium）の酸性
フォスファターゼと44.3％の相同性を示した。
なお、pMPI305をエシェリヒア・コリJM109に保持させ
た株は、AJ13144と命名され、平成８年２月23日付で工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305日本国
茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に
基づき国際寄託され、寄託番号FERM BP−5422が付与さ
れている。
た株は、AJ13144と命名され、平成８年２月23日付で工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305日本国
茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に
基づき国際寄託され、寄託番号FERM BP−5422が付与さ
れている。
実施例17 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650由来の酸
性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例16で作成したエシェリヒア・コリJM109/pMPI30
5をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50m
lに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠心
分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌
体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸
濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。
処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液
を調製した。
性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例16で作成したエシェリヒア・コリJM109/pMPI30
5をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50m
lに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠心
分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌
体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸
濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。
処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液
を調製した。
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、プラスミド
pBluescript KS（＋）で同様に形質転換したエシェリヒ
ア・コリJM109及びエシェリヒア・ブラッタエ野生株よ
り調製した無細胞抽出液を対照として測定した結果を表
11に示した。エシェリヒア・コリJM109/pBluescript KS
（＋）では燐酸転移活性は検出されず、エシェリヒア・
ブラッタエ野生株でも燐酸転移活性は低かった。一方、
エシェリヒア・コリJM109/pMPI305はエシェリヒア・ブ
ラッタエ野生株に比べて比活性で120倍と高い燐酸転移
活性を示しており、この結果から導入したDNA断片がエ
シェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを高発
現していることが示された。
pBluescript KS（＋）で同様に形質転換したエシェリヒ
ア・コリJM109及びエシェリヒア・ブラッタエ野生株よ
り調製した無細胞抽出液を対照として測定した結果を表
11に示した。エシェリヒア・コリJM109/pBluescript KS
（＋）では燐酸転移活性は検出されず、エシェリヒア・
ブラッタエ野生株でも燐酸転移活性は低かった。一方、
エシェリヒア・コリJM109/pMPI305はエシェリヒア・ブ
ラッタエ野生株に比べて比活性で120倍と高い燐酸転移
活性を示しており、この結果から導入したDNA断片がエ
シェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを高発
現していることが示された。
実施例18 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650由来の酸
性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから
５′−イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記のエシェリヒア・コリJM109/pMPI305の菌体を乾燥
菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維
持しながら、35℃で10時間反応を行い、経時的に生成し
た５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイ
ノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸及
び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結
果を図７に示す。本菌を用いたピロ燐酸とイノシンから
の５′−イノシン酸生産反応においては、非常に効率よ
く短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積した。
性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから
５′−イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記のエシェリヒア・コリJM109/pMPI305の菌体を乾燥
菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維
持しながら、35℃で10時間反応を行い、経時的に生成し
た５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイ
ノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸及
び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結
果を図７に示す。本菌を用いたピロ燐酸とイノシンから
の５′−イノシン酸生産反応においては、非常に効率よ
く短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積した。
実施例19 燐酸エステル加水分解性低下型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子の作成 実施例17及び18に示したようにエシェリヒア・ブラッ
タエ由来酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は著量の酸
性フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピロ燐酸と
イノシンからの５′−イノシン酸生産反応においては、
非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積す
る。しかし、生成した５′−イノシン酸が酸性フォスフ
ァターゼ自体が有する燐酸エステル加水分解活性によっ
て分解を受けるために５′−イノシン酸の蓄積量がある
程度以上は上がらないことが判明した。そこで実施例15
にてクローニングしたエシェリヒア・ブラッタエ由来酸
性フォスファターゼ遺伝子にPCRを用いる部位特異的変
異法により変異を導入し、酵素の性質の改良を行うこと
としたた。
ァターゼ遺伝子の作成 実施例17及び18に示したようにエシェリヒア・ブラッ
タエ由来酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は著量の酸
性フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピロ燐酸と
イノシンからの５′−イノシン酸生産反応においては、
非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積す
る。しかし、生成した５′−イノシン酸が酸性フォスフ
ァターゼ自体が有する燐酸エステル加水分解活性によっ
て分解を受けるために５′−イノシン酸の蓄積量がある
程度以上は上がらないことが判明した。そこで実施例15
にてクローニングしたエシェリヒア・ブラッタエ由来酸
性フォスファターゼ遺伝子にPCRを用いる部位特異的変
異法により変異を導入し、酵素の性質の改良を行うこと
としたた。
DNA合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル3
94）を用いてホスホアミダイト法にて配列表配列番号1
2、13及び14に示すオリゴヌクレオチドΜUT300、MUT310
及びMUT320をそれぞれ合成した 鋳型として実施例16で調製したプラスミドpEPI305 1n
g、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）と
MUT310オリゴヌクレオチド各2.5μmol及びタックDNAポ
リメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、d
GTP、dTTP各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネ
シウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）1
00μｌに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分
のサイクルを25回繰り返すPCR反応を行った。PCR反応は
サーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行
った。また別に、鋳型としてプラスミドpEPI305 1ng、
プライマーとしてM13プライマーM3（宝酒造社製）及びM
UT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にPCR
反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラ
ムＳ−400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過によ
り精製し、プライマーを除去した。
94）を用いてホスホアミダイト法にて配列表配列番号1
2、13及び14に示すオリゴヌクレオチドΜUT300、MUT310
及びMUT320をそれぞれ合成した 鋳型として実施例16で調製したプラスミドpEPI305 1n
g、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）と
MUT310オリゴヌクレオチド各2.5μmol及びタックDNAポ
リメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、d
GTP、dTTP各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネ
シウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）1
00μｌに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分
のサイクルを25回繰り返すPCR反応を行った。PCR反応は
サーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行
った。また別に、鋳型としてプラスミドpEPI305 1ng、
プライマーとしてM13プライマーM3（宝酒造社製）及びM
UT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にPCR
反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラ
ムＳ−400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過によ
り精製し、プライマーを除去した。
それぞれのPCR反応液１μｌをdATP、dCTP、dGTP、dTT
P各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシウム1.
5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）95μｌに
添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却
した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。
これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72
℃で３分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次
に、この反応液にM13プライマーRV及びM13プライマーM3
各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を２分、72℃
を３分のサイクルを10回繰り返すPCR反応を行った。
P各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシウム1.
5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）95μｌに
添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却
した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。
これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72
℃で３分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次
に、この反応液にM13プライマーRV及びM13プライマーM3
各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を２分、72℃
を３分のサイクルを10回繰り返すPCR反応を行った。
２回目のPCRの生成物をCla IとBamH Iで切断後フェノ
ール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。この
DNA断片をCla IとBamH Iで切断したpBluescript KS
（＋）に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法
によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転
換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天
培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。
ール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。この
DNA断片をCla IとBamH Iで切断したpBluescript KS
（＋）に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法
によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転
換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天
培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。
形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調
製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されて
いることを確認した。このようにして成熟蛋白質の74番
目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（Ｇ＊
Ａ＊Ｔ）に置換した変異型フォスファターゼをコードす
る変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプ
ラスミドをpEPI310と命令した。
製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されて
いることを確認した。このようにして成熟蛋白質の74番
目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（Ｇ＊
Ａ＊Ｔ）に置換した変異型フォスファターゼをコードす
る変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプ
ラスミドをpEPI310と命令した。
鋳型としてpEPI305、プライマーとしてMUT300とMUT32
0オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟
蛋白質の153番目のイソロイシン残基（ATC）がスレオニ
ン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォスファターゼを
コードする変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子
を含むプラスミドをpEPI320と命名した。さらに鋳型と
してpEPI310、プライマーとしてMUT300とMUT320オリゴ
ヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟蛋白質の
74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基
（Ｇ＊Ａ＊Ｔ）に、153番目のイソロイシン残基（ATC）
がスレオニン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォスフ
ァターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変
異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI330と命名した。
0オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟
蛋白質の153番目のイソロイシン残基（ATC）がスレオニ
ン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォスファターゼを
コードする変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子
を含むプラスミドをpEPI320と命名した。さらに鋳型と
してpEPI310、プライマーとしてMUT300とMUT320オリゴ
ヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟蛋白質の
74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基
（Ｇ＊Ａ＊Ｔ）に、153番目のイソロイシン残基（ATC）
がスレオニン残基（Ａ＊CC）に置換した変異型フォスフ
ァターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変
異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI330と命名した。
それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI31
0、エシェリヒア・コリJM109/pEPI320、エシェリヒア・
コリJM109/pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺
伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM
109/pEPI305をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含
むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養
液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗
浄した。菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（p
H7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を
破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無
細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液の燐酸エ
ステル加水分解活性及び燐酸転移活性をpH4.0にて測定
し、野生株のものと比較した。
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI31
0、エシェリヒア・コリJM109/pEPI320、エシェリヒア・
コリJM109/pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺
伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM
109/pEPI305をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含
むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養
液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗
浄した。菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウムバッファー（p
H7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を
破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無
細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液の燐酸エ
ステル加水分解活性及び燐酸転移活性をpH4.0にて測定
し、野生株のものと比較した。
野生型および変異型酸性フォスファターゼの燐酸エス
テル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定した結果を表
12に示す。変異型酸性フォスファターゼは、野生型酸性
フォスファターゼと比較して、燐酸エステル加水分解活
性と燐酸転移活性がいずれも低下していたが、燐酸エス
テル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その結
果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分
解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フォスファター
ゼに比べて低くなっていた。
テル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定した結果を表
12に示す。変異型酸性フォスファターゼは、野生型酸性
フォスファターゼと比較して、燐酸エステル加水分解活
性と燐酸転移活性がいずれも低下していたが、燐酸エス
テル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その結
果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分
解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フォスファター
ゼに比べて低くなっていた。
実施例20 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イ
ノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI310、エシェ
リヒア・コリJM109/pEPI320、エシェリヒア・コリJM109
/pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI30
5をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50m
lに接種し、37℃で16時間培養した。
ファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イ
ノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI310、エシェ
リヒア・コリJM109/pEPI320、エシェリヒア・コリJM109
/pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI30
5をアンピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50m
lに接種し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g/dlを酢酸
ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記
の培養で得たエシェリヒア・コリ各菌株の菌体を乾燥菌
体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持
しながら、35℃で32時間反応を行い、経時的に生成した
５′−イノシン酸の量を測定した。結果を図８に示す。
ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記
の培養で得たエシェリヒア・コリ各菌株の菌体を乾燥菌
体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持
しながら、35℃で32時間反応を行い、経時的に生成した
５′−イノシン酸の量を測定した。結果を図８に示す。
図８中、縦軸は５′−イノシン酸の濃度（mg/dl）
を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI305、黒
埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
JM109/pEPI310、白抜き円形はエシェリヒア・コリ（Esc
herichia coli）JM109/pEPI320、白抜き四角形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI330の各
菌体を使用した場合の反応の推移を示す。
を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI305、黒
埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
JM109/pEPI310、白抜き円形はエシェリヒア・コリ（Esc
herichia coli）JM109/pEPI320、白抜き四角形はエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI330の各
菌体を使用した場合の反応の推移を示す。
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファター
ゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸
の生産反応においては生成した５′−イノシン酸の分解
速度が低下しており、その結果として５′−イノシン酸
の収率及び蓄積量が向上した。74番目のグリシン残基及
び153番目のイソロイシン残基がそれぞれアスパラギン
酸残基及びスレオニン残基へと置換された変異型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株エシェリヒア・コリJM109/
pEPI330が最も高い５′−イノシン酸の蓄積を示した。
ゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸
の生産反応においては生成した５′−イノシン酸の分解
速度が低下しており、その結果として５′−イノシン酸
の収率及び蓄積量が向上した。74番目のグリシン残基及
び153番目のイソロイシン残基がそれぞれアスパラギン
酸残基及びスレオニン残基へと置換された変異型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株エシェリヒア・コリJM109/
pEPI330が最も高い５′−イノシン酸の蓄積を示した。
実施例21 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI330をアンピ
シリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
ファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI330をアンピ
シリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及び燐酸受容体としてイノ
シン、グアノシン、ウリジン又はシチジン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解し、これに
上記の菌体を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加
し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させ
た。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルの量を
表13に示した。なお、ヌクレオチドはヌクレオシド−
５′−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２′−燐酸エ
ステル及びヌクレオシド−３′−燐酸エステルの副生は
全く認められなかった。
シン、グアノシン、ウリジン又はシチジン6g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解し、これに
上記の菌体を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加
し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させ
た。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルの量を
表13に示した。なお、ヌクレオチドはヌクレオシド−
５′−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２′−燐酸エ
ステル及びヌクレオシド−３′−燐酸エステルの副生は
全く認められなかった。
実施例22 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いる各種燐酸化合物を燐酸
供与体とする５′−イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI330を、アン
ピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
ファターゼ遺伝子保持株を用いる各種燐酸化合物を燐酸
供与体とする５′−イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミド
を導入したエシェリヒア・コリJM109/pEPI330を、アン
ピシリン100μg/ml及びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種
し、37℃で16時間培養した。
イノシン6g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナ
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製品）、フェニル酢酸ジナトリウム又
はカルバミル燐酸ジナトリウム12g/dlを100mM酢酸ナト
リウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記の菌
体を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを
4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させた。生成し
た５′−イノシン酸の量を表14に示した。いずれの燐酸
供与体を用いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生
成蓄積したが、ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合
に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かった。
トリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、
千代田化学（株）製品）、フェニル酢酸ジナトリウム又
はカルバミル燐酸ジナトリウム12g/dlを100mM酢酸ナト
リウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記の菌
体を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを
4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させた。生成し
た５′−イノシン酸の量を表14に示した。いずれの燐酸
供与体を用いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生
成蓄積したが、ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合
に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かった。
実施例23 プロビデンシア・スチュアルティ染色体から
の酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離と塩
基配列の確認 既知のプロビデンシア・スチュアルティの酸性フォス
ファターゼ遺伝子の塩基配列（EMBL Accession number
X64820）を基に、該酸性フォスファターゼ遺伝子を増幅
するようにデザインした配列表配列番号15及び16に示す
配列を有するPCR用オリゴヌクレオチドプライマーPRP1
及びPRP2を合成した。
の酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離と塩
基配列の確認 既知のプロビデンシア・スチュアルティの酸性フォス
ファターゼ遺伝子の塩基配列（EMBL Accession number
X64820）を基に、該酸性フォスファターゼ遺伝子を増幅
するようにデザインした配列表配列番号15及び16に示す
配列を有するPCR用オリゴヌクレオチドプライマーPRP1
及びPRP2を合成した。
プロビデンシア・スチュアルティATCC29851の培養菌
体から、Murry and Thompsonの方法（Nucl.Acid Res.,4
321,8（1980））に従い染色体DNAを調製した。鋳型とし
てこの染色体DNA0.1ng、プライマーとしてPRP1及びPRP2
オリゴヌクレオチド各2.5μmol並びにタックDNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGT
P、dTTP各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシ
ウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100
μｌに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分の
サイクルを30回繰り返すPCR反応を行った。反応液をア
ガロース電気泳動に供し、増幅された約1kbpのDNA断片
をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。こ
の遺伝子断片をBamH Iで切断後、BamH Iで切断したpUC1
18に結合した。このプラスミドをpPRP100と命名した。
体から、Murry and Thompsonの方法（Nucl.Acid Res.,4
321,8（1980））に従い染色体DNAを調製した。鋳型とし
てこの染色体DNA0.1ng、プライマーとしてPRP1及びPRP2
オリゴヌクレオチド各2.5μmol並びにタックDNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGT
P、dTTP各200μＭ、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシ
ウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100
μｌに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分の
サイクルを30回繰り返すPCR反応を行った。反応液をア
ガロース電気泳動に供し、増幅された約1kbpのDNA断片
をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。こ
の遺伝子断片をBamH Iで切断後、BamH Iで切断したpUC1
18に結合した。このプラスミドをpPRP100と命名した。
pPRP100を導入したエシェリヒア・コリJM109/pPRP100
の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定し
た。その結果、本菌は燐酸エステル加水分解活性だけで
なく、ヌクレオシドへの燐酸転移活性も示した。
の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定し
た。その結果、本菌は燐酸エステル加水分解活性だけで
なく、ヌクレオシドへの燐酸転移活性も示した。
エシェリヒア・コリJM109/pPRP100よりアルカリ溶菌
法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定したオー
プン・リーデイング・フレームの塩基配列及びこの塩基
配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列
番号17及び配列番号18に示した。本オープン・リーデイ
ング・フレームの塩基配列は既知のプロビデンシア・ス
チュアルティ酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列と
完全に一致した。
法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定したオー
プン・リーデイング・フレームの塩基配列及びこの塩基
配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列
番号17及び配列番号18に示した。本オープン・リーデイ
ング・フレームの塩基配列は既知のプロビデンシア・ス
チュアルティ酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列と
完全に一致した。
実施例24 エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシ
エラ・プランティコラ及びセラチア・フィカリアの染色
体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単
離と塩基配列の決定 エンテロバクター・アエロゲネスIFO12010、クレブシ
エラ・プランティコラIFO14939及びセラチア・フィカリ
アIAF13540の培養菌体からMurry and Thompsonの方法
（Nucl.Acid Res.,4321,8（1980））に従い、それぞれ
の染色体DNAを調製した。ついで、実施例７（２）と同
様の方法により、約20,000株のエシェリヒア・コリJM10
9の形質転換体よりなる染色体遺伝子発現ライブラリー
をそれぞれ作成し、探索した結果、燐酸転移活性を示す
形質転換体を得ることができた。これらの形質転換体は
それぞれの菌株由来の酸性フォスファターゼ遺伝子を保
有すると考えられた。
エラ・プランティコラ及びセラチア・フィカリアの染色
体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単
離と塩基配列の決定 エンテロバクター・アエロゲネスIFO12010、クレブシ
エラ・プランティコラIFO14939及びセラチア・フィカリ
アIAF13540の培養菌体からMurry and Thompsonの方法
（Nucl.Acid Res.,4321,8（1980））に従い、それぞれ
の染色体DNAを調製した。ついで、実施例７（２）と同
様の方法により、約20,000株のエシェリヒア・コリJM10
9の形質転換体よりなる染色体遺伝子発現ライブラリー
をそれぞれ作成し、探索した結果、燐酸転移活性を示す
形質転換体を得ることができた。これらの形質転換体は
それぞれの菌株由来の酸性フォスファターゼ遺伝子を保
有すると考えられた。
エンテロバクター・アエロゲネスIFO12010由来の酸性
フォスファターゼ遺伝子を保有すると考えられるエシェ
リヒア・コリJM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌
法によりプラスミドを調製し、挿入されたDNA断片の解
析を行った。このプラスミドをpENP100と命名した。決
定したエンテロバクター・アエロゲネスIFO12010由来の
挿入DNA断片の制限酵素地図を図９に示す。
フォスファターゼ遺伝子を保有すると考えられるエシェ
リヒア・コリJM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌
法によりプラスミドを調製し、挿入されたDNA断片の解
析を行った。このプラスミドをpENP100と命名した。決
定したエンテロバクター・アエロゲネスIFO12010由来の
挿入DNA断片の制限酵素地図を図９に示す。
サブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝
子領域を決定した結果、制限酵素Sal Iと制限酵素Kpn I
で切り出される1.6kbpの断片中に本酸性フォスファター
ゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列
の決定のためにこのSal I−Kpn I断片をSal I及びKpn I
で切断したpUC118に結合したプラスミドDNAを構築し
た。このプラスミドをpENP110と命名した。
子領域を決定した結果、制限酵素Sal Iと制限酵素Kpn I
で切り出される1.6kbpの断片中に本酸性フォスファター
ゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列
の決定のためにこのSal I−Kpn I断片をSal I及びKpn I
で切断したpUC118に結合したプラスミドDNAを構築し
た。このプラスミドをpENP110と命名した。
同様に、クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来
の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると考えら
れるエシェリヒア・コリJM109形質転換体の１株よりア
ルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたDN
A断片の解析を行った。このプラスミドをpKLP100と命名
した。決定したクレブシエラ・プランティコラIFO1439
由来の挿入DNA断片の制限酵素地図を図10に示す。
の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると考えら
れるエシェリヒア・コリJM109形質転換体の１株よりア
ルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたDN
A断片の解析を行った。このプラスミドをpKLP100と命名
した。決定したクレブシエラ・プランティコラIFO1439
由来の挿入DNA断片の制限酵素地図を図10に示す。
サブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝
子領域を限定した結果、制限酵素Kpn Iと制限酵素EcoR
Iで切り出される2.2kbpの断片中に本酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配
列の決定のためにこのKpn I−EcoR I断片をKpn IとEcoR
Iで切断したpUC118に結合したプラスミドDNAを構築し
た。このプラスミドをpKLP110と命名した また、セラチア・フィカリアIAM13540由来の酸性フォ
スファターゼ遺伝子断片を保有すると考えられるエシェ
リヒア・コリJM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌
法によりプラスミドを調製し、挿入されたDNA断片の解
析を行った。このプラスミドをpSEP100と命名した。決
定したセラチア・フィカリアIAM13540由来の挿入DNA断
片の制限酵素地図を図11に示す。
子領域を限定した結果、制限酵素Kpn Iと制限酵素EcoR
Iで切り出される2.2kbpの断片中に本酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配
列の決定のためにこのKpn I−EcoR I断片をKpn IとEcoR
Iで切断したpUC118に結合したプラスミドDNAを構築し
た。このプラスミドをpKLP110と命名した また、セラチア・フィカリアIAM13540由来の酸性フォ
スファターゼ遺伝子断片を保有すると考えられるエシェ
リヒア・コリJM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌
法によりプラスミドを調製し、挿入されたDNA断片の解
析を行った。このプラスミドをpSEP100と命名した。決
定したセラチア・フィカリアIAM13540由来の挿入DNA断
片の制限酵素地図を図11に示す。
サブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝
子領域を限定した結果、制限酵素Hind IIIで切り出され
る1.4kbpの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含
まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のため
にこのHind III断片をHind IIIで切断したpUC118に結合
したプラスミドDNAを構築した。このプラスミドをpSEP1
10と命名した。
子領域を限定した結果、制限酵素Hind IIIで切り出され
る1.4kbpの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含
まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のため
にこのHind III断片をHind IIIで切断したpUC118に結合
したプラスミドDNAを構築した。このプラスミドをpSEP1
10と命名した。
pENP110、pKLP110及びpSEP110をそれぞれ導入したエ
シェリヒア・コリJM109/pENP110、エシェリヒア・コリJ
M109/pKLP110及びエシェリヒア・コリJM109/pSEP110の
形質転換体よりアルカリ溶菌法によりそれぞれのプラス
ミドを調製し、実施例８の方法に従い、挿入断片の塩基
配列の決定を行った。決定したそれぞれの挿入断片のオ
ープン・リーデイング・フレーム塩基配列のうちエンテ
ロバクター・アエロゲネスIFO12010由来のものを配列表
配列番号19に、クレブシエラ・プランティコラIFO14939
由来のものを配列表配列番号21に、そしてセラチア・フ
ィカリアIAM13540由来のものを配列表配列番号23に示し
た。また、各々の推定されるアミノ酸配列を配列表配列
番号20、22、24に示した。各DNA断片を含むプラスミド
を有する形質転換体が燐酸転移活性を示したことから、
これらのオープン・リーデイング・フレームは目的の酸
性フォスファターゼ遺伝子であると同定した。
シェリヒア・コリJM109/pENP110、エシェリヒア・コリJ
M109/pKLP110及びエシェリヒア・コリJM109/pSEP110の
形質転換体よりアルカリ溶菌法によりそれぞれのプラス
ミドを調製し、実施例８の方法に従い、挿入断片の塩基
配列の決定を行った。決定したそれぞれの挿入断片のオ
ープン・リーデイング・フレーム塩基配列のうちエンテ
ロバクター・アエロゲネスIFO12010由来のものを配列表
配列番号19に、クレブシエラ・プランティコラIFO14939
由来のものを配列表配列番号21に、そしてセラチア・フ
ィカリアIAM13540由来のものを配列表配列番号23に示し
た。また、各々の推定されるアミノ酸配列を配列表配列
番号20、22、24に示した。各DNA断片を含むプラスミド
を有する形質転換体が燐酸転移活性を示したことから、
これらのオープン・リーデイング・フレームは目的の酸
性フォスファターゼ遺伝子であると同定した。
延期配列、アミノ酸配列各々について既知の配列との
相同性比較を行った。用いたデーターベースはEMBL及び
SWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号19、21
及び23に示される遺伝子はいずれも新規な遺伝子である
ことが判明した。また、エンテロバクター・アエロゲネ
スIFO12010由来の遺伝子がコードする蛋白質は248個、
クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来の遺伝子が
コードする蛋白質は248個、セラチア・フィカリアIAM13
540由来の遺伝子がコードする蛋白質は244個のアミノ酸
からそれぞれなるものと推定された。なお、これらの蛋
白質は、モルガネラ・モルガニ及びエシェリヒア・ブラ
ッタエの酸性フォスファターゼの場合と同様、前駆体蛋
白質である可能性がある。
相同性比較を行った。用いたデーターベースはEMBL及び
SWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号19、21
及び23に示される遺伝子はいずれも新規な遺伝子である
ことが判明した。また、エンテロバクター・アエロゲネ
スIFO12010由来の遺伝子がコードする蛋白質は248個、
クレブシエラ・プランティコラIFO14939由来の遺伝子が
コードする蛋白質は248個、セラチア・フィカリアIAM13
540由来の遺伝子がコードする蛋白質は244個のアミノ酸
からそれぞれなるものと推定された。なお、これらの蛋
白質は、モルガネラ・モルガニ及びエシェリヒア・ブラ
ッタエの酸性フォスファターゼの場合と同様、前駆体蛋
白質である可能性がある。
また、これらの延期配列より予想される蛋白質のアミ
ノ酸配列を実施例８で推定したモルガネラ・モルガニNC
IMB10466、実施例16で推定したエシェリヒア・ブラッタ
エJCM1650及び既知のプロビデンシア・スチュアルティ
（EMBL Accession number X64820）の酸性フォスファタ
ーゼの前駆体蛋白質のアミノ酸配列と共にアミノ酸の一
文字表記で図12に示した。図中ですべてのアミノ酸配列
において共通のアミノ酸残基を配列の下に＊で示した。
ノ酸配列を実施例８で推定したモルガネラ・モルガニNC
IMB10466、実施例16で推定したエシェリヒア・ブラッタ
エJCM1650及び既知のプロビデンシア・スチュアルティ
（EMBL Accession number X64820）の酸性フォスファタ
ーゼの前駆体蛋白質のアミノ酸配列と共にアミノ酸の一
文字表記で図12に示した。図中ですべてのアミノ酸配列
において共通のアミノ酸残基を配列の下に＊で示した。
図12に示したように６種類の菌株中の酸性フォスファ
ターゼのアミノ酸配列は非常に相同性が高く、130個の
アミノ酸残基がすべてのアミノ酸配列において共通して
いた。これより、これらの酸性フォスファターゼは非常
に類似する機能を持つことが予想される。
ターゼのアミノ酸配列は非常に相同性が高く、130個の
アミノ酸残基がすべてのアミノ酸配列において共通して
いた。これより、これらの酸性フォスファターゼは非常
に類似する機能を持つことが予想される。
実施例25 プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロ
バクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコ
ラ及びセラチア・フィカリア由来の酸性フォスファター
ゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例23にて構築したエシェリヒア・コリJM109/pPRP
100、実施例24にて構築したエシェリヒア・コリJM109/p
ENP110、エシェリヒア・コリJM109/pKLP110及びエシェ
リヒア・コリJM109/pSEP110をアンピシリン100μg/ml及
びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培
養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理
食塩水で１回洗浄した。菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウ
ムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波
処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分
を除き、無細胞抽出液を調製した。
バクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコ
ラ及びセラチア・フィカリア由来の酸性フォスファター
ゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例23にて構築したエシェリヒア・コリJM109/pPRP
100、実施例24にて構築したエシェリヒア・コリJM109/p
ENP110、エシェリヒア・コリJM109/pKLP110及びエシェ
リヒア・コリJM109/pSEP110をアンピシリン100μg/ml及
びIPTG1mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培
養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理
食塩水で１回洗浄した。菌体を5mlの100mΜ燐酸カリウ
ムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波
処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分
を除き、無細胞抽出液を調製した。
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、プロビデン
シア・スチュアルティATCC29851、エンテロバクター・
アエロゲネスIFO12010、クレブシエラ・プランティコラ
IFO14939、セラチア・フィカリアIAM13540及びプラスミ
ドpUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・コリJM10
9より調製した無細胞抽出液の活性を対照として測定し
た結果を表15に示した。いずれの菌も野生株の燐酸転移
活性は低かった。また、エシェリヒア・コリJM109/pUC1
18では燐酸転移活性は検出されなかった。一方、酸性フ
ォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリJM
109の形質転換体はいずれも野生株に比べて高い燐酸転
移活性を示しており、この結果から導入した遺伝子断片
がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを
高発現していることが示された。
シア・スチュアルティATCC29851、エンテロバクター・
アエロゲネスIFO12010、クレブシエラ・プランティコラ
IFO14939、セラチア・フィカリアIAM13540及びプラスミ
ドpUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・コリJM10
9より調製した無細胞抽出液の活性を対照として測定し
た結果を表15に示した。いずれの菌も野生株の燐酸転移
活性は低かった。また、エシェリヒア・コリJM109/pUC1
18では燐酸転移活性は検出されなかった。一方、酸性フ
ォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリJM
109の形質転換体はいずれも野生株に比べて高い燐酸転
移活性を示しており、この結果から導入した遺伝子断片
がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを
高発現していることが示された。
産業上の利用分野 本発明により、酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の
条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル
燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選
択される燐酸供与体に作用させることにより、安価かつ
効率よくヌクレオシド−５′−燐酸エステルを製造する
ことができる。特に、本発明により提供される燐酸エス
テル加水分解活性を低下させる変異を有する酸性フォス
ファターゼを用いることにより、一層効率よくヌクレオ
シド−５′−燐酸エステルを製造することができる。
条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル
燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選
択される燐酸供与体に作用させることにより、安価かつ
効率よくヌクレオシド−５′−燐酸エステルを製造する
ことができる。特に、本発明により提供される燐酸エス
テル加水分解活性を低下させる変異を有する酸性フォス
ファターゼを用いることにより、一層効率よくヌクレオ
シド−５′−燐酸エステルを製造することができる。
配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：味の素株式会社 （ii）発明の名称：ヌクレオシド−５′−燐酸エステ
ルの製造法 （iii）配列数:24 （iv）連絡先： （Ａ）宛名： （Ｂ）番地： （Ｃ）市： （Ｄ）州： （Ｅ）国： （Ｆ）ZIP: （ｖ）コンピュータ読取り可能形式 （Ａ）媒体： （Ｂ）コンピュータ： （Ｃ）操作システム： （Ｄ）ソフトウェア： （vi）現行出願データ （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願日 （Ｃ）分類 （viii）代理人／事務所情報 （Ａ）名前： （Ｂ）登録番号： （Ｃ）整理番号： （ix）通信情報 （Ａ）電話番号： （Ｂ）ファクシミリ番号： （２）配列番号１の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:20amino acids （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ｖ）フラグメント型:N末端フラグメント （vi）起源： （Ａ）生物名：モルガネラ・モルガニ（Morganella
morganii） （Ｂ）株名:NCIMB10466 （xi）配列:SEQ ID NO:1: （２）配列番号２の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:750bases （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:Genomic DNA （vi）起源： （Ａ）生物名：モルガネラ・モルガニ（Morganella
morganii） （Ｂ）株名:NCIMB10466 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..747 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:sig_peptide （Ｂ）存在位置:1..60 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:61..747 （xi）配列:SEQ ID NO:2: （２）配列番号３の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:249amino acids （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：モルガネラ・モルガニ（Morganella
morganii） （Ｂ）株名:NCIMB10466 （xi）配列:SEQ ID NO:3: （２）配列番号４の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:229amino acids （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：モルガネラ・モルガニ（Morganella
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ichia blattae） （Ｂ）株名:JCM1650 （xi）配列:SEQ ID NO:8: （２）配列番号９の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:750bases （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:Genomic DNA （vi）起源： （Ａ）生物名：エシェリヒア・ブラッタエ（Escher
ichia blattae） （Ｂ）株名:JCM1650 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..747 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:sig_peptide （Ｂ）存在位置:1..54 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:55..747 （xi）配列:SEQ ID NO:9: （２）配列番号10の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:249amino acids （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：エシェリヒア・ブラッタエ（Escher
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ichia blattae） （Ｂ）株名:JCM1650 （xi）配列:SEQ ID NO:8: （２）配列番号９の配列の情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）配列の長さ:750bases （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:Genomic DNA （vi）起源： （Ａ）生物名：エシェリヒア・ブラッタエ（Escher
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅野 泰久 富山県射水郡小杉町太閤山９−３−１− 321 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/16 C12N 15/09 ZNA C12P 19/32 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件
下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸
（塩）及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択さ
れる燐酸供与体に作用させてヌクレオシド−５′−燐酸
エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とす
るヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造方法。 - 【請求項２】酸性フォスファターゼが、配列表配列番号
４、11、18、20、22もしくは24に示されるアミノ酸配
列、又はこれらのいずれかのアミノ酸配列において、１
若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を
含むアミノ酸配列を有し、かつ、フォスファターゼ活性
を有する蛋白質である請求項１記載のヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの製造法。 - 【請求項３】酸性フォスファターゼが、配列表配列番号
４、11、18、20、22又は24に示されるアミノ酸配列、又
はこれらのいずれかのアミノ酸配列において、１若しく
は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を含むア
ミノ酸配列を有し、かつ、配列番号４に示されるアミノ
酸配列において72番目のグリシン残基及び／又は151番
目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基への置換に相
当するアミノ酸の置換を有し、燐酸エステル加水分解活
性が低下し、フォスファターゼ活性を有する変異型酸性
フォスファターゼである請求項２記載のヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの製造法。 - 【請求項４】前記変異が、配列表配列番号４に示される
アミノ酸配列においては72番目のグリシン残基及び／又
は151番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基への
置換、入連表配列番号11に示すアミノ酸配列においては
74番目のグリシン残基及び／又は153番目のイソロイシ
ン残基の他のアミノ酸残基への置換、配列表配列番号1
8、20又は22に示すアミノ酸配列においては92番目のグ
リシン残基及び／又は171番目のイソロイシン残基の他
のアミノ酸残基への置換、配列表配列番号24に示すアミ
ノ酸配列においては88番目のグリシン残基及び／又は16
7番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基の置換で
ある請求項３記載のヌクレオシド−５′−燐酸エステル
の製造法。
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