WO1996037603A1 - Procede de production du nucleoside-5'-phosphate - Google Patents

Procede de production du nucleoside-5'-phosphate Download PDF

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WO1996037603A1
WO1996037603A1 PCT/JP1996/001402 JP9601402W WO9637603A1 WO 1996037603 A1 WO1996037603 A1 WO 1996037603A1 JP 9601402 W JP9601402 W JP 9601402W WO 9637603 A1 WO9637603 A1 WO 9637603A1
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leu
acid
seq
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PCT/JP1996/001402
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Yasuhiro Mihara
Takashi Utagawa
Hideaki Yamada
Yasuhisa Asano
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing nucleoside 5′-phosphate.
  • the present invention also relates to a novel acid phosphatase useful in the production of nucleoside 5'-phosphate, a gene encoding the acid phosphatase, a recombinant DNA containing the gene, and a microorganism carrying the recombinant DNA.
  • Nucleosid 5'-phosphate ester is useful as a seasoning, a medicine, and a raw material thereof.
  • the present inventors have developed a method of providing a specific microbial cell under acidic conditions with a nucleoside and a phosphate donor selected from the group consisting of polyphosphoric acid (salt), funinyl phosphoric acid (salt), and rubamyl phosphoric acid (salt).
  • a method for efficiently producing nucleoside 5'-phosphate without causing by-products of 1,3'-nucleotide isomers by acting on the body was developed (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 7-231793).
  • the object of the present invention is to provide an inexpensive and efficient method for producing nucleoside-5'-phosphate.
  • Another object of the present invention is to provide an enzyme useful in a method for producing nucleoside 5′-phosphate, a gene encoding the enzyme, a recombinant DNA containing the gene, and a microorganism having the recombinant DNA. It is to provide.
  • the present inventors have conducted various studies in order to develop a method for producing nucleoside 5'-phosphate ester that is more efficient than the conventional method.
  • the acid phosphatase purified from the cell-free extract of the microorganism was converted to pH 3
  • a nucleoside and a phosphate donor selected from the group consisting of polyphosphoric acid (salt), phenylphosphoric acid (salt) and rubamyl phosphoric acid (salt) under the conditions of 0 to 5.5, a high yield can be obtained. It has been discovered that nucleoside 1 5'-phosphate can be produced efficiently.
  • a wild-type gene encoding acid phosphatase is obtained from various bacteria, and a gene encoding a mutant acid phosphatase having a reduced phosphoric acid ester hydrolysis activity is obtained from Morganella bacteria and Escherichia bacteria.
  • the present inventors have succeeded in finding that the productivity of nucleoside 5′-phosphate can be dramatically improved by expressing the gene in a large amount by a genetic engineering technique, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a method for preparing an acid phosphatase, preferably an acid phosphatase having a reduced nucleotidase activity, under the condition of ⁇ 3.0 to 5.5, as a nucleoside, a polyphosphoric acid (salt), a phenylphosphoric acid (salt) and a potassium rubamyl phosphate.
  • the present invention also provides a mutant acid phosphatase having a reduced phosphate ester hydrolyzing activity, a gene encoding the acid phosphatase, NA and a microorganism having the recombinant DNA.
  • the present invention provides a novel acid phosphatase derived from a genus Escherichia, a bacterium of the genus Enterobacter, a bacterium of the genus Klebsiella and a genus of Serratia, a gene encoding these, a recombinant DNA containing the gene, and a possession of the recombinant DNA. It provides microbes that do. 'Hereinafter, the present invention will be described in detail.
  • the acid phosphatase used in the present invention is selected from the group consisting of polyphosphoric acid (salt), phenylphosphoric acid (salt) and rubamyl phosphoric acid (salt) to a nucleoside under the conditions of 3.0 to 5.5.
  • the acid phosphatase is not limited as long as it catalyzes a reaction of generating a nucleoside 5′-phosphate by transfer of a phosphate group from a phosphate donor.
  • Particularly preferred examples include bacteria belonging to the genus Morganella, the genus Escherichia, the genus Providencia, the genus Enterobacter, the genus Klebsiella or the genus Serratia, having the enzyme activity, and enzymes derived from these bacteria.
  • Representative examples of such bacteria include the following strains. Morganella morganii NCIMB 10466
  • Providencia stuartii ATCC 29851 Providencia stuartii ATCC 33672 Enteroba aerogenes IFO 12010 Enterobacter aerogenes ella gerogen erogen erogen erogen gerogene ) IFO 14939 Klebsiella planticola 1AM 1133 Serratia ficaria I AM 13540
  • Acid phosphatase (EC 3.1.3.2) is an enzyme that originally catalyzes the hydrolysis of phosphate esters under acidic conditions. It has a nucleotidase activity that decomposes the generated nucleoside-5'-phosphate ester (hereinafter referred to as "phosphate ester hydrolysis activity").
  • phosphate ester hydrolysis activity a nucleotidase activity that decomposes the generated nucleoside-5'-phosphate ester
  • phosphate ester hydrolysis activity a nucleoside-5'-phosphate ester hydrolysis activity
  • such an acid phosphatase can also be used, but in order to obtain nucleoside-5'-phosphate in high yield, the above-mentioned bacteria are used.
  • mutant acid phosphatase (hereinafter, also simply referred to as “mutant acid phosphatase”) having a reduced phosphate ester hydrolyzing activity as compared to the wild-type acid phosphatase to be produced.
  • Mutant acid phosphatase is obtained by expressing a mutant gene obtained by directly mutating a gene encoding acid phosphatase, as described later, but is a microorganism that produces acid phosphatase. Is treated with a mutagen commonly used for artificial mutations such as UV irradiation or N-methyl-N'-two-row N-nitrosogazine (NTG) to reduce the phosphate ester hydrolysis activity. Mutant acid phosphatase can also be obtained by culturing a microorganism that has produced the acid phosphatase.
  • a strain having the activity is cultured in an appropriate medium, the grown cells are collected, and the cells are disrupted to obtain a cell-free extract. It can be prepared and purified as needed.
  • the medium in which the microorganisms are cultured there is no particular limitation on the medium in which the microorganisms are cultured, and any conventional medium containing ordinary carbon sources, nitrogen sources, inorganic ions, and, if necessary, organic nutrients may be used.
  • the carbon source sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as glycerol, organic acids and the like are appropriately used.
  • the nitrogen source ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt and the like are used.
  • the inorganic ions magnesium ion, phosphate ion, potassium ion, iron ion, manganese ion and others are used as needed. Is done.
  • organic nutrients vitamins, amino acids, etc., or yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean hydrolyzate, etc. containing these are appropriately used.
  • culture conditions for example, cultivation for about 12 to 48 hours under aerobic conditions while appropriately controlling pH and temperature within the range of pH 5 to 8 and temperature 25 to 40 ° C Should be performed.
  • the grown cells can be recovered from the culture solution by centrifugation or the like.
  • Conventional methods are used to prepare a cell-free extract from the collected cells. That is, a cell-free extract can be obtained by crushing the cells by ultrasonic treatment, dyno mill, French press or the like, and removing the cell residues by centrifugation.
  • a DNA fragment containing a structural gene encoding a protein having an acid phosphatase activity can be cloned from a cell such as a microorganism having the enzyme activity.
  • the cloning method include a method of searching for a chromosomal gene expression library using an enzyme activity as an index, a method of creating an antibody against the protein and searching for a chromosome gene expression library, and the N-terminus of a purified protein.
  • the genes coding for the acid phosphatases of Morganella morganii, Escherichia 'Blattae, Providencia' Sciualti, Enteropatar 'Aerogenes, Klebsiella' Planticola, Serratia 'Ficaria, or Serratia marcesens. Is the chromosomal gene expression of each microorganism
  • the library can be cloned by preparing the library and searching for the library using the phosphatase activity as an index.
  • chromosomal DNA is prepared from the above bacteria, partially digested with an appropriate restriction enzyme, ligated to a vector capable of autonomous replication in E. coli, and the obtained recombinant DNA is used for the recombinant DNA obtained.
  • ⁇ Chromosome gene expression library can be created by transforming E. coli.
  • restriction enzymes can be used by adjusting the degree of cleavage by adjusting the cleavage reaction time and the like.
  • the vector used for cloning the gene may be any vector that can autonomously replicate in Escherichia coli. For example, pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322, pBluescript11 and the like are used.
  • the same restriction enzyme used to cut the chromosomal DNA or the chromosome The vector may be cut in advance using a restriction enzyme that generates a cleavage plane complementary to the cleavage plane of the DNA fragment, and the DNA fragment may be ligated with a ligase such as T4 DNA ligase.
  • a ligase such as T4 DNA ligase.
  • any strain may be used as long as it is suitable for vector replication. For example, Escherichia coli strains such as HB101, JM109, and DH5 are used.
  • a reaction solution containing p-ditrophenyl phosphate is poured on the surface of the medium, and the reaction is carried out.
  • the strain expressing phosphatase activity is Releases p-ditrophenol and shows a yellow color.
  • the above reaction is performed under acidic conditions, and color transformation is used as an index to select a transformant, thereby selecting a transformant having a DNA fragment containing a gene encoding the desired acid phosphatase. be able to.
  • the nucleotide sequence of the acid phosphatase-encoding gene is as follows: SEQ ID NO: 2 for the gene derived from Morganella morganii NCIMB 10466, and SEQ ID NO: 2 for the gene derived from Escherichia brassica JCM 1650.
  • SEQ ID NO: 2 for the gene derived from Morganella morganii NCIMB 10466
  • SEQ ID NO: 2 for the gene derived from Escherichia brassica JCM 1650.
  • the sequence listing SEQ ID NO: 17 In the case of a gene derived from A.
  • amino acid sequences of acid phosphatase presumed to be encoded by the above genes are shown in SEQ ID NOs: 4, 11, 18, 20, 20, 22 and 24 in the sequence listing. Acid phosphatase encoded by the above gene can be suitably used in the present invention. Further, an acid phosphatase having an amino acid sequence substantially homologous to any of the amino acid sequences of the acid phosphatase encoded by the above genes can also be suitably used in the present invention. “Substantially homologous” refers to one or more amino acid residues which do not lose the amino acid sequence of the acid phosphatase nucleoside 5'-phosphate ester-forming activity (hereinafter referred to as "transphosphorylation activity"). It means that substitution, deletion, insertion or transposition may be included.
  • the wild-type acid phosphatase obtained above has a phosphate ester hydrolysis activity
  • the degradation of the product with the elapse of the reaction time is a factor that reduces the reaction yield. May be.
  • the gene encoding acid phosphatase may be artificially mutated so that the phosphoric acid ester hydrolysis activity is reduced.
  • a site-directed mutagenesis method for causing a target mutation at a target site in DNA As a site-directed mutagenesis method for causing a target mutation at a target site in DNA, a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, HA Eds., Stokton press (1989)); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)), a method using phage (Kramer, W. and Frits, HJ, Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, TA et al. , Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • mutant acid phosphatase having reduced phosphate ester hydrolysis activity are substantially homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 11, 18, 20, 22, or 24 in the sequence listing. And contains the amino acid sequence of Mutant acid phosphatase having a mutation that reduces the phosphate ester hydrolyzing activity of the enzyme.
  • the enzyme derived from Morganella morganii NCIMB 10466 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, a glycine residue at the 72nd position and Z or a residue at the iso mouth at the 15.1th position are shown. Those in which the group is substituted with another amino acid residue are mentioned.
  • base substitution may be performed at a specific site of the wild-type gene by the above-described site-specific mutation method so as to encode these mutant acid phosphatases.
  • the mutation that reduces the phosphate ester hydrolysis activity is preferably a mutation that does not substantially reduce the activity of forming nucleoside-5'-phosphate compared to wild-type acid phosphatase. Even when the activity to form 5'-phosphate decreases, the activity to hydrolyze the phosphate ester decreases to a greater extent, and as a result, the activity to hydrolyze the phosphate / nucleoside-5'-phosphate Any mutation may be used so that the ratio is even lower than that of wild-type acid phosphatase.
  • the degree of reduction in the activity of phosphoric acid ester hydrolysis may be reduced to about 40% or less of the wild-type enzyme.
  • the amino acid sequence of the acid phosphatase of Escherichia brattae JCM 1650 has high homology with the acid phosphatase of Morganella's Morganii NCIMB 10466, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • the 2nd dalysine residue and the 15th isoleucine residue correspond to the 74th glycine residue and the 15th isoleucine residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, respectively. .
  • Amino acid residues corresponding to the glycine residue at position 72 and the glycine residue at position 15 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 were provided by Schau's Stiuality ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IF012010 and In the acid phosphatase derived from Klebsiella planticola IFO 14939, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, 20 or 22 is a glycine residue at position 92 and an isoleucine residue at position 17
  • the acidic phosphatase derived from Serratia fumaria IAM 13540 has a glycine residue at position 88 and an isoleucine residue at position 167 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • the DNA fragment containing the gene encoding the protein having acidic phosphatase activity obtained as described above was expressed again at a high level of acid phosphatase activity by recombination into an appropriate vector and introduction into host cells. Recombinant bacteria can be obtained. At that time, if a gene encoding wild-type acid phosphatase is used, wild-type acid phosphatase is expressed, and if a gene encoding mutant acid phosphatase is used, mutant acid phosphatase is expressed.
  • Examples of the host include Escherichia coli strains such as HB101, JM109 and DH5 described above.
  • Escherichia coli strains such as HB101, JM109 and DH5 described above.
  • the origin of replication of the constructed recombinant DNA and the acid phosphatase gene function, and the recombinant DNA replicates.
  • Any bacteria that are capable and capable of expressing the acid phosphatase gene can be used as hosts.
  • One of the most preferred hosts is Escherichia coli JM109.
  • the vector into which the gene encoding acid phosphatase is incorporated is not particularly limited as long as it can replicate in a host. Escherichia ko as host When liposome is used, a plasmid which can autonomously replicate in the bacterium can be mentioned.
  • ColEl-based plasmid, pl5A-based plasmid, R-factor-based plasmid, phage-based plasmid and the like can be used.
  • PBR322 Gene, 2,
  • DNA fragment containing a gene encoding acid phosphatase contains a promoter operable in a host, it may be directly ligated to a vector.
  • another promoter such as 1 ac, trp, or PL that works in a host microorganism may be ligated upstream of the gene. Even when the DNA fragment contains a promoter, it may be replaced with another promoter in order to efficiently express a gene encoding acid phosphatase.
  • the method for introducing a recombinant DNA obtained by linking a DNA fragment containing a gene encoding an acid phosphatase and a vector into a host is not particularly limited, and can be performed by a usual method.
  • Escherichia coli is used as a host, the calcium chloride method (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), the Hanahan method (J. ol. Biol., 166, 557 (1983)), SEM (Gene, 96, 23 (1990)), Chung et al. (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172 (1989)), electroporation (Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)). ))
  • the calcium chloride method J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)
  • the Hanahan method J. ol. Biol., 166, 557 (1983)
  • SEM Gene, 96, 23 (1990)
  • the acid phosphatase gene inserted into a vector DNA capable of autonomous replication may be introduced into a host, and may be retained in the host as extrachromosomal DNA.
  • the acid phosphatase gene may be transduced, transposonized, (Biotechnol., 1, 417 (1983)), Mu phage (JP-A-2-109985) or homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)). May be integrated into the chromosome.
  • Transformants into which the recombinant DNA has been introduced express high levels of acid phosphatase activity in the cells by culturing them in an appropriate medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic ions, and if necessary, organic nutrients.
  • a carbon source carbohydrates such as glucose, alcohols such as glycerol, organic acids, and the like are appropriately used.
  • the nitrogen source ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt, and others are used.
  • a magnesium ion, a phosphate ion, a potassium ion, an iron ion, a manganese ion and others are appropriately used as needed.
  • organic nutrients vitamins, amino acids, etc., and yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean hydrolyzate, and others containing them are appropriately used.
  • Addition of an expression inducer according to the promoter, such as IPTG (isopropyl-D-thiogalactobyranoside) to the medium may increase the expression level of the acid phosphatase activity.
  • cells are collected from the culture, and a cell-free extract is obtained by crushing, from which acid phosphatase can be purified.
  • a cell-free extract is obtained by crushing, from which acid phosphatase can be purified.
  • techniques usually used for purification of enzymes as described in 1> above are used in appropriate combination. Purification does not necessarily need to be complete purification, as long as impurities such as enzymes involved in the degradation of the substrate nucleoside can be removed.
  • the acid phosphatase obtained in ⁇ 1> or the wild-type acid phosphatase or mutant acid phosphatase obtained by expressing a gene in a large amount by a genetic engineering technique as described in ⁇ 5> above is a nucleoside and a polyphosphate.
  • Nucleotide a nucleoside 5′-phosphate ester can be formed in the reaction solution by contacting with a phosphoric acid donor selected from the group consisting of: (a) salt, fuunyl phosphoric acid (salt) and rubamyl phosphoric acid (salt). it can.
  • a phosphoric acid donor selected from the group consisting of: (a) salt, fuunyl phosphoric acid (salt) and rubamyl phosphoric acid (salt).
  • a gene encoding acid phosphatase is expressed in a large amount by genetic engineering techniques, particularly, a gene encoding a mutant acid phosphatase having reduced phosphate ester hydrolysis activity is expressed.
  • a culture containing the cells of the transformant, cells isolated and recovered from the culture, immobilization of the cells, and azetone are used instead of the purified acid phosphatase.
  • the nucleosides to be used include purine nucleosides such as inosine, guanosine, adenosine, xanthosine, princriboside, 6-methoxypurin riboside, 2,6-diaminopurin riboside, and 6-fluoropurine riboside.
  • the reaction specifically phosphorylates the 5'-position of these natural nucleosides and non-natural nucleosides to form the corresponding nucleoside 5'-phosphate esters.
  • the concentration of the nucleoside to be added to the reaction solution is preferably 1 to 20 g / dl.
  • the reaction yield may be improved by adding a surfactant such as boric acid or dimethyl sulfoxide.
  • polyphosphoric acid (salt) used as the phosphoric acid donor examples include pyrophosphoric acid, tripolyphosphoric acid, trimetaphosphoric acid, tetrametaphosphoric acid, hexametaphosphoric acid or a mixture thereof, or a sodium salt, a potassium salt or a salt mixture thereof.
  • phenylphosphoric acid examples include disodium phenylphosphate, dipotassium fuunylphosphate, 0,0-difuninylphosphoric anhydride and mixtures thereof
  • dibasic phosphoric acid examples include dibasic sodium rubamyl phosphate; Dipotassium rubamil phosphate, diammonium rubamil phosphate, calpa, dilithium mill phosphate or a mixture thereof can be used.
  • the concentration of the phosphate donor used is determined by the concentration of the nucleoside that is a phosphate acceptor. Usually, 1 to 5 times the amount of nucleoside is desirable.
  • the reaction is usually carried out at a temperature of 20-60, preferably 30-40, and a pH of 3.5-6.5, preferably pH4.! ) To 5.0 give good results.
  • any method of standing or stirring can be adopted.
  • the reaction time varies depending on conditions such as the activity of the enzyme used and the substrate concentration, but is 1 to 100 hours.
  • FIG. 1 is a view showing the relationship between the reaction pH and the amount of 5′-monoinosinic acid produced in a reaction using an enzyme derived from Morganella morganii.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between reaction pH and the amount of 5′-monoinosinic acid produced in a reaction using an enzyme derived from Escherichia brattae.
  • FIG. 3 is a diagram showing a restriction map of a chromosomal DNA fragment of Morganella 'Morgina 2 containing a gene encoding acid phosphatase.
  • FIG. 4 is a diagram showing the amount of 5′-inosic acid produced in a reaction using an acid phosphatase gene-bearing strain derived from Morganella 'Morgana 2'.
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of 5′-inosinoic acid produced in a reaction using a wild-type acid phosphatase gene-holding strain and a mutant acid phosphatase gene-holding strain derived from Morganella morganii.
  • FIG. 6 shows a restriction map of a chromosomal DNA fragment of Escherichia brattae containing a gene encoding acid phosphatase.
  • FIG. 7 is a diagram showing the amount of 5′-inosic acid produced in a reaction using an acid phosphatase gene-bearing strain derived from Escherichia or Bratta.
  • FIG. 8 is a diagram showing the amount of 5 -'- inosic acid produced in a reaction using a strain having a wild-type acid phosphatase gene and a strain having a mutant acid phosphatase gene derived from Escherichia brattae.
  • FIG. 9 is a diagram showing a restriction enzyme map of a chromosomal DNA fragment of Enterobacter aerogenes containing a gene encoding acid phosphatase.
  • FIG. 10 is a diagram showing a restriction map of a Klebsiella planticola chromosomal DNA fragment containing a gene encoding acid phosphatase.
  • FIG. 11 is a diagram showing a restriction enzyme map of Serratia ficaria stained DNA fragment containing a gene encoding acid phosphatase.
  • Figure 12 shows the amino acid sequence of the protein predicted from the nucleotide sequence of the acid phosphatase genes of Morganella 'Morganii, Escherichia' Brattae, Providencia sciualti, Enteropatar aerogenes, Klebsiella 'Planticola and Serratia ficariae, as one letter of the amino acid. It is the figure shown by the notation. These amino acid sequences are represented by three-letter codes in SEQ ID NOs: 4, 11, 18, 20, 22, and 24 in the Sequence Listing, respectively. In the figure, amino acid residues common to all amino acid sequences are indicated by * under the sequence. DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Phosphoryl transfer activity was measured using inosine as a substrate under the following conditions. Inosine 40 / zmol / ml, sodium pyrophosphate 100 ⁇ 1 / ⁇ 1, sodium acetate buffer ( ⁇ 5.0) 100 100 mol / ml and reaction solution (1 ml) containing enzyme, pH 5.0, 10 at 30 ° C A minute reaction was performed. After stopping the reaction by adding 2N hydrochloric acid 2001, the precipitate was removed by centrifugation, and the 5'-inosinic acid produced by the phosphorylation reaction was quantified. Under these standard reaction conditions, the amount of enzyme that produces l # mol of 5'-inosinic acid per minute was defined as 1 unit.
  • the phosphate ester hydrolysis activity was measured using 5'-inosic acid as a substrate under the following conditions.
  • a reaction was carried out at 30 ° C. for 10 minutes using a reaction solution (1 ml) containing 5′-inosinic acid 10 / mol / ml, female ZNaOH buffer (pH 6.0) 100 wmol / ml, and enzyme.
  • the reaction was stopped by adding 20 Ojul of 2 N hydrochloric acid, the precipitate was removed by centrifugation, and inosine produced by the hydrolysis reaction was quantified. Under these standard reaction conditions, the amount of enzyme that produces 1 mol of inosine per minute was defined as 1 unit.
  • the crude enzyme solution was dialyzed four times against 5 L of lOOmM potassium phosphate buffer ( ⁇ 70), and then equilibrated with 20 ⁇ phosphate buffer ( ⁇ 7.0). lx 22 cm) and washed with 800 ml of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). Since the transphosphorylation activity passed through the fraction, the fraction was collected.
  • Ammonium sulfate was added to this active fraction so that it became 35% saturated, and 35% ammonium sulfate was added. It was adsorbed on a butyl toyopearl column (03.1 ⁇ 26 cm) equilibrated with a saturated 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). Elution was performed with a 35% saturated to 20% saturated potassium phosphate buffer (pH 7.0) ⁇ linear concentration gradient.
  • the active fractions were collected, dialyzed against 1 L of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and adsorbed on a hydroxyapatite column (05x6.5 cm) equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer ( ⁇ 7.0). . Elution was carried out with a linear concentration gradient from 50 mM to 300 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0).
  • the enzyme exhibiting the transphosphorylation activity was finally purified about 550 times from the cell-free extract with a recovery of about 10%.
  • Table 1 shows the specific activity and the recovery rate in this purification process. This enzyme preparation was homogenized by SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • the purified enzyme had the following properties:
  • Substrate specificity In the transphosphorylation reaction, pyrophosphate, tripolyphosphate, trimeta Phosphoric acid, tetrametaphosphoric acid, hexametaphosphoric acid, disodium phenylphosphate, dipotassium phenylphosphate, ⁇ , 0-diphenylanhydride, disodium phorbamil phosphate, dipotassium rubamyl phosphate, diammonium phorbamil phosphate, dilithium phorbamil phosphate, etc. It becomes a phosphoric acid donor.
  • phosphate receptor purine riboside, inosine, guanosine, adenosine, gisantosine, peridine, cytidine, and the like are phosphate receptors.
  • inorganic phosphoric acids such as pyrophosphoric acid, tripolyphosphoric acid, trimetaphosphoric acid, tetrametaphosphoric acid, and hexametaphosphoric acid, disodium phenylphosphate, dipotassium phenylphosphate, and 0,0-diphenylphosphoric anhydride are used.
  • Phosphoric acid esters such as disodium sorbamyl phosphate, dipotassium sorbamyl phosphate, diammonium phosphamyl phosphate, and dilithium carbamyl phosphate; furthermore, 5'-purine ribotide, 5'-inosinic acid, 5'-guanylic acid, 5'-adenylic acid 5'-nucleotides such as 5'-xanthylic acid, 5'-peridilic acid and 5'-cytidylic acid are affected.
  • Subunit molecular weight Calculated to be about 25,000 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • This enzyme showed not only the activity of transphosphorylation to nucleosides, but also the activity of hydrolyzing phosphate, and the activity of decomposing phosphate was more than 20 times higher than the activity of transphosphorylation.
  • other properties are in good agreement with known acid phosphatases produced by Morganella spp. (Microbiology, 140, 1). 341-1350 (1994)), it was revealed that this enzyme is an acid phosphatase. It was dissolved in sodium buffer, and the above enzyme preparation was added thereto at a concentration of 50 units / dl.
  • the reaction was carried out at 30 ° C for 6 hours while maintaining each pH, and the amount of 5-inosinic acid formed with time was measured.
  • the inosinic acid produced was only 5'-monoinosinic acid, and no by-products of 2'-inosinic acid and 3'-inosinic acid were observed.
  • the results are shown in Figure 1.
  • the production rate of 5'-inosic acid was highest at pH 5.0, but the maximum accumulation of 5'-inosic acid was higher at lower pH.
  • the reaction condition of PH4.0 was the most efficient for the production of 5'-inosinic acid, and 2.60 g / dl of 5'-inosinic acid was produced and accumulated in 3 hours of reaction.
  • Example 2 Using an acid phosphatase standard derived from Morganella morganii
  • Phosphorylation reaction of various nucleosides Sodium pyrophosphate 10 g / dl and inosine, guanosine, peridine or cytidine 2 g / dl as a phosphate receptor were dissolved in sodium acetate buffer (pH 4.0).
  • the enzyme preparation (1) was added to 50 units / dl and reacted at 30 ° C for 3 hours while maintaining the pH at 4.0.
  • Table 2 shows the amount of nucleoside 5'-ester produced by the reaction.
  • Example 3 Production of 5'-Inosinic Acid Using Various Phosphate Compounds as a Phosphate Donor Using Acid Phosphatase from Morganella Morganii Preparation of Inosinic Acid 2 g / dl and sodium tripolyphosphate, sodium polyphosphate as a phosphate donor (Trade name: Polygon P, manufactured by Chiyoda Chemical Co., Ltd.), 10 g / dl of sodium dihumate phosphate or dibasic sodium rubamyl phosphate dissolved in sodium acetate buffer (pH 4.0), and prepared in Example 1 The prepared enzyme preparation was added to 50 units / dl, and reacted at 30 ° C for 3 hours while maintaining the pH at 4.0. Table 3 shows the amount of 5'-inosinic acid produced by the reaction.
  • 5′-Inosinic acid was efficiently produced and accumulated using any of the phosphoric acid donors, but the accumulated amount of 5′-inosinic acid was highest when sodium polyphosphate was used as the phosphoric acid donor.
  • Table 3 Phosphoric acid donors 5'-monoinosinic acid (g / dl) sodium tripolyphosphate 2.10
  • Example 4 Purification and Properties of Acid Phosphatase from Escherichia brattae
  • a 50 ml nutrient medium (pH 7.0) containing peptone lg / dl, yeast extract 0.5 g / dl and salt lg / dl was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, and Heat sterilization at ° C for 20 minutes.
  • One platinum loop was inoculated with Escherichia brattae JCM 1650, which was cultured on a slope, and shake-cultured at 30 for 16 hours. Cells were collected from the culture by centrifugation.
  • Ammonium sulfate was added to the cell-free extract so as to be 30% saturated. After removing the precipitate formed by centrifugation, additional ammonium sulfate was added to the supernatant so as to be 60% saturated. The resulting precipitate was collected by centrifugation and dissolved in lOOmM phosphate buffer. *
  • the crude enzyme solution was dialyzed four times against 5 L of lOOmM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and then equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0).
  • Ammonium sulfate was added to the active fraction so that it became 35% saturated, and this was equilibrated with a 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 35% saturated ammonium sulfate. .5 cm). This was eluted with a linear gradient from 35% saturated to 20% saturated potassium phosphate buffer (pH 7.0).
  • the active fraction was collected, dialyzed against 1 L of lOOmM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and then equilibrated with lOOmM potassium phosphate buffer (pH 7.0). 0 cm). This was eluted from 50 ⁇ with a linear gradient of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and the active fraction was collected.
  • This enzyme solution was dialyzed against 1 L of lOmM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and then applied to a CM-Toyopear column (02.0, 14.0 cm) equilibrated with 1 OmM potassium phosphate buffer ( ⁇ 6.0). Adsorbed. This was eluted from OmM with a linear concentration gradient of potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 300 ⁇ potassium chloride. This active fraction was collected. By the above operation, the enzyme exhibiting the transphosphorylation activity was finally purified about 600 times from the cell-free extract with a recovery of about 16%. Table 4 shows the specific activity and the recovery in this purification process. This enzyme preparation was homogeneous in SDS-polyacrylamide electrophoresis. Table 4
  • the purified enzyme had the following properties:
  • Substrate specificity In the transphosphorylation reaction, pyrophosphoric acid, tripolyphosphoric acid, trimetaphosphoric acid, tetrametaphosphoric acid, hexametaphosphoric acid, disodium phenylphosphate, dipotassium phenylphosphate, 0,0-diphenylphosphoric anhydride, dibasylphosphoric acid, Sodium, dipotassium phorbamil phosphate, diammonium phorbamil phosphate, dilithium phorbamil phosphate and the like are phosphoric acid donors.
  • phosphate receptor purine riboside, inosine, guanosine, adenosine, xanthosine, peridine, cytidine and the like are phosphate receptors.
  • inorganic phosphoric acids such as pyrophosphoric acid, tripoliphosphoric acid, trimetaphosphoric acid, tetrametaphosphoric acid, and hexametaphosphoric acid, and disodium phenylphosphate, dipotassium phenylphosphate, and 0,0-diphenylphosphoric anhydride are used.
  • Phosphoric acid esters such as disodium sorbamyl phosphate, dipotassium sorbamyl phosphate, diammonium phosphamyl phosphate, dilithium carbamyl phosphate, and 5'-purine ribotide, 5'-inosinic acid, 5'-guanylic acid, 5'-adenylic acid, 5'-nucleotides such as 5'-xanthylic acid, 5'-peridilic acid, and 5'-cytidylic acid are affected.
  • Subunit molecular weight Calculated as about 24,500 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. This enzyme showed not only the activity of transphosphorylation to nucleosides but also the activity of hydrolyzing phosphate esters, similar to the enzyme purified from the cell-free extract of Morganella morganii NCIMB 10466. In addition, the phosphate ester degrading activity was 30 times or more higher than the transphosphorylation activity, indicating that it was an acid phosphatase.
  • the production rate of 5'-inosinic acid was highest at pH 5.0, but the maximum accumulation of 5'-inosinic acid was higher in the lower pH range, and the production of 5'-inosinic acid was pH4.
  • a reaction condition of 0 was the most efficient. In the reaction at 30 ° C and pH 4.0, 1.56 g / dl of 5'-inosinic acid was produced and accumulated in 3 hours.
  • Example 5 Phosphorylation of Various Nucleosides Using Acid Phosphatase Standard from Escherichia brattae 15 g / dl of sodium pyrophosphate and 3 g / dl of inosine, guanosine, peridine or cytidine in sodium acetate buffer (pH 4.0) And the enzyme of Example 4 The standard was added to 50 units / dl, and the reaction was carried out at 35 ⁇ for 3 hours while maintaining the pH at 4.0. Table 5 shows the amount of nucleoside 5'-ester formed.
  • nucleotide produced was nucleoside 5'-ester only, and no by-product of nucleoside 2'-ester; and nucleoside 3'-ester was observed at all. 'Table 5
  • Example 6 Production of 5'-Inosinic Acid Using Various Phosphate Compounds as a Phosphate Donor Using an Acid Phosphatase Prepared from Escherichia Brattae Inosinic Acid 2 g / dl and sodium tripolyphosphate, sodium polyphosphate (trademark) as a phosphate donor Name: Polygon P, a product of Chiyoda Chemical Co., Ltd.), 10 g / dl of diunazole phosphate or dibasic sodium rubamyl phosphate in sodium acetate buffer ( ⁇ 40), and the enzyme prepared in Example 4 The standard was added to the above enzyme standard at 50 units / d1 and reacted at 35 ° C for 3 hours while maintaining the pH at 4.0. Table 6 shows the amount of 5'-inosinic acid produced.
  • 5′-Inosinic acid was efficiently produced and accumulated using any of the phosphoric acid donors, but the accumulated amount of 5′-inosinic acid was highest when sodium polyphosphate was used as the phosphoric acid donor.
  • Acid phosphatase purified according to the method described in Example 1 from a cell-free extract of Morganella morganii NCIMB 10466 was adsorbed on DI TC membrane (Milligen / Biosearch) and used with Prosequencer 6625 (Milligen / Biosearch).
  • the N-terminal amino acid sequence was determined.
  • the N-terminal amino acid sequence of 20 residues shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was determined.
  • Chromosomal DNA was prepared according to (Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)). This was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI, and then a 3 to 6 kbp DNA fragment was fractionated by sucrose density gradient centrifugation. Plasmid vector PUC118 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was digested with restriction enzyme BamHI and ligated to a partially degraded chromosomal DNA fragment. DNA ligation was performed using a DNA ligation kit (Takara Shuzo) according to the prescribed method. Then, using the obtained DNA mixture, Escherichia coli
  • JM109 (Takara Shuzo) was transformed. Transformants were plated on L-agar medium containing 100 g / inl of ampicillin and grown to prepare a gene library. A reaction solution containing 4 DIM p-ditrophenyl phosphate and 100 mM Mespa NaOH buffer (pH 6.5) was poured onto the surface of the agar medium on which the transformants had grown, and incubated at 30 ° C. for 15 minutes. Bacteria expressing phosphatase activity release p-ditrophenol and release Transformants were selected using this as an indicator because they show yellow. As a result of searching a gene expression library of about 20,000 transformants, 30 transformants expressing phosphatase activity were obtained.
  • a single colony of 30 transformants expressing the phosphatase activity was separated, inoculated into a second medium 2.511111 containing ampicillin 1008/1111, and cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • To the cells collected from the culture solution was added lOOmM sodium acetate buffer (pH 5.0) 501 containing 2 g / dl of inosine and 10 g / dl of sodium pyrophosphate, and the mixture was reacted at 30 ° C for 16 hours.
  • the production of 5'-inosinic acid was detected by HPLC analysis, and a strain having a transphosphorylation activity was selected.
  • Example 8 Determination of the nucleotide sequence of the acid phosphatase gene derived from Morganella morganii NCIMB 10466 A transformant which is expected to have a DNA fragment containing the acid phosphatase gene derived from Morganella morganii NCIMB10466 obtained in Example 7 Plasmid was prepared from one of the above strains by the alkali lysis method (Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, EF Fritsch and T. aniatis, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, pi. 25 (1989)) and inserted. The obtained DNA fragment was analyzed, and this plasmid was named pMPI501 .. The restriction enzyme map of the determined inserted DNA fragment is shown in FIG.
  • Plasmid was prepared from a transformant of Escherichia coli • 109 (manufactured by Takara Shuzo) having PMPI505 by the alkaline lysis method, and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence was determined using Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biochemical) according to the method of Sanger et al. (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)).
  • the nucleotide sequence of the determined open reading frame is shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • the amino acid sequence of the protein deduced from this nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
  • the present open reading frame was identified as a region encoding the desired acid phosphatase.
  • the homology was compared with the known sequence for each of the nucleotide sequence and the amino acid sequence.
  • the databases used were EMBL and SWISS-PROTT.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing shows that the G at position 54 in the known acid phosphatase gene from Morganella morganii (Thaller, MC et. Al.
  • the precursor protein was composed of 249 amino acids, and the molecular weight of the protein predicted from its sequence was 27.0 kilodaltons.
  • the strain holding pMPI505 in Escherichia coli JM109 was named AJ13143. On February 23, 1996, the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (postal code: 2005, Tsukuba, Japan) It has been deposited internationally in accordance with the Budapest Treaty on 1-chome No. 1-3) and has been assigned the accession number FERM BP-5422.
  • Escherichia coli JM109 / PMPI505 constructed in Example 8 was inoculated into 50 ml of L medium containing ampicillin 100 / g / nil and IPTGI mM, and cultured at 37 ° C for 16 hours. The cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline. The cells were suspended in 5 ml of lOOmM potassium phosphate buffer ( ⁇ ⁇ 7 ⁇ 0), and disrupted for 20 min sonication at 4 ° C. The treated solution was centrifuged to remove the insoluble fraction, and a cell-free extract was prepared.
  • the acid phosphatase gene-bearing strain expresses a remarkable amount of acid phosphatase, and in the 5′-inosinic acid production reaction from pyrophosphate and inosine using this bacterium, Very efficiently, 5'-inosinic acid is produced and accumulated in a short time. It was found that the accumulated amount of 5'-inosinic acid did not increase to a certain extent because the generated 5'-inosinic acid was degraded by the phosphoric acid ester hydrolysis activity of the acid phosphatase itself. Thus, a mutation was introduced into the acid phosphatase gene derived from Morganella morganii NCIMB 10466 cloned in Example 7 using PCR using a site-specific mutagenesis method, and the enzyme was modified.
  • Oligonucleotides MUT500, MUT510 and MUT520 having the sequences shown in SEQ ID NOS: 5, 6 and 7 were synthesized by a phosphoamidite method using a DNA synthesizer (Model 394, manufactured by Applied Biosystems).
  • PCR reaction was performed using a Thermocycler PJ2000 (Takara Shuzo). Separately, PCR reaction was performed in the same manner using 505 lng of plasmid DNA pMPI as type I and M13 primer-1 M4 (manufactured by Takara Shuzo) and 2.5 mol of MUT500 oligonucleotide as primers. Each reaction solution was purified by gel filtration using a micro spin column S-400 (Pharmacia) to remove the primer.
  • each PCR reaction solution 1 ⁇ 1 to lOOmM Tris-HCl buffer (pH8.3) 95 / zl containing 200 ⁇ M each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 50mM chlorinated chloride and 1.5mM magnesium chloride. After heating at 94 ° C for 10 minutes, the mixture was cooled to 37 ° C over 60 minutes, and kept at 37 ° C for 15 minutes to form a heteroduplex. To this was added 2.5 units of DNA DNA polymerase, and the mixture was reacted at 72 ° C for 3 minutes to complete a heteroduplex. Next, add 2.5 mol of each of M13 primer RV and M13 primer M4 to this reaction solution, and repeat the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes 10 times. The reaction was performed.
  • the product of the second PCR reaction was digested with Hindlll and EcoRI, followed by extraction with phenol / chloroform and ethanol precipitation. This DNA fragment was ligated to pU18 cut with Hindill and E _ ⁇ _ Q_RI, and Escherichia coli * MJ109 (manufactured by Takara Shuzo) was transformed using the obtained plasmid DNA by a conventional method. This was plated on L agar medium containing 100 / zg / inl ampicillin to obtain a transformant. Plasmid was prepared from the transformant by the alkaline lysis method, and the nucleotide sequence was determined. It was confirmed that the target base was substituted.
  • the nucleotide sequence was determined using Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biochemical) according to the method of Sanger et al. (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)).
  • a mutant gene encoding a mutant phosphatase in which the 72nd glycine residue (GGT) of the mature protein was replaced with an aspartic acid residue (G * AT) was created.
  • the plasmid containing this mutant gene was named PMPI510.
  • pMP1505 was used as type I, and MUT500 and MUT520 oligonucleotides were used as primers.
  • a mutant gene encoding a mutant phosphatase in which the isoleucine residue (ATC) at position 151 of the mature protein was replaced with a threonine residue (A * CC) was prepared.
  • the plasmid containing this mutant gene was named PMPI520.
  • glycine residue (GGT) at position 72 of the mature protein is replaced with an aspartic acid residue (G * AT) at position 151 and isoleucine at position 151.
  • G * AT aspartic acid residue
  • PMPI530 The plasmid containing this mutant gene was named PMPI530.
  • Escherichia coli into which a plasmid containing each mutant acid phosphatase gene was introduced.
  • JM109ZpMPI505 was inoculated into 50 ml of L medium containing ampicillin lOOyW g / ml and IPTGI mM, and cultured at 37 ° C for 16 hours. The cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline. The cells were suspended in 5 ml of 10 OmM potassium phosphate buffer ( ⁇ 70) and sonicated at 4 ° C for 20 minutes to disrupt the cells.
  • OmM potassium phosphate buffer ⁇ 70
  • the treated solution was centrifuged to remove the insoluble fraction, and a cell-free extract was prepared.
  • Phosphate hydrolysis activity and phosphoric acid tilling activity of the obtained cell-free extract were measured at pH 4.0 and compared with those of the wild strain.
  • Table 8 shows the results of measuring the phosphoric acid ester hydrolysis activity and the transphosphorylation activity of the wild type and mutant acid phosphatase.
  • the mutant acid phosphatase had reduced phosphate hydrolysis activity and transphosphorylation activity both as compared to wild-type acid phosphatase, but the phosphate ester hydrolysis activity was more severely reduced.
  • the ratio of the phosphate ester hydrolyzing activity / phosphotransferase activity of the mutant acid phosphatase was lower than that of the wild type acid phosphatase.
  • Production of 5'-inosinic acid from inosine using a gene-bearing strain Escherichia coli transfected with a plasmid containing a mutant acid phosphatase gene Escherichia coli JM109ZpMPI505 into which a plasmid containing a phosphatase gene had been introduced was inoculated into 50 ml of an L medium containing 100 / g / ml of ampicillin and IPTG ImM, and cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • the vertical axis represents the concentration of 5'-inosinic acid (mg / dl)
  • the horizontal axis represents the reaction time (h)
  • the filled circles represent Escherichia coli JM109 / pMPI505, filled with black.
  • the triangles are Escherichia coli JM109 / pMPI510
  • the white circles are Escherichia coli Escherichia coli JM109 / pMPI520>
  • the white squares are Escherichia coli JM109 / pMPI530 This shows the transition of the reaction in the event of a failure.
  • Example 14 Production of 5′-Inosinic Acid Using Various Phosphate Compounds as a Phosphate Donor Using a Phosphate Ester Hydrolysis Activity Reduced Acid Phosphatase Gene Retaining Escherichia coli Introducing a Plasmid Containing a Mutant Acid Phosphatase Gene
  • E. coli JM109ZpMPI530 was inoculated into 50 ml of an L medium containing 100 g / ml of ampicillin and 1 mM of IPTG, and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • Acid phosphatase purified from the cell-free extract of Escherichia coli, Brattae JCM 1650 is adsorbed on a DITC membrane (Millidin Z Biosearch), and the N-terminal amino acid sequence is analyzed using Prosequencer 6625 (Millidin / Biosearch). Were determined. The N-terminal amino acid sequence of 15 residues shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing was determined.
  • Escherichia coli JM109 manufactured by Takara Shuzo
  • Escherichia coli JM109 manufactured by Takara Shuzo
  • Transformants were plated and grown on an L agar medium containing ampicillin 100; / g / ml to prepare a gene library.
  • a reaction solution containing 4 mM p-ditrofuunil phosphate and 100 mM female ZNaOH buffer (pH 6.5) was poured onto the surface of the agar medium on which the transformants had grown, and incubated at 30 ° C. for 15 minutes. Bacteria that expressed phosphatase activity released p-nitrophenol and showed yellow color. Therefore, transformants were selected using this as an index. As a result of searching a chromosome gene expression library of about 8,000 transformants, 14 transformants expressing phosphatase activity were obtained.
  • a single colony of 14 transformants expressing the phosphatase activity was isolated, inoculated into 2.5 ml of L medium containing 100 g / ml of ampicillin, and cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • 50 l of 100 mM sodium carbonate buffer (pH 5.0) containing 2 g / dl of inosine and 10 g / dl of sodium pyrophosphate were added, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 16 hours.
  • the production of 5'-inosinic acid was detected by HPLC analysis, and a strain having transphosphorylation activity was selected.
  • Example 16 Determination of the base sequence of the acid phosphatase gene derived from Escherichia coli Brassica JCM 1650 It is expected to have a DNA fragment containing the acid phosphatase gene derived from Escherichia brassata JCM 1650 obtained in Example 15 Plasmid was prepared from one of the resulting transformants by the alkaline lysis method, and the inserted DNA fragment was analyzed. This plasmid was named pEPI301. Determined restriction of inserted DNA fragments Figure 6 shows the enzyme map.
  • Plasmid was prepared from a transformant of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) having PEPI305 by alkaline lysis method, and its nucleotide sequence was determined.
  • the determined nucleotide sequence of the open reading frame is shown in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing.
  • the amino acid sequence of the protein deduced from this nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing.
  • a sequence completely matching the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme was present in this amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the sequence of the precursor protein and the first methionine residue.
  • the peptide from the group to the 18th alanine residue was thought to be removed after translation.
  • the amino acid sequence of the deduced mature protein is shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • the expected molecular weight of the mature protein was calculated to be 25.1 kilodalton, which was in good agreement with the result of the purified enzyme SDS-PAGE. Based on the above results and the fact that a transformant having a plasmid containing the present fragment exhibits phosphorylation activity, the present open reading frame was identified as a region encoding the desired acid phosphatase.
  • the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is the acid phosphatase gene of Escherichia brattae JCM 1650.
  • the homology was compared with the known sequence for each of the nucleotide sequence and the amino acid sequence.
  • the databases used were EMBL and SWISS-PROT.
  • SEQ ID NO: 8 the protein shown in SEQ ID NO: 8 and the DNA encoding it were found to be novel. Revealed.
  • the precursor protein encoded by this gene was composed of 249 amino acids, and the molecular weight of the protein predicted from the sequence was 27.0 kilodaltons.
  • the strain holding pEPI305 in Escherichia coli JM109 was named AJ13144, and the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (February 23, 1996) It has been deposited internationally under the Budapest Treaty on 1-chome 1-3) and has been assigned the accession number FERM BP-5423.
  • Example 17 Amplification of Activity by Expression of Acid Phosphatase Gene Derived from Escherichia's Brattae JCM 1650 Inoculation of Escherichia coli E. coli JM109ZPEPI305 prepared in Example 16 into 50 ml of an L medium containing ampicillin 100; g / ml and IPTGI mM was performed. The cells were cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • the cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • the cells were suspended in 5 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and sonicated at 4 ° C for 20 minutes to disrupt the cells.
  • the treated solution was centrifuged to remove the insoluble fraction, and a cell-free extract was prepared.
  • Phosphoryl transfer activity of the obtained cell-free extract was measured using, as a control, a cell-free extract prepared from Escherichia coli E. coli JM109 and Escherichia brattae wild strain similarly transformed with plasmid pBluescript KS (+).
  • Table 11 No transphosphorylation activity was detected in Escherichia coli JM109ZpBluescript KS (+), and the transphosphorylation activity was low even in the wild-type Escherichia brattae strain.
  • Escherichia coli JM109ZpEPI305 shows a phosphoric acid transfer activity that is 120 times higher in specific activity than that of Escherichia brattae wild strain. Based on these results, the introduced DNA fragment was found to be acidic phosphatase in Escherichia coli. This was shown to be highly expressed. table 1
  • Example 18 Production of 5′-Inosinic Acid from Inosine Using an Acid Phosphatase Gene-Retaining Strain Derived from Escherichia brattae JCM 1650 12 g / dl of sodium pyrophosphate and 6 g / dl of inosine were added with lOOmM sodium acetate buffer (pH 4.0). ), Add the above-mentioned cells of Escherichia coli JM109ZpEPI305 to a dry cell weight of 200 mg / dl, and carry out the reaction at 35 ° C for 10 hours while maintaining the pH at 4.0. The amount of 5'-inosinic acid produced over time was measured.
  • plasmid ⁇ the plasmid pEPI305 lng prepared in Example 16 was used, and as primers, M13 primer RV (manufactured by Takara Shuzo) and MUT310 oligonucleotides 2.5 ⁇ 1 each and Tuck D ⁇ polymerase (manufactured by Takara Shuzo) 2.5 units dATP, dCTP, dGTP, dTTP, lOOmM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8.3) containing 50mM potassium chloride and 1.5mM magnesium chloride, add to 100 ° C for 30 seconds at 94 ° C and 2 minutes at 55 ° C. A PCR reaction in which a cycle of 72 ° C for 3 minutes was repeated 25 times was performed.
  • PCR reaction was carried out using a Thermal Cycler-1 PJ2000 (Takara Shuzo). Separately, PCR reaction was similarly performed using plasmid pE PI305 lng as type I, M13 primer-M3 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and 2.5 zmol of each MUT300 oligonucleotide as primers. Each reaction solution was purified by gel filtration using a micro spin column S-400 (Pharmacia) to remove the primer.
  • Each PCR reaction mixture 11 was added to lOOmM Tris-HCl buffer (pH 8.3) 951, containing 200 ⁇ M each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 50mM of chlorinated chloride, and 1.5 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of magnesium chloride. After heating at 94 ° C for 10 minutes, the mixture was cooled to 37 ° C over 60 minutes, and kept at 37 ° C for 15 minutes to form a heteroduplex. To this, 2.5 units of tack DNA polymerase was added and reacted at 72 ° C for 3 minutes to complete a heteroduplex.
  • the product of the second PCR reaction was cleaved with _ ⁇ J__I and BamHI, followed by extraction with phenol Z chloroform and precipitation with ethanol.
  • This DNA fragment was ligated to pBluescript KS (+) cleaved with C1aI and BamHI, and the resulting plasmid DNA was used to transform Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) by a conventional method. This was plated on L agar medium containing 100 zg / ml ampicillin to obtain a transformant.
  • pBluescript KS (+) cleaved with C1aI and BamHI
  • Plasmid was prepared from the transformant by the alkaline lysis method, and the nucleotide sequence was determined. It was confirmed that the target base was substituted. In this manner, a mutant gene encoding a mutant phospho7: tase in which the 74th glycine residue (GGG) of the mature protein was replaced with an aspartic acid residue (G * A * T) was created. The plasmid containing this mutant gene was named PEPI310.
  • the 74th glycine residue (GGG) of the mature protein becomes the aspartic acid residue (G * A * T) and the 153rd
  • a mutant gene encoding a mutant phosphatase having an isoleucine residue (ATC) replaced with a threonine residue (A * CC) was created.
  • the plasmid containing this mutant gene was named PEPI330.
  • OmM potassium phosphate buffer pH 7.0
  • the treated liquid was centrifuged to remove the insoluble fraction, and a cell-free extract was prepared.
  • Phosphate ester hydrolysis activity and transphosphorylation activity of the obtained cell-free extract were measured at PH 4.0 and compared with those of the wild-type strain.
  • Table 12 shows the results of measuring the phosphate ester hydrolysis activity and the phosphoryl transfer activity of the wild-type and mutant acid phosphatase. Mutated acid phosphatase had lower phosphate esterase activity and phosphoryltransferase activity than wild-type acid phosphatase, but the degree of phosphate esterase activity decreased to a greater extent. As a result, the phosphate ester hydrolyzing activity of the mutant acid phosphatase Z was lower than that of the wild type acid phosphatase in terms of the transphosphorylation activity. Table 1 2
  • the vertical axis indicates the concentration of 5'-inosinic acid (mg / dl)
  • the horizontal axis indicates the reaction time (h)
  • the filled circle indicates the Escherichia coli JM109 / pEPI305 filled triangle.
  • the cells are Escherichia coli JM109 / pEPI310
  • the white circles are Escherichia coli.
  • Escherichia coli JM109 / pEPI320 and the white squares are Escherichia coli JM109 / pEPI 330. This shows the transition of the reaction in the event of a failure.
  • Example 21 Production of Various Nucleosides 5'-Phosphate Using a Phosphate Hydrolyzing Activity Reduced Acid Phosphatase Gene-Retaining Strain Escherichia coli into which a plasmid containing a mutant acid phosphatase gene was introduced • JM109ZpEPI330 was transformed into ampicillin at 100 g / ml. And 50 ml of L medium containing IPTGI mM and cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • 5′-Inosinic acid was efficiently produced and accumulated using any of the phosphoric acid donors, but the accumulated amount of 5′-inosinic acid was highest when polyphosphoric acid was used as the phosphoric acid donor.
  • Example 23 Isolation of a Gene Encoding Acid Phosphatase from the Providencia Stuarti Chromosome and Confirmation of the Nucleotide Sequence Based on the nucleotide sequence (EMBL Accession number X64820) of the known acid phosphatase gene of Providencia stuartii. Oligonucleotide primers PRP1 and PRP2 for PCR having the sequences shown in SEQ ID NOS: 15 and 16 designed to amplify the acid phosphatase gene were synthesized.
  • the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and the amplified DNA fragment of about 1 kbp was recovered using glass powder (Takara Shuzo).
  • This gene fragment was digested with _S_ ⁇ mHI and then bound to pUC118 digested with HI.
  • This plasmid was named pPRP100.
  • Phosphate ester hydrolysis activity and transphosphorylation activity of Escherichia coli JM109 / PPRP100 into which pPRP100 was introduced were measured.
  • the bacterium exhibited not only the activity of hydrolyzing the phosphate ester, but also the activity of transphosphorylating nucleosides.
  • a plasmid was prepared from Escherichia coli E. coli JM109 / PPRP100 by the alkaline lysis method, and the nucleotide sequence was determined.
  • the determined nucleotide sequence of the open reading frame and the amino acid sequence of the protein deduced from this nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 17 and 18 in the Sequence Listing.
  • the nucleotide sequence of this open reading frame was completely identical to the nucleotide sequence of the known acid phosphatase gene of Providenciales sutualti.
  • Example 2 4 Isolation and Determination of the Gene Encoding Acid Phosphatase from the Chromosomes of Enterobacter P.
  • Enterobacter p.aerogenes IF012010 is considered to harbor an acid phosphatase gene derived from IF012010, and a strain of Escherichia coli JM109 transformant was used to lyse a plasmid (prepared from here and analyzed the inserted DNA fragment.
  • This plasmid was named ⁇ Figure 9 shows the determined restriction enzyme map of the inserted DNA fragment derived from Enterobacter aerogenes IF012010.
  • a plasmid was prepared by an alkaline lysis method from one strain of Escherichia coli JM109 transformant, which is thought to harbor an acid phosphatase gene fragment derived from Klebsiella 'Planticola IF014939, and the inserted DNA fragment was analyzed.
  • This plasmid was named pKLP100.
  • FIG. 10 shows the determined restriction enzyme map of the inserted DNA fragment derived from Klebsiella planticola IF014939.
  • FIG. 11 shows the determined restriction enzyme map of the inserted DNA fragment derived from Serratia ficaria IAM 13350.
  • this acid phosphatase fragment was contained in a 1.4 kbp fragment cut out by the restriction enzyme Hindlll. It was suggested that the gene was included. Therefore, for determining the nucleotide sequence, a plasmid DNA was constructed in which this iiljldl II fragment was ligated to pUC118 which had been digested with Hindlll. This plasmid was named pSEP10.
  • the homology was compared with the known sequence for each of the nucleotide sequence and the amino acid sequence.
  • the databases used were EMBL and SWISS-PROT. As a result, it was found that the genes shown in SEQ ID NOs: 19, 21 and 23 in the sequence listing were all novel genes.
  • 248 proteins are encoded by the gene derived from the enterobacter P. aerogenes IF012010, 248 proteins are encoded by the gene derived from Klebsiella 'Planticola IF093939, and the gene is derived from Serratia' Fucararia IAM 13540. It was estimated that each protein consisted of 244 amino acids. These proteins may be precursor proteins, as in the case of the acid phosphatase of Morganella morganii and Escherichia brattae.
  • Example 8 the amino acid sequence of the protein predicted from these nucleotide sequences was estimated in Example 8 as Morganella morganii NCIMB 10466, and in Escherichia coli as estimated in Example 16.
  • Escherichia coli E. coli JM109 / pKLPl10 and Escherichia coli JM109 / PSEP110 was inoculated into 50 ml of L medium containing ampicillin 100; / g / ml and IPTG ImM, and cultured at 37 ° C for 16 hours. Cells were also collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • the cells were suspended in 5 ml of lOOmM phosphate Kariumuba Ffa (P H7. 0), and disrupted for 20 min sonication at 4 ° C. The treated solution was centrifuged to remove the insoluble fraction, and a cell-free extract was prepared.
  • Phosphoryl transfer activity of the obtained cell-free extract was similarly transformed with Providencia stuartii A TCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella 'Planticola IF0 14939, Serratia 7 icaria ⁇ 13540 and Plasmid pUC118.
  • the results of measuring the activity of the cell-free extract prepared from E. coli JM109 as a control are shown in Table 15. In all cases, the transfer activity of the wild-type strain was low. No transphosphorylation activity was detected in Escherichia coli JM109 / pUC118.
  • acid phosphatase is selected from the group consisting of nucleosides and polyphosphoric acid (salt), phenylphosphoric acid (salt), and rubamil phosphoric acid (salt) under the condition of pH 3.0 to 5.5.
  • a nucleoside 5′-phosphate ester can be produced inexpensively and efficiently.
  • nucleoside-5'-phosphate can be produced more efficiently by using the acid phosphatase having a mutation that reduces the phosphate ester hydrolysis activity provided by the present invention.
  • Organism name Monoreka, Nera 'Morganii (Morganella morganii)
  • Ala lie Pro Ala Gly Asn As Ala ThrThr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr
  • Ala lie Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thrs Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr
  • Leu Lys Asn Glu Gin Ala lie Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro
  • Leu Thr Asn Met lie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
  • Asp Ala Ala Arg lie Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser
  • Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser lie Ala Phe Leu Asn Asp Gin Ala Met
  • Lys Leu Leu Thr Asn Met lie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg
  • Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser lie Ala Phe Leu Asn Asp Gin
  • Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser lie Ala Phe Leu Asn As Gin
  • Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser lie Ala Phe Leu Asn Asp Gin
  • Met Lys Lys lie Leu Leu Ala Thr Lea Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin
  • Pro Ala Met Asp Ser lie As Phe Leu Asn As Lys Ala Gin Tyr Asp

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Description

- 1 - 明細書
. ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製造法 技術分野 本発明は、 ヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルの製造法に関する。 また、 本発 明は、 ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製造において有用な新規な酸性フォ スファターゼ、 該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、 該遺伝子を含む組 換え D N A、 該組換え D N Aを保有する微生物に関する。 ヌクレオシドー 5 ' — 燐酸エステルは、 調味料、 医薬並びにそれらの原料等として有用である。 背景技術 ヌクレオシドを生化学的に燐酸化してヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルを製 造する方法としては、 燐酸供与体として、 パラニトロフユニル燐酸を用いる方法 (特公昭 39-29858号） 、 無機燐酸を用いる方法 （特公昭 42— 1186号） 、 ポリ燐酸 を用いる方法 （特開昭 53- 56390号） 、 ァセチル燐酸を用いる方法 （特開昭 56— 82 098号） 、 アデノシン三燐酸 （A T P ) を用いる方法 （特開昭 63 - 230094号） が知 られている。 しかしながら、 これらの方法にあっては使用する基質が高価であつ たり、 反応副生物が生じたりするために、 安価かつ効率的にヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの生産を行うには満足のいくものではなかった。
そこで、 本発明者らは、 特定の微生物菌体を、 酸性条件下でヌクレオシド並び にポリ燐酸 （塩） 、 フニニル燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 （塩） よりなる群よ り選択される燐酸供与体に作用させることにより、 一、 3 ' —ヌクレオチド 異性体の副生を伴うことなく、 ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルを効率よく生 成する方法を開発した （特開平 7 - 231793号） 。
しかしな力、'ら、 この方法においても、 使用する微生物菌体にわずかながら存在 するヌクレオシド分解活性のために反応中に基質が一部分解され、 また、 反応を 継続すると生成蓄積したヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルが分解するため、 反 C /JP96/01402
応液中に副生物が生成するとともに、 十分な収率が得られなかった。 さらに、 菌 体あたりの燐酸転移活性が低いため、 高濃度の基質を添加して反応を行えない等 の欠点があった。
' 発明,の開示 本発明の目的は、 安価かつ効率的なヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルの製造 方法を提供することである。 また、 本発明の他の目的は、 ヌクレオシドー 5 ' - 燐酸エステルの製造方法において有用な酵素、 該酵素をコードする遺伝子、 該遺 伝子を含む組換え D N A及び該組換え D N Aを保有する微生物を提供することで ある。
本発明者らは、 従来の方法よりも効率の良いヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステ ルの製造方法を開発するために種々の検討を加えた結果、 微生物の無細胞抽出液 より精製した酸性フォスファターゼを pH3. 0〜5. 5の条件下でヌクレオシド並びに ポリ燐酸 （塩）、 フエニル燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 （塩） から成る群より 選択される燐酸供与体に作用させることにより、 高収率で効率良くヌクレオシド 一 5 ' —燐酸エステルを生産することができることを発見した。 さらに、 種々の 細菌より酸性フォスファタ一ゼをコードする野生型遺伝子を、 モルガネラ属細菌 及びエシュリヒア属細菌より燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フ ォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を取得することに成功し、 遺伝子工学的手法 により該遺伝子を大量発現させることによりヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステル の生産性が飛躍的に向上することを見いだし、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 酸性フォスファターゼ、 好ましくはヌクレオチダーゼ活 性が低下した酸性フォスファターゼを ρΗ3. 0〜5· 5の条件下でヌクレオシド並びに ポリ燐酸 （塩）、 フ ニル燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 （塩） から成る群より 選択される燐酸供与体に作用させてヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルを生成せ しめ、 これを採取することを特徴とするヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製 造法を提供するものである。
また、 本発明は、 燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファ ターゼ、 該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、 該遺伝子を含む組換え D N A、 並びに該組換え D N Aを保有する微生物を提供するものである。
また、 本発明は、 ェシヱリヒア属、 ェンテロパクター属細菌、 クレブシェラ属 細菌及びセラチア属細菌に由来する新規酸性フォスファタ一ゼ、 これらをコード する遺伝子、 該遺伝子を含む組換え D N A、 並びに該組換え D N Aを保有する微 生物を提供するものである。 ' 以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1 >酸性フォスファターゼの取得
本発明において使用される酸性フォスファターゼは、 ΡΗ3· 0〜5. 5の条件下で、 ヌクレオシドへの、 ポリ燐酸 （塩） 、 フエニル燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 (塩） よりなる群より選択される燐酸供与体からの、 燐酸基の転移によりヌクレ オシドー 5 ' —燐酸エステルを生成する反応を触媒するものであれば制限はない c このような酸性ホスファターゼとしては、 微生物に由来するものが好ましく、 特 に好適な例として、 モルガネラ属、 ェシヱリヒア属、 プロビデンシァ属、 ェンテ ロバクター属、 クレブシエラ属又はセラチア属に属する細菌が、 当該酵素活性を 有しており、 これら細菌に由来する酵素がある。 そのような細菌の代表例として 以下のような菌株を挙げることができる。 モルガネラ 'モルガ二 （Morganella morganii ) NCIMB 10466
モノレカ"ネラ · モノレカ"二 (Morganella morganii ) IFO 3168
モルガネラ ·モルガ二 （Morganella morganii) IFO 3848
ェシヱリヒア ·ブラッタエ （Escherichia blattae) J CM 1650
ェシヱリヒア ·ブラッタエ （Escherichia blattae) ATCC 33429
ェシヱリヒア ·ブラッタエ （Escherichia blattae) ATCC 33430
プロビデンシァ ·スチユアルティ （Providencia stuartii ) ATCC 29851 プロビデンシァ ·スチユアルティ （Providencia stuartii ) ATCC 33672 ェンテロバ 'クタ一 ·ァエロゲネス （Enterobacter aerogenes) IFO 12010 ェンテロバクタ一 ·ァ工ロゲネス (Enterobacter aerogenes) IFO 13534 クレブシエラ ·プランティコラ （Klebsiella planticola) IFO 14939 クレブシエラ ·プランティコラ （Klebsiella planticola) 1AM 1133 セラチア ' フイカリア （Serratia ficaria) I AM 13540
セラチア - マノレセセンス (Serratia marcescens) IAM 12143 なお、 酸性フォスファターゼ （EC 3. 1. 3. 2) は、 本来、 燐酸エステルを酸性条 件下で加水分解する反応を触媒する酵素であり、 燐酸転移反応により生成するヌ クレオシド— 5 ' —燐酸エステルを分解するヌクレオチダーゼ活性 （以下、 「燐酸 エステル加水分解活性」 という） を有している。 本発明のヌクレオシドー 5 ' — 燐酸エステルの製造法においては、 このような酸性フォスファターゼでも使用す ることができるが、 高い収率でヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルを得るために は、 上記の細菌が産生する野生型の酸性フォスファターゼに比べて燐酸エステル 加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ （以下、 単に 「変異型酸性 フォスファタ一ゼ」 ともいう） を使用することが望ましい。
変異型酸性フォスファターゼは、 後述するように、 酸性フォスファタ一ゼをコ 一ドする遺伝子を直接変異させることによって得られる変異型遺伝子を発現させ ることによって得られるが、 酸性フォスファタ一ゼを産生する微生物を、 紫外線 照射または N—メチル—N'—二トロー N—二トロソグァ二ジン （NTG) 等の通常人工 突然変異に用いられている変異剤により処理し、 燐酸ェステル加水分解活性が低 下した変異型酸性フォスファターゼを産生するようになつた微生物を培養するこ とによっても、 変異型酸性フォスファターゼを得ることができる。
上記のような微生物から酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質を得るには、 該活性を有する菌株を適当な培地で培養し、 増殖した菌体を回収し、 当該菌体を 破砕して無細胞抽出液を調製して、 これより必要に応じ精製すればよ t、。
微生物を培養する培地には格別の制限はなく、 通常の炭素源、 窒素源、 無機ィ オン及び必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。 炭素源としては、 グル コース、 シュクロース等の糖類、 グリセロール等のアルコール類、 有機酸その他 が適宜使用される。 窒素源としては、 アンモニアガス、 アンモニア水、 アンモニ ゥム塩その他が用いられる。 無機イオンとしては、 マグネシウムイオン、 燐酸ィ オン、 カリウムイオン、 鉄イオン、 マンガンイオンその他が必要に応じ適宜使用 される。 有機栄養源としては、 ビタミン、 アミノ酸等、 又はこれらを含有する酵 母エキス、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一、 カゼイン分解物、 大 豆加水分解物等が適宜用いられる。
培養条件にも格別の.制限はなく、 例えば、 好気的条件下にて pH 5〜 8及び温度 25〜40°Cの範囲内で pH及び温度を適当に制御しつつ 12〜48時間程度培養を行なえ ばよい。
増殖した菌体は、 遠心分離等により培養液から回収することができる。 回収し た菌体から無細胞抽出液を調製するには、 通常の方法が用いられる。 すなわち、 菌体を超音波処理、 ダイノ ミル、 フレンチプレス等の方法にて破砕し、 遠心分離 により菌体残渣を除去することにより無細胞抽出液が得られる。
無細胞抽出液から酸性フォスファターゼを精製するには、 硫安分画、 イオン交 換クロマ トグラフィ一、疎水ク口マトグラフィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラ まフィ一、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 等電点沈殿等、 酵素の精製に通常用い られる手法が適宜組み合わせて用いられる。 精製は、 完全精製である必要は必ず しもなく、 基質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が除去できれば よい。
< 2 >酸性フォスファターゼ遺伝子の取得
酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする構造遺伝子を含む D N A断片は、 当該酵素活性を有する微生物等の細胞からクローニングすることがで きる。 クローニング方法としては、 例えば、 酵素活性を指標として染色体遺伝子 発現ライブラリーを探索する方法、 当該蛋白質に対する抗体を作成して染色体遺 伝子発現ライブラリーを探索する方法、 精製された蛋白質の N末端等のアミノ酸 配列を解析し、 これを基にプローブを作成し遺伝子ライブラリ一を探索する方法 等がある。
具体的には、 上記のモルガネラ ·モルガ二、 ェシヱリヒア 'ブラッタエ、 プロ ビデンシァ 'スチユアルティ、 ェンテロパクター 'ァエロゲネス、 クレブシエラ 'プランティコラ、 セラチア 'フィカリア、 又はセラチア · マルセセンスの酸性 フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子は、 それぞれの微生物の染色体遺伝子発現 ライブラリ一を作成し、 フォスファタ一ゼ活性を指標として該ライブラリ一を探 索することによりクローニングできる。
すなわ 、 まず、 上記細菌より染色体 D N Aを調製し、 これを適当な制限酵素 で部分分解した後、 ェ.シヱリヒア 'コリで自律複製できるベクターに連結し、 得 られた組換え D N Aを用いてェシヱリビア · コリを形質転換することにより染色 体遺伝子発現ライブラリーが作成できる。 染色体 D N Aを切断する際に、 切断反 応時間等を調節して切断の程度を調整すれば、 幅広い種類の制限酵素が使用でき る。 また、 遺伝子のクローニングに使用するベクターとしては、 ェシェリヒア · コリで自律複製できるベクターであればいかなるものでも構わない。 例えば、 pU C19、 pUC118、 pHSG298、 pBR322、 pBluescriptl l等が用いられる。
ベクタ一と、 酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む D N A断片を連 結して組換え体 D N Aを調製するには、 染色体 D N Aを切断するときに用いる制 限酵素と同じもの、 又は染色体 D N A断片の切断面に相補する切断面を生じる制 限酵素を用いてあらかじめベクターを切断し、 T 4 D N Aリガーゼ等のリガーゼ を用いて D N A断片との連結を行えばよい。 作成した組換え D N Aの受容菌とし ては、 ベクターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、 例えば HB10 1、 JM109、 DH5等のェシヱリヒア · コリ菌株が用いられる。
かく して得られる形質転換体を寒天培地上に生育させコロニーを形成させた後、 培地表面に p—二トロフエニル燐酸を含む反応液を注ぎ反応を行うと、 フォスフ ァターゼ活性を発現した株は、 p—二トロフエノールを遊離して黄色を示す。 前 記反応を酸性条件下で行い、 呈色を指標として形質転換体を選択することにより、 目的の酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む D N A断片を保有する形 質転換体を選択することができる。
次いで、 選択された形質転換体より組換え D N Aを回収し、 ベクターに連結さ れている酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む D N A断片の構造を解 析する。 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の埠基配列は、 モルガネラ · モルガ二 NCIMB 10466由来の遣伝子の場合、 配列表配列番号 2に、 ェシヱリヒア •ブラッ夕ェ JCM 1650由来の遺伝子の場合、 配列表配列番号 9に、 プロビデンシ ァ ·スチユアルティ ATCC 29851由来の遺伝子の場合、 配列表配列番号 1 7に、 ェ ンテロバクタ一 ·ァエロゲネス IF0 12010由来の遺伝子の場合、 配列表配列番号 1 9に、 クレブシエラ ·プランティコラ IF0 14939由来の遺伝子の場合、 配列表 配列番号 2 1に、 セラチア · フイカリア IAM 13540由来の遺伝子の場合、 配列表 配列番号 2 3にそれぞれ示される。
上記遺伝子によりコードされると推定される酸性ホスファターゼのアミノ酸配 列を、 配列表配列番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2及び 2 4に示す。 上記の遺伝 子によってコ一ドされる酸性ホスファターゼは、 本発明に好適に使用することが できる。 さらに、 上記遺伝子によってコードされる酸性ホスファタ一ゼのァミノ 酸配列のいずれかと実質的に相同であるアミノ酸配列を有する酸性ホスファタ一 ゼも、 本発明に好適に使用することができる。 「実質的に相同」 とは、 酸性ホス ファターゼのアミノ酸配列カ^ ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステル生成活性 （以 下、 「燐酸転移活性」 という） を失わないような 1又は 2以上のアミノ酸残基の 置換、 欠失、 挿入又は転移を含んでいてもよいことを意味する。
< 3 >変異型酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子の取得
上記で得られる野生型酸性フォスファターゼは、 燐酸エステル加水分解活性を 有するため、 ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製造においては、 反応時間の 経過とともに生産物の分解を伴い、 反応収率を低下させる要因となることがある。 このような場合、 燐酸エステル加水分解活性が低下するように酸性フォスファタ 一ゼをコ一ドする遺伝子に人為的に変異を起こさせればよい。
D N Aの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては、 P C Rを 用いる方法 （Higuchi, R. , 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds. , Stoc kton press (1989)) ； Carter, P. , Meth. in Enzymol. , 154, 382 (1987)) 、 ファージを用いる方法 （Kramer, W. and Frits, H. J. , Meth. in Enzymol. , 154, 350 (1987)； Kunkel, T. A. et al.， Meth. in Enzymol. , 154, 367 (1987)) な どがある。
燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファタ一ゼの例として は、 配列表配列番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2又は 2 4に示されるアミノ酸配 列と実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、 かつ、 野生型酸性フォスファタ一 ゼの燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異を有する変異型酸性フォスファ ターゼが挙げられる。 具体的には、モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466由来の酵 素の場合、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 7 2番目のグリシ ン残基及び Z又は 1 5 .1番目のイソ口イシン残基が他のァミノ酸残基に置換した ものが挙げられる。 後述の実施例では、' 7 2番目のグリシン残基をァスパラギン 酸残基に、 1 5 1番目のイソロイシン残基をスレオニン残基に置換した変異型酸 性フォスファターゼ遺伝子取得の例を示した。 また、 ェシヱリヒア 'ブラッタエ JCM 1650由来の酵素の場合、 配列表配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列におい て 7 4番目のグリシン残基及び /又は 1 5 3番目のイソロイシン残基が他のアミ ノ酸残基に置換したものが挙げられる。 後述の実施例では、 7 4番目のグリシン 残基をァスパラギン酸残基に、 1 5 3番目のイソロイシン残基をスレオニン残基 に置換した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子取得の例を示した。
従って、 これらの変異型酸性フォスファターゼをコードするように、 上記の部 位特異的変異法により、 野生型遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行えば よい。 なお、 燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異は、 野生型酸性フォス ファターゼ.と比較してヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルの生成活性の実質的な 低下を伴わない変異であることが望ましく、 ヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステル の生成活性が低下する場合であっても、 燐酸エステル加水分解活性の方が低下の 程度が大きく、 その結果、 燐酸エステル加水分解活性/ ヌクレオシド— 5 ' -燐 酸生成活性の比が野生型酸性フォスファターゼょり低くなるような変異であれば よい。 燐酸エステル加水分解活性の低下の程度としては、 野生型酵素の約 40 %以 下程度まで活性が低下すればよい。
後述の実施例のように、 ェシヱリヒア 'ブラッタエ JCM 1650の酸性フォスファ ターゼのアミノ酸配列は、 モルガネラ 'モルガ二 NCIMB 10466の酸性フォスファ ターゼと高い相同性を有しており、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 7 2番目のダリシン残基及び 1 5 1番目のイソロイシン残基は、 それぞれ配列番 号 1 1に示されるアミノ酸配列における 7 4番目のグリシン残基及び 1 5 3番目 のィソロイシン残基に相当する。 また、 ェシヱリヒア ·ブラッタエ JCM 1650以外 にも、 プロビデンシァ ·スチユアルティ ATCC 29851、 ェンテロパクター ·ァエロ ゲネス IF0 12010、 クレブシエラ ·プランティコラ IF0 14939及びセラチア ·フ イカリア IAM 13540等の微生物に由来する酸性フォスファターゼのアミノ酸配列 も、 モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466の酸性フォスファタ一ゼと相同性が高く、 それぞれ配列番号 4に示されるァミノ酸配列において 7 2番目のグリシン残基及 び 1 5 1番目のイソロイシン残基に相当するアミノ酸残基を有しており、 同様に して変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を得ることができる。 配列番号 4に示さ れるアミノ酸配列における 7 2番目のグリシン残基及び 1 5 1番目のイソ口イシ ン残基に相当するアミノ酸残基は、 プロビデンシァ 'スチユアルティ ATCC 2985 1、 ェンテロバクタ一 ·ァエロゲネス IF0 12010及びクレブシエラ ·プランティコ ラ IFO 14939由来の酸性ホスファターゼでは、 配列表配列番号 1 8、 2 0又は 2 2に示すアミノ酸配列において、 9 2番目のグリシン残基及び 1 7 1番目のイソ ロイシン残基であり、 セラチア ' フイカリア IAM 13540由来の酸性ホスファタ一 ゼでは、 配列表配列番号 2 4に示すアミノ酸配列において、 8 8番目のグリシン 残基及び 1 6 7番目のイソロイシン残基である。 く 4 >酸性フォスファターゼ遺伝子の宿主への導入
上記のようにして得られる酸性フォスファタ一ゼ活性を有する蛋白質をコード する遺伝子を含む D N A断片は、 適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入 させることにより、 酸性フォスファターゼ活性を高レベルに発現した組換え菌を 得ることができる。 その際、 野生型酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を用 いれば、 野生型酸性ホスファターゼが、 変異型酸性ホスファターゼをコードする 遺伝子を用いれば、 変異型酸性ホスファターゼが発現される。
宿主としては、 上記した HB101、 JM109、 DH5等のェシヱリヒア■ コリ菌株が挙げ られるが、 これ以外にも、 構築した組換え D N Aの複製起点と酸性フォスファタ ーゼ遺伝子が機能し、 組換え D N Aが複製可能でかつ酸性フォスファターゼ遺伝 子の発現が可能な細菌ならば、 すべて宿主として利用できる。 最も好ましい宿主 の 1っはェシヱリヒア · コリ JM109である。
酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を組み込むベクターとしては、 宿主 において複製可能なものであれば特に制限はない。 宿主としてェシエリヒア · コ リを用いる場合には当該細菌で自律複製できるプラスミ ドを挙げることができる。 例えば、 ColEl系プラスミ ド、 pl5A系プラスミ ド、 R因子系プラスミ ド、 ファージ 系プラスミ ド等を用いることができる。 具体的に例示すれば、 PBR322 (Gene, 2，
95 (1977) )、 pUC19. (Gene, 33, 103 (1985) )、 pUC119 (Methods in Enzym ology, 153, .3 (1987) )、 pACYC184 (J. Bacteriol, 134, 1141 (1978) )、 p SC101 (Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3240 (1973) ) 等が挙げられる。 酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む DNA断片が、 宿主で機能可 能なプロモーターを含んでいる場合には、 そのままベクターに連結すればよい。 前記 DN A断片がプロモータ一を含まない場合には、 前記遺伝子の上流に、 1 a c、 t r p、 PL等の宿主微生物内で働く他のプロモーターを連結すればよい。 前記 DN A断片がプロモーターを含んでいる場合であっても、 酸性フォスファタ 一ゼをコ一ドする遺伝子を効率的に発現させるために、 他のプロモーターと置換 してもよい。
酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む DN A断片とベクターとを連 結させてなる組換え DN Aを宿主に導入する方法としては特に制限はなく、 通常 の方法により行うことができる。 宿主としてエシュリヒア ' コリを用いる場合に は、 塩化カルシウム法 （J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970) ) 、 Hanahan法 （J. ol. Biol. , 166, 557 (1983) )、 S EM法 （Gene, 96, 23 (1990) )、 Chungらの方 法 （Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86,2172 (1989) ) 、 電気穿孔法 （Nuclei c Acids Res., 16, 6127 (1988) ) などの方法を用いることができる。
また、 上記のように、 酸性フォスファターゼ遺伝子を自律複製可能なベクター DNAに挿入したものを宿主に導入し、 染色体外 D N Aとして宿主に保持させて もよいが、 酸性フォスファターゼ遺伝子を、 トランスダクシヨン、 トランスポゾ ン （Biotechnol. , 1, 417 (1983))、 Muファージ （特開平 2- 109985) または相 同組換え (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (19 72)) を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
< 5 >組換え菌による酸性フォスファターゼ遺伝子の発現
上記のようにして得られる酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む組 換え D N Aを導入した形質転換体は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン、 更に必要な らば有機栄養源を含む適当な培地で培養することにより酸性フォスファターゼ活 性を高レベルで菌体内に発現することができる。 炭素源としては、 グルコース等 の炭水化物、 グリセロール等のアルコール類、 有機酸その他が適宜使用される。 窒素源としては、 アンモニアガス、 アンモニア水、 アンモニゥム塩、 その他が用 いられる。 無機イオンとしては、 マグネシウムイオン、 燐酸イオン、 カリウムィ オン、 鉄イオン、 マンガンイオン、 その他が必要に応じ適宜使用される。 有機栄 養源としては、 ビタミン、 アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、 ぺプト ン、 肉エキス、 コーンスティ一プリカ一、 カゼイン分解物、 大豆加水分解物、 そ の他が適宜用いられる。 また、 培地に I P T G (イソプロピル— ー D —チォガ ラク トビラノシド） 等の、 プロモーターに応じた発現誘導剤を添加することによ り、 酸性フォスファターゼ活性の発現量が上昇する場合がある。
培養条件にも格別の制限はなく、 例えば、 好気的条件下にて pH 5〜 8及び温度 25〜 40°Cの範囲内で pH及び温度を適当に制御しつつ 12〜 48時間程度培養を行なえ ばよい。 .
次いで、 培養物から菌体を回収し、 破砕により無細胞抽出液を取得し、 これか ら酸性フォスファターゼを精製することができる。 精製には上記く 1 >に述べた ような酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用いられる。 精製は 完全精製である必要は必ずしもなく、 基質のヌクレオシドの分解に関与する酵素 等の夾雑物が除去できればよい。
< 6 >ヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルの製造
上記く 1 >で取得した酸性フォスファターゼ又は上記く 5 >に示したような遺伝 子工学的手法により遺伝子を大量発現させて得られる野生型酸性フォスファタ一 ゼもしくは変異型酸性ホスファターゼを、 ヌクレオシド並びにポリ燐酸 （塩） 、 フユニル燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 （塩） よりなる群より選択された燐酸供 与体に接触反応させることにより、 反応液中にヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステ ルを生成することができる。 この際、 高い生産性を得るには、 反応液の pHを 3. 0へ 5. 5の範囲の弱酸性に調製することが重要である。 また、 遺伝子工学的手法により酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を大 量発現させた場合、 特に、 燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォ スファタ一.ゼをコ一ドする遺伝子を大量発現させた場合には、 精製した酸性フォ スファターゼに替えて、 形質転換体の菌体を含む培養物、 該培養物から分離 ·回 収した菌体、.該菌体を固定化処理、 ァゼトン処理、 凍結乾燥処理等した菌体処理 物を使用することによつても、 安価かつ効率的にヌクレオシドー 5 ' —燐酸エス テルを生成することができる。
使用するヌクレオシドとしては、 プリンヌクレオシド類として、 イノシン、 グ ァノシン、 アデノシン、 キサン トシン、 プリ ンリボシ ド、 6—メ トキシプリ ンリ ボシド、 2， 6 —ジァミノプリンリボシド、 6 —フルォロプリンリボシド、 6— チォプリンリボシド、 2—アミノー 6—チォプリンリボシド、 メルカプトグアノ シン等、 ピリ ミジンヌクレオシド類として、 ゥリジン、 シチジン、 5—アミノウ リジン、 5—ヒドロキシゥリジン、 5—プロモウリジン、 6—ァザゥリジン等が 挙げられる。 反応によりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオシド の 5 ' 位が特異的に燐酸化され、 それぞれ対応するヌクレオシドー 5 ' —燐酸ェ ステルが生成する。
反応液に添加するヌクレオシドの濃度は 1〜20g/dlが望ましい。 水に難溶性の ヌクレオシドを使用する場合には、 硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような 界面活性剤を添加すると反応収率が向上する場合がある。
燐酸供与体として用いられるポリ燐酸 （塩） としては、 ピロ燐酸、 トリポリ燐 酸、 トリメタ燐酸、 テトラメタ燐酸、 へキサメタ燐酸もしくはそれらの混合物、 又はそれらのナトリウム塩、 カリウム塩もしくはそれらの塩混合物などが、 フエ ニル燐酸 （塩） としては、 フヱニル燐酸ジナトリウム、 フユニル燐酸ジカリウム、 0 , 0—ジフニニル燐酸無水物もしくはそれらの混合物などが、 力ルバミル燐酸 (塩） としては、 力ルバミル燐酸ジナトリウム、 力ルバミル燐酸ジカリウム、 力 ルバ'ミル燐酸ジアンモニゥム、 カルパ、ミル燐酸ジリチウムもしくはそれらの混合 物などが使用可能である。 燐酸供与体の使用濃度は、 燐酸受容体であるヌクレオ シドの濃度によって決定される。 通常、 ヌクレオシドの 1〜 5倍量が望ましい。 反応は通常、 温度 20〜60 、 好ましくは 30〜40 で、 pH3. 5〜6. 5、 好ましくは pH4.！)〜 5. 0の弱酸性側が好結果を与える。 反応には静置又は撹はんのいずれの方 法も採用し得る。 反応時間は、 使用する酵素の活性、 基質濃度などの条件によつ て異なるが、 1〜100時間である。
このようにして生成したヌクレオシドー 5 ' -燐酸エステルを反応終了混合物 より採取分離するには、 合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、 その 他通常の採取分離方法が採用できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 モルガネラ ·モルガ二由来の酵素を用いた反応において反応 pHと 5 ' 一イノシン酸生成量との関係を示す図である。
図 2は、 ェシヱリヒア ·ブラッタエ由来の酵素を用いた反応において反応 pHと 5 ' 一イノシン酸生成量との関係を示す図である。
図 3は、 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むモルガネラ 'モルガ 二の染色体 D N A断片の制限酵素地図を示す図である。
図 4は、 モルガネラ 'モルガ二由来の酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用 いた反応における 5 ' —イノシン酸の生産量を示す図である。
図 5は、 モルガネラ ·モルガ二由来の野生型酸性フォスファターゼ遺伝子保持 株及び変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における 5 ' -ィ ノシン酸の生産量を示す図である。
図 6は、 酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含むェシヱリヒア ·ブラ ッタエの染色体 D N A断片の制限酵素地図を示す図である。
図 7は、 ェシエリヒア，ブラツタヱ由来の酸性フォスファターゼ遺伝子保持株 を用いた反応における 5 ' —イノシン酸の生産量を示す図である。
図 8は、 ェシヱリヒア ·ブラッタエ由来の野生型酸性フォスファターゼ遺伝子 保持株及び変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における 5— ' イノシン酸の生産量を示す図である。
図 9は、 酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含むェンテロパクター •ァエロゲネスの染色体 D N A断片の制限酵素地図を示す図である。 図 10は、 酸性フォスファターゼをコ一ドする遺伝子を含むクレブシエラ ·プ ランティコラの染色体 DN A断片の制限酵素地図を示す図である。
図 1 1は、 酸性フォスファターゼをコ一ドする遺伝子を含むセラチア · フイカ リアの染色倖 DN A断片の制限酵素地図を示す図である。
図 12は、 モルガネラ 'モルガ二、 ェシエリヒア 'ブラッタエ、 プロビデンシ ァ ·スチユアルティ、 ェンテロパクター ·ァエロゲネス、 クレブシエラ 'プラン ティコラ及びセラチア · フィカリアの酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列よ り予想される蛋白質のアミノ酸配列をアミノ酸の一文字表記で示した図である。 これらのアミノ酸配列は、 各々配列表配列番号 4、 1 1、 18、 20、 22及び 24に 3文字表記で示されている。 図中ですベてのアミノ酸配列において共通の ァミノ酸残基を配列の下に *で示した。 好適な実施例の説明 以下、 実施例にて本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの例に限定さ れるものではない。
燐酸転移活性の測定は、 イノシンを基質として次の条件で行った。 イノシン 40 /zmol/ml、 ピロ燐酸ナトリウム 100 πιο1/πι1、 酢酸ナ十リウム緩衝液 （ρΗ5.0) 10 0 mol/ml及び酵素を含む反応液 （1ml) で pH5.0、 30°Cで 10分反応を行った。 2N 塩酸 200 1を添加して反応を停止した後、 遠心分離により沈澱を除き、 燐酸転移 反応により生成した 5' —イノシン酸を定量した。 この標準反応条件にて 1分間に l#molの 5' —イノシン酸を生成する酵素量を 1 unitと定めた。
また、 燐酸エステル加水分解活性の測定は、 5' —イノシン酸を基質として次 の条件で行った。 5' —イノシン酸 10/ mol/ml、 メス ZNaOH緩衝液 （pH6.0) 100 wmol/ml及び酵素を含む反応液 （ 1ml) で 30°Cで 10分反応を行った。 2 N塩酸 20 Ojulを添加して反応を停止した後、 遠心分離により沈澱を除き、 加水分解反応に より生成したイノシンを定量した。 この標準反応条件にて 1分間に l〃molのイノシ ンを生成する酵素量を 1 unitと定めた。
なお、 イノシン及び 5' —イノシン酸は、 高速液体クロマトグラフィー （HP L C ) により、 下記の条件にて分析した。 カラム ： Cosmosil 5 C 18- AR (4. 6 x 150隱） 〔ナカライテスク社製品〕 移動相： '5mM 燐酸カリウムバッファー （pH 2. 8) /メタノール = 95/ 5 流 ： 1. Oml/min
iffluJt ： 全 άιι
検出： U V245nm また、 イノシン以外のヌクレオシドを原料とするヌクレオシドー 5 ' —燐酸ェ ステルの生成反応においても、 原料のヌクレオシド及び生成したヌクレオシドー 5 ' 一燐酸エステルは、 上記と同様に H P L Cにより分析した。 実施例 1 モルガネラ ·モルガ二由来の酸性フォスファターゼの精製と性質 ペプトン l g/dl、 酵母エキス 0. 5g/dl及び食塩 l g/dlを含有する栄養培地 （PH7. 0) 50mlを 500ml坂口フラスコに入れ、 120^にて 20分間加熱殺菌した。 これに、 斜 面培養したモルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466を一白金耳接種し、 30°Cで 16時間 振盪培養した。 培養液から遠心分離により回収した菌体約 3, 000gを 1 Lの lOOmM燐 酸カリウムバッファー （ρΗ7· 0) に懸濁し、 4 °Cで 20分間超音波処理を行い菌体を 破砕した。 処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出液を調製した。 この無細胞抽出液に 30%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加した。 遠心 分離により生成した沈澱を除去した後、 上清液に 60 %飽和となるように硫酸ァン モニゥムを追加添加した。 生成した沈澱を遠心分離で集め、 lOOmM燐酸カリウムバ ッファーに溶解した。
この粗酵素液を lOOmM燐酸カリウムバッファ一 （ρΗ7· 0) 5 Lに対し 4回透析し た後、 20πιΜ燐酸力リゥムバッファー （ρΗ7· 0) で平衡化した DEAE-トョパール 650 Μカラム （04. l x 22cm) にチャージし、 800mlの 20mM燐酸カリウムバッファー （p H7. 0) で洗浄した。 燐酸転移活性は、 素通り画分にあつたので、 当該画分を回収 した。
この活性画分に、 35%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加し、 35%硫安 飽和の 20mM燐酸カリウムバッファー （pH7.0) で平衡化したブチルトヨパールカラ ム （03.1 X 26cm) に吸着させた。 35%飽和から 20%飽和燐酸カリウムバッファー (pH7.0) φ直線的な濃度勾配で溶出した。
活性画分を集め、 50mM燐酸カリウムバッファー （pH7.0) 1 Lに対し透析した後、 50mM燐酸カリ.ゥムバッファー （ρΗ7·0) で平衡化したヒドロキシァパタイ トカラム (05x6.5cm) に吸着させた。 50mMから 300mM燐酸カリウムバッファ一 （pH7.0) の直線的な濃度勾配で溶出した。
活性画分を集め、 限外ろ過により濃縮した。 この酵素液を HiLoadTM 16/60 S uperdex200カラム （フアルマシア社製品） に注入し、 lOOmM食塩を含む 50mM燐酸力 リゥムバッファー（ρΗ7· 0)、 流速 1. Oml/分にて溶出した。
以上の操作によって、 燐酸転移活性を示す酵素を無細胞抽出液より最終的に約 10%の回収率で約 550倍に精製した。 この精製過程における比活性及び回収率を表 1に示す。 この酵素標品は、 SD S—ポリアクリルアミ ド電気泳動において均一 めつた
Figure imgf000018_0001
精製された酵素は次の性質を有していた。
( 1 ) 作用 ：ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシドに燐酸を転移し、 ヌクレ オシド- 5' —燐酸エステルを生成する。 逆に燐酸エステルを加水分解する作用 も示す。
(2) 基質特異性：燐酸転移反応においてはピロ燐酸、 トリポリ燐酸、 トリメタ 燐酸、 テトラメタ燐酸、 へキサメタ燐酸、 フヱニル燐酸ジナトリウム、 フヱニル 燐酸ジカリウム、 Ό, 0—ジフヱニル酸無水物、 力ルバミル燐酸ジナトリウム、 力ルバミル燐酸ジカリウム、 力ルバミル燐酸ジアンモニゥム、 力ルバミル燐酸ジ リチウムなどが燐酸供 体となる。 また、 燐酸受容体としてはプリンリボシド、 イノシン、 グアノシン、 アデノシン、 ギサントシン、 ゥリジン、 シチジン等が燐 酸受容体となる。 一方、 燐酸エステル加水分解反応においては、 ピロ燐酸、 トリ ポリ燐酸、 トリメタ燐酸、 テトラメタ燐酸、 へキサメタ燐酸等の無機燐酸、 また、 フエニル燐酸ジナトリウム、 フヱニル燐酸ジカリウム、 0, 0—ジフヱニル燐酸 無水物、 力ルバミル燐酸ジナトリウム、 力ルバミル燐酸ジカリウム、 力ルバミル 燐酸ジアンモニゥム、 力ルバミル燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、 さらに、 5 ' 一プリンリボチド、 5' —イノシン酸、 5' —グァニル酸、 5' —アデニル酸、 5' ーキサンチル酸、 5' —ゥリジル酸、 5' —シチジル酸等の 5' —ヌクレオ チドが作用を受ける。
(3) 至適 ρΗ: 5·2 (燐酸転移反応） 、 6.5 (燐酸エステル加水分解反応）
(4) ρΗ安定性： ρΗ3.0〜12.0 (30。C、 60分処理）
( 5 ) 至適温度： 35°C付近
(6) 温度安定性： 30°Cまで安定 （pH7.0、 30分処理）
(7) 金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属イオン添加による活性化 現象は見られず、 Ag2 +、 Pb2% Hg2+及び Cu2 +によって阻害される。 また、 ョード 酢酸によって阻害される。
(8) 分子量：高速液体クロマトグラフィー （TSKgel G-3000SW, 東ソ一社製品） により約 190, 000と算出される。
(9) サブュニッ ト分子量： SDS -ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により約 25， 000と算出される。 本酵素はヌクレオシドへの燐酸転移活性だけでなく、 逆に燐酸エステルを加水 分解する活性も示し、 しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性に比べ て 20倍以上高い活性を示した。 また、 その他の性質もモルガネラ属の菌が産生す る既知の酸性フォスファタ一ゼとよく一致することから （Microbiology, 140, 1 341-1350 (1994)) 、 本酵素は酸性フォスファターゼであることが明らかとなった < ピロ燐酸ナトリウム 10g/dl及びイノシン 2g/dlを pH5.5、 5.0、 4.5、 4.0、 3.5の 各 pHの酢酸ナトリゥムバッファーに溶解し、 これに上記の酵素標品を 50units/dl となるように添加した。， 各 pHを維持しながら 30°Cで 6時間反応を行い、 経時的に 生成した 5 —イノシン酸の量を測定じた。 なお、 生.成したィノシン酸は、 5 ' 一イノシン酸のみで、 2' —イノシン酸及び 3' —イノシン酸の副生は全く認め られなかった。 結果を図 1に示す。 5' —イノシン酸の生成速度は pH5.0の時に最 大となったが、 5' —イノシン酸の最大蓄積量は pHがより低い方が高くなつた。 5' —イノシン酸の生産には PH4.0の反応条件が最も効率がよく、 3時間の反応で 2.60g/dlの 5' —イノシン酸が生成蓄積した。 実施例 2 モルガネラ ·モルガ二由来の酸性フォスファターゼ標品による
種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム 10g/dl及び燐酸受容体としてイノシン、 グアノシン、 ゥリ ジン又はシチジンを 2g/dlを酢酸ナトリウムバッファ一 （pH4.0) に溶解し、 これ に実施例 1の酵素標品を 50units/dlとなるように添加し、 pHを 4.0に維持しながら、 30°Cで 3時間反応させた。 反応により生成したヌクレオシドー 5' —エステルの 量を表 2に示す。
なお、 生成したヌクレオチドはヌクレオシドー 5' —エステルのみでヌクレオ シドー 2' —エステル及びヌクレオシド— 3' —エステルの副生は全く認められ なかった。 表 2 ヌクレオシド 生成物 生成量 (g/dl) イノシン 5' —イノシン酸 2.60
グァノシン 5 ' ーグァニル酸 1.90
ゥリジン 5 ' —ゥリジル酸 1.30
シチジン 5 ' ーシチジル酸 0.98 4
- 19
実施例 3 モルガネラ ·モルガ二由来の酸性フォスファターゼ標品による 種々の燐酸化合物を燐酸供与体とする 5 ' —イノシン酸の生産 イノシン 2 g/dl及び燐酸供与体として,トリポリ燐酸ナトリウム、 ポリ燐酸ナト リゥム （商品名 ：ポリゴン P、 千代田化学 （株） 製品） 、 フユニル燐酸ジナトリ ゥム又は力ルバミル燐酸ジナトリゥム 10g/dlを酢酸ナトリゥムバッファー （pH4. 0) に溶解し、 これに実施例 1で調製した酵素標品を 50units/dlとなるように添加 し、 pHを 4. 0に維持しながら 30°Cで 3時間反応させた。 反応により生成した 5 ' - イノシン酸の量を表 3に示す。
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく 5 ' -イノシン酸が生成蓄積し たが、 ポリ燐酸ナトリウムを燐酸供与体として用いた場合に最も 5 ' —イノシン 酸の蓄積量が高かった。 表 3 燐酸供与体 生成 5 ' 一イノシン酸 （g/dl) トリポリ燐酸ナトリゥム 2. 10
ポリ燐酸ナトリゥム 2. 72
フエニル燐酸ジナトリゥム 2. 33
力ルバミル燐酸ジナトリウム 2. 54
実施例 4 ェシエリヒア ·ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼの精製と性質 ペプトン l g/dl、 酵母エキス 0. 5g/dl及び食塩 l g/dlを含有する栄養培地 （pH7. 0) 50mlを 500ml坂口フラスコに入れ、 120°Cにて 20分間加熱殺菌した。 これに、 斜 面培養したェシヱリヒア ·ブラッタエ JCM 1650を一白金耳接種し、 30 で 16時間 振遨培養した。 培養液から遠心分離により菌体を回収した。 この菌体約 3, 300gを 1 Lの lOOmM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) に懸濁し、 4 で 20分間超音波処 理を行い菌体を破砕した。 処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出 液を調製した。
この無細胞抽出液に 30%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加した。 遠心 分離により生成した沈澱を除去した後、 上清液に 60 %飽和となるように硫酸ァン モニゥムを追加添加した。 生成した沈澱を遠心分離により回収し、 lOOmM燐酸力リ ゥムバッファーに溶解した。 *
この粗酵素液を lOOmM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) 5 Lに対し 4回透析し た後、 20mM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) で平衡化した DEAE-トヨパール 650M カラム （ 0 6. 2 x 35cm) にチャージし、 20mM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) で 洗浄した。 燐酸転移活性は素通り画分にあつたので、 当該画分を回収した。
この活性画分に 35%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加し、 これを 35 % 飽和硫酸アンモニゥムを含む 20mM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) で平衡化した ブチルトヨパールカラム （05. O x 22. 5cm) に吸着させた。 これを 35 %飽和から 2 0%飽和燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) の直線的な濃度勾配で溶出した。
活性画分を集め、 lOOmM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) 1 Lに対し透析した 後、 lOOmM燐酸カリウムバッファ一 （pH7. 0) で平衡化したヒドロキシァパタイ ト カラム （ ø 3. 0 X 7. 0cm) に吸着させた。 これを 50ιηΜから lOOmM燐酸カリウムバッフ ァー （pH7. 0) の直線的な濃度勾配で溶出し、 活性画分を集めた。
この酵素液を lOmM燐酸カリウムバッファー （pH6. 0) 1 Lに対し透析した後、 1 OmM燐酸カリウムバッファー （ρΗ6· 0) で平衡化した CM- Toyopear カラム （0 2. 0、 14. 0cm) に吸着させた。 これを OmMから 300πιΜ塩化カリウムを含む燐酸カリウムバ ッファー （pH6. 0) の直線的な濃度勾配で溶出した。 この活性画分を集めた。 以上の操作によって、 燐酸転移活性を示す酵素を無細胞抽出液より最終的に約 16 %の回収率で約 600倍に精製した。 この精製過程における比活性及び回収率を表 4に示す。 この酵素標品は、 S D S —ポリアクリルアミ ド電気泳動において均一 であった。 表 4
Figure imgf000023_0001
精製された酵素は次の性質を有していた。
( 1 ) 作用 ： ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシドに燐酸を転移し、 ヌクレ オシド- 5' —燐酸エステルを生成する。 逆に燐酸エステルを加水分解する作用 も示す。
(2) 基質特異性：燐酸転移反応においてはピロ燐酸、 トリポリ燐酸、 トリメタ 燐酸、 テトラメタ燐酸、 へキサメタ燐酸、 フヱニル燐酸ジナトリウム、 フヱニル 燐酸ジカリウム、 0， 0—ジフヱニル燐酸無水物、 力ルバミル燐酸ジナトリウム、 力ルバミル燐酸ジカリウム、 力ルバミル燐酸ジアンモニゥム、 力ルバミル燐酸ジ リチウムなどが燐酸供与体となる。 また燐酸受容体としてはプリンリボシド、 ィ ノシン、 グアノシン、 アデノシン、 キサントシン、 ゥリジン、 シチジン等が燐酸 受容体となる。 一方、 燐酸エステル加水分解反応においては、 ピロ燐酸、 トリポ リ燐酸、 トリメタ燐酸、 テトラメタ燐酸、 へキサメタ燐酸等の無機燐酸、 また、 フエニル燐酸ジナトリウム、 フヱニル燐酸ジカリウム、 0， 0—ジフヱニル燐酸 無水物、 力ルバミル燐酸ジナトリウム、 力ルバミル燐酸ジカリウム、 力ルバミル 燐酸ジアンモニゥム、 力ルバミル燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、 そして 5' 一プリンリボチド、 5' —イノシン酸、 5' —グァニル酸、 5' —アデニル酸、 5' ーキサンチル酸、 5' —ゥリジル酸、 5' —シチジル酸等の 5' —ヌクレオ チドが作用を受ける。
(3) 至適 pH: 5.2 (燐酸転移反応） 、 6.5 (燐酸エステル加水分解反応）
( 4 ) pH安定性： ρΗ3.5〜12· 0 (30^、 60分処理） ( 5 ) 至適温度： 35°C付近
(6) 温度安定性： 40°Cまで安定 (pH7.0、 30分処理）
(7) 金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属イオン添加による活性化 現象は見られず、 Fe2+、 Ag2 +、 Pb2+、 Hg2+及び Cu2 +によって阻害される。 また、 ョード酢酸によって阻害される。 '
(8) 分子量：高速液体クロマトグラフィー （TSKgel G-3000Sff, 東ソ一社製品） により約 188, 000と算出される。
( 9 ) サブュニッ ト分子量： SDS -ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動により約 24， 500と算出される。 本酵素もモルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466の無細胞抽出液より精製した酵素 と同様にヌクレオシドへの燐酸転移活性だけでなく、 逆に燐酸エステルを加水分 解する活性も示した。 しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性に比べ て 30倍以上高い活性を示すことから、 酸性フォスファターゼであることが明らか となった。
ピロ燐酸ナトリウム 15g/dl及びイノシン 3g/dlを pH5.5、 5.0、 4.5、 4.0、 3.5の 各 pHの酢酸ナトリゥムバッファーに溶解し、 これに上記の酵素標品を 50units/dl となるように添加した。 各 pHを維持しながら 30°Cで 6時間反応を行い、 経時的に 生成した 5' —イノシン酸の量を測定した。 なお、 生成したイノシン酸は 5' — イノシン酸のみで、 2' —イノシン酸及び 3' —イノシン酸の副生は全く認めら れなかった。 結果を図 2に示す。 5' —イノシン酸の生成速度は PH5.0の時に最大 となったが、 5' —イノシン酸の最大蓄積量は pHがより低い範囲の方が高く、 5 ' —イノシン酸の生産は pH4.0の反応条件が最も効率的であった。 30°C、 pH4.0の 反応では 3時間で 1.56g/dlの 5 ' —イノシン酸が生成蓄積した。 実施例 5 ェシ リヒア ·ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼ標品による 種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム 15g/dl及びイノシン、 グアノシン、 ゥリジン又はシチジン を 3g/dlを酢酸ナトリウムバッファ一 （pH4.0) に溶解し、 これに実施例 4の酵素 標品を 50units/dlとなるように添加し、 pHを 4. 0に維持しながら、 35^で 3時間反 応させた。 生成したヌクレオシドー 5 ' —エステルの量を表 5に示す。
なお、 生 したヌクレオチドはヌクレオシドー 5 ' —エステルのみでヌクレオ シドー 2 ' —エステル;^びヌクレオシドー 3 ' —エステルの副生は全く認められ なかった。 . ' 表 5
Figure imgf000025_0001
実施例 6 ェシエリヒア ·ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼ標品による 種々の燐酸化合物を燐酸供与体とする 5 ' —イノシン酸の生産 イノシン 2 g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナトリウム、 ポリ燐酸ナト リウム （商品名 ：ポリゴン P、 千代田化学 （株） 製品） 、 フユニル燐酸ジナトリ ゥム又は力ルバミル燐酸ジナトリゥム 10g/dlを酢酸ナトリゥムバッファー （ρΗ4· 0) に溶解し、 これに実施例 4で調製した酵素標品を上記の酵素標品を 50units/d 1となるように添加し、 pHを 4. 0に維持しながら、 35°Cで 3時間反応させた。 生成 した 5 ' —イノシン酸の量を表 6に示す。
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく 5 ' -イノシン酸が生成蓄積し たが、 ポリ燐酸ナトリウムを燐酸供与体として用いた場合に最も 5 ' —イノシン 酸の蓄積量が高かった。 表 6
Figure imgf000026_0001
実施例 7 モルガネラ ·モルガ二染色体からの酸性フォスファターゼを
コードする遺伝子の単離
(1 ) N末端アミノ酸配列の決定
モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466の無細胞抽出液から実施例 1記載の方法に 従い精製した酸性フォスファターゼを D I TCメンブレン （Milligen/Biosearch 社製） に吸着させ、 Prosequencer 6625 (Milligen/Biosearch社製） を用いて N末 端のアミノ酸配列を決定した。 配列表配列番号 1に示した 20残基の N末端アミノ 酸配列が決定された。
(2) 酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む DNA断片の単離 モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466の培養菌体から Murray and Thomsonの方法
(Nucl. Acid Res. , 4321, 8 (1980)) に従い、 染色体 DNAを調製した。 これを 制限酵素 S a u 3 A Iで部分分解した後、 ショ糖密度勾配遠心分離により 3〜 6 kbpの DNA断片を分画した。 プラスミ ドベクター PUC118 (宝酒造社製） を制限酵 素 B amH Iで切断し、 部分分解した染色体 D N A断片と連結させた。 DNAの 連結は DNAライゲーシヨンキッ ト （宝酒造社製） を用い、 措定された方法にて 行った。 次いで、 得られた DN A混合物を用いて常法によりェシヱリヒア ' コリ
JM109 (宝酒造社製） を形質転換した。 形質転換体をアンピシリン 100 g/inlを含 む L寒天培地上にプレーティングして生育させ、 遺伝子ライブラリーを作成した。 形質転換体の生育した寒天培地の表面に 4 DIM p -二トロフエニル燐酸及び 100 mM メスパ N a OHバッファー （pH6.5) を含む反応液を注ぎ、 30°Cで 15分間保温 した。 フォスファターゼ活性を発現した菌は、 p—二トロフヱノールを遊離して 黄色を示すため、 これを指標として形質転換体を選択した。 約 20, 000株の形質転 換体の遣伝子発現ライブラリ一を探索した結果、 フォスファターゼ活性を発現し た形質転換体 30株が得られた。
フォスファターゼ活性を発現した 30株の形質転換体を単コロニー分離し、 アン ピシリン100 8/1111を含む乙培地2. 51111に接種し、 37°Cで 16時間培養した。 培養液 より集菌した菌体にィノシン 2 g/dl及びピロ燐酸ナトリゥム 10g/dlを含む lOOmM酢 酸ナトリウムバッファー （pH5. 0) 50 1を添加し、 30°Cで 16時間反応を行った。 H P L C分析にて 5 ' -イノシン酸の生成を検出し、 燐酸転移活性を持つ菌株を 選択した。 その結果、 燐酸転移活性を示し、 目的の酸性フォスファターゼ遺伝子 を含む D N A断片を保有すると予想される形質転換体 5株を得ることができた。 実施例 8 モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466由来の 酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例 7で得られたモルガネラ ·モルガ二 NCIMB10466由来酸性フォスファタ一 ゼ遺伝子を含む D N A断片を保有すると予想される形質転換体の 1株より、 アル カリ溶菌法 (Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch an d T. aniatis, Cold Spring Harbour Laboratoty Press, pi. 25 ( 1989) ) によ りプラスミ ドを調製し、 挿入された D N A断片の解析を行った。 なお、 このブラ スミ ドを pMPI501と命名した。 決定した挿入 D N A断片の制限酵素地図を図 3に示 す。
さらにサブクローニングにより、 酸性フォスファタ一ゼ遺伝子領域を限定した 結果、 制限酵素 H i n d i l lと制限酵素 E c o R Iで切り出される 1. 2Kbpの大きさ の断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。 そこで 塩基配列の決定のために、 この 1. 2kbDの断片を H i n d I I I及び E c o R Iで切断 した PUC118に結合したプラスミ ド D N Aを構築した。 pMPI505と命名したこのブラ スミ ド D N Aを用いて常法によりェシヱリヒア · コリ JM109 (宝酒造 （社） 製） を形質転換し、 これを 100 / g/mlのアンピシリンを含む L寒天培地上にプレーティ ングし、 形質転換体を得た。 C 1402
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PMPI505を保有するェシヱリヒア · コリ ·ΙΜ109 (宝酒造製） の形質転換体よりァ ルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 塩基配列の決定を行った。 塩基配列の 決定は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (アプライ ドバイオケ ミカル社製） を用い、 サンガーらの方法 （J. Mol. Biol. , 143， 161 (1980)) に 従って行った。 決定したオープン · リ ディング 'フレームの塩基配列を配列表 配列番号 2に示した。 また、 この塩基配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列 を配列表配列番号 3に示した。 このアミノ酸配列中に精製酵素の Ν末端アミノ酸 配列と完全に一致する配列が存在した。 精製酵素の Ν末端は配列番号 3に示され る配列の 21番目のァラニン残基から開始していたため、 配列番号 3に示されるァ ミノ酸配列は前駆体蛋白質の配列であり、 1番目のメチォニン残基から 20番目の ァラニン残基までのぺプチドは翻訳後に除去されるものと考えられた。 これより 推定される成熟蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号 4に示した。 アミノ酸配 列から予想される成熟蛋白質の分子量は 24. 9キロダルトンと算出され、 精製酵素 の S D S— P A G Eの結果とよく一致した。 以上の結果及び本断片を含むブラス ミ ドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示すことから本オープン · リーデイン グ · フレームは目的の酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする領域であると同定した。 塩基配列、 アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った。 用 いたデーターベースは E M B L及び S W I S S— P R 0 Tである。 その結果、 配 列表配列番号 2に示される塩基配列は、 既知のモルガネラ ·モルガ二由来の酸性 フォスファターゼ遺伝子 （Thaller, M. C. et. al. Microbiology , 140, 1341 (1994)) では、 54番目の Gが Α、 72番目の Gが Α、 276番目の Τが G、 378番目の Tが C、 420番目の Gが T、 525番目の Cが G、 529番目の Cが T、 531番目の Gが Αである以外は配列が一致し、 また、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列 は、 モルガネラ ·モルガ二由来の酸性フォスファターゼと同一であることが判明 した。 すなわち、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコ ードする遺伝子が、 モルガネラ 'モルガ二 NCIMB 10466の酸性フォスファターゼ 退伝子であな。
なお、 前駆体蛋白質は 249個のアミノ酸から成り、 その配列から予想される蛋白 質の分子量は 27. 0キロダルトンであった。 また、 pMPI505をェシヱリヒア ·コリ JM 109に保持させた株は、 AJ13143と命名 され、 平成 8年 2月 23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国 城県つくば市東一丁目 1番 3号） にブタペスト条約に基づき国際寄託 され、 受託番号 FERM B.P- 5422が付与されている。 実施例 9 モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466由来の酸性フォスファターゼ
遺伝子の発現による活性の増幅 実施例 8にて構築したェシヱリヒア · コリ JM109/PMPI505をアンピシリン 100 / g/nil及び I P T G I mMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。 該 培養液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。 菌体を 5 ml の lOOmM燐酸カリウムバッファー （ΡΗ7· 0) に懸濁し、 4 °Cで 20分間超音波処理を 行い破砕した。 処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出液を調製し た。
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、 プラスミ ド PUC118で同様に形質転換 したェシヱリヒア ·コリ JM109及びモルガネラ ·モルガ二野生株より調製した無 細胞抽出液の活性を対照として測定した結果を表 7に示した。 ェシエリヒア 'コ リ JM109/PUC118では燐酸転移活性は検出されず、 モルガネラ ·モルガ二野生株 でも燐酸転移活性は低かった。 一方、 ェシエリヒア 'コリ JM109ZpMPI505はモル ガネラ ·モルガ二野生株に比べて比活性で 150倍と高い燐酸転移活性を示しており、 この結果から導入した D N A断片がェシヱリヒア 'コリにおいて酸性フォスファ ターゼを高発現していることが示された。 表 7 ή 株 燐酸耘移活性（units/mg)
モルガネラ ·モルガ二 NCIMB10466 . 0. 008
ェシエリヒア 'コリ JM109/PUC118 検出せず
ェシヱリヒア ' コリ JM109/PMPI505 1. 250 実施例 1 0 モルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466由来の酸性フォスファターゼ 遺伝子保持株を用いたイノシンから 5 ' —イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリゥム 12g/dl及びイノシン 6 g/dlを lOOmM酢酸ナトリウムバッファ ― (PH4. 0) に溶解し、'これに上記のェシヱリヒア ' コリ JM109/PMPI505の菌体 を乾燥菌体童量で 100mg/dlとなるように添加し、 pHを 4. 0に維持しながら、 30°C で 6時間反応を行い、 経時的に生成した 5 ' —イノシン酸の量を測定した。 なお、 生成したイノシン酸は 5 ' —イノシン酸のみで 2 ' —イノシン酸及び 3 ' —イノ シン酸の副生は全く認められなかった。 結果を図 4に示す。 酸性フォスファタ一 ゼ遺伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、 本菌を用いたピロ燐酸 とイノシンからの 5 ' —イノシン酸生産反応においては、 非常に効率よく短時間 で 5 ' —イノシン酸が生成蓄積した。 し力、し、 反応時間をのばすと生成蓄積した 5 ' —イノシン酸の分解による減少が認められた。 実施例 1 1 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファタ一ゼ
遺伝子の作成 実施例 9及び 1 0に示したように酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は著量の 酸性フォスファターゼを発現し、 本菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの 5 ' — イノシン酸生産反応においては、 非常に効率よく短時間で 5 ' —イノシン酸が生 成蓄積する。 し力、し、 生成した 5 ' —イノシン酸が酸性フォスファターゼ自体が 有する燐酸エステル加水分解活性によって分解を受けるために 5 ' —イノシン酸 の蓄積量がある程度以上は上がらないことが判明した。 そこで実施例 7にてクロ 一二ングしたモルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466由来酸性フォスファターゼ遺伝 子に P C Rを用 L、る部位特異的変異法により変異を導入し、 酵素の改質を行つた。
D N A合成装置 （アプライ ドバイオシステム社製モデル 394) を用いてホスホア ミダイ ト法にて配列表配列番号 5、 6及び 7に示す配列を有するオリゴヌクレオ チド MUT500、 MUT510及び MUT520をそれぞれ合成した
铸型として実施例 8で調製したプラスミ ド pMPI 505 l ng、 プライマーとして M 13プライマー R V (宝酒造社製） と MUT510オリゴヌクレオチド各 2. 5 mol及び夕 ック D N Aポリメラーゼ （宝酒造社製） 2.5ュニッ トを dATP、 dCTP、 dGTP、 dnP各 200 M、 塩化カリウム 50mM及び塩化マグネシウム 1.5mMを含む lOOmM トリス一塩 酸緩衝液 （pH8.3) に添加し、 94°Cを 30秒、 55°Cを 2分、 72°Cを 3分のサイ クルを 25回繰り返す P C R反応を行った。 P C R反応はサ一マルサイクラ一 PJ20 00型 （宝酒造社製） を用いて行った。 まプこ別に、 铸型としてプラスミ ド DNA p MPI505 lng、 プライマーとして M13プライマ一 M4 (宝酒造社製） と MUT500オリ ゴヌクレオチド各 2.5 molを用いて同様に P CR反応を行った。 それぞれの反応 液をマイクロスピンカラム S- 400 (フアルマシア社製） を用いてゲル濾過により精 製し、 プライマーを除去した。
それぞれの PC R反応液 1 ^1を dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各 200 ^M、 塩化力リウ ム 50mM及び塩化マグネシウム 1.5mMを含む lOOmM トリスー塩酸緩衝液 （pH8.3) 95/zlに添加し、 94°Cで 10分加熱後、 60分間かけて 37°Cまで冷却した後、 37°Cで 1 5分保温しへテロ二本鎖を形成させた。 これに夕ック D N Aポリメラーゼ 2.5ュニ ッ トを添加して 72°Cで 3分反応を行い、 ヘテロ二本鎖を完成させた。 次に、 この 反応液に M13プライマー RV及び M13プライマー M4各 2.5 molを添加して、 94°C を 30秒、 55°Cを 2分、 72°Cを 3分のサイクルを 10回繰り返す P CR反応を行った。
2回目の P CR反応の生成物を H i n dlllと E c oR Iで切断後フヱノール/ クロ口ホルム抽出し、 エタノール沈殿した。 この DNA断片を H i n dill及び E _^_Q_R Iで切断した pU 18に結合し、 得られたプラスミ ド DNAを用いて常法に よりェシヱリヒア *コリ JM109 (宝酒造製） を形質転換した。 これを 100/zg/inlの アンピシリンを含む L寒天培地上にプレーティングし、 形質転換体を得た。 形 質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 塩基配列の決定を行い、 目的の塩基が置換されていることを確認した。 塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy T erminator Cycle Sequencing Kit (アプライ ドバイォケミカル社製） を用い、 サ ンガーらの方法 （J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) に従って行った。 このよう にして成熟蛋白質の 72番目のグリシン残基 （GGT) がァスパラギン酸残基 （G*AT) に置換した変異型フォスファタ一ゼをコ一ドする変異型遺伝子を作成した。 この 変異型遺伝子を含むプラスミ ドを PMPI510と命名した。
また、 铸型として pMP1505、 プライマーとして MUT500と MUT520オリゴヌクレオチ ドを用いて同様の操作により、 成熟蛋白質の 151番目のイソロイシン残基 （ATC) がスレオニン残基 (A*CC) に置換した変異型フォスファタ一ゼをコ一ドする変異 型遺伝子を作成した。 この変異型遺伝子を含むプラスミ ドを PMPI520と命名した。 さらに铸型として pMPI510、 プライマーとして MUT500と MUT520オリゴヌクレオチド を用いて同様の操作により、 成熟蛋白質の 72番目のグリシン残基 （GGT) がァスパ ラギン酸残基 （G*AT) に、 151番目のイソロイシン残基 （ATC) がスレオニン残基 (A*CC) に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成し た。 この変異型遺伝子を含むプラスミ ドを PMPI530と命名した。
それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェ シエリヒア . コリ JM109ZpMPI510、 ェシヱリヒア . コリ JM109ZpMPI520、 ェシ エリヒア · コリ JM109ZpMPI530及び野生型酸性フォスファタ一ゼ遺伝子を含むプ ラスミ ドを導入したェシヱリヒア 'コリ JM109ZpMPI505をアンピシリン lOO yW g/ ml及び I P T G I mMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。 該培養 液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。 菌体を 5 mlの 10 OmM燐酸カリウムバッファー （ρΗ7· 0) に懸濁し、 4 °Cで 20分間超音波処理を行い 菌体を破砕した。 処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出液を調製 した。 得られた無細胞抽出液の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸耘移活性を pH 4. 0にて測定し、 野生株のものと比較した。
野生型および変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性及び燐 酸転移活性を測定した結果を表 8に示す。 変異型酸性フォスファターゼは、 野生 型酸性フォスファターゼと比較して、 燐酸エステル加水分解活性と燐酸転移活性 がいずれも低下していたが、 燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大き く、 その結果、 変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性/燐酸 転移活性の比は野生型酸性フォスファターゼに比べて低くなつていた。 表 8
Figure imgf000033_0001
実施例 12 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ
遺伝子保持株を用いたイノシンから 5' —イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェシエリヒア • コリ JM109/'pMPI510、 ェシヱリヒア ' コリ JM109ZpMPI520、 ェシヱリヒア ' コリ JM109/PMPI530及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを 導入したェシエリヒア · コリ JM109ZpMPI505をアンピシリン 100/ g/ml及び I P TG ImMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリゥム 12g/dl及びイノシン 6g/dlを 100mM酢酸ナトリウムバッファ ― (PH4.0) に溶解し、 これに上記の培養で得たェシヱリヒア ' コリ各菌株の菌体 を乾燥菌体重量で 100mg/dlとなるように添加し、 pHを 4.0に維持しながら、 30°C で 22時間反応を行い、 経時的に生成した 5' —イノシン酸の量を測定した。 結果 を図 5に示す。
図 5中、 縦軸は 5' —イノシン酸の濃度 （mg/dl) を、 横軸は反応時間 （h) を、 また黒埋め円形はェシヱリヒア ' コリ （Escherichia coli) JM109/pMPI505、 黒埋 め三角形はェシヱリヒア . コリ （Escherichia coli) JM109/pMPI510、 白抜き円形 はェシヱリヒア . コリ （Escherichia coli) JM109/pMPI520> 白抜き四角形はェシ エリヒア . コリ （Escherichia coli) JM109/pMPI530の各菌体を使用した場合の反 応の推移を示す。
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた イノシンから 5' —イノシン酸の生産反応においては生成した 5' —イノシン酸 の分解速度が低下しており、 その結果として 5' —イノシン酸の収率及び蓄積量 2
32 が向上した。 72番目のグリシン残基及び 151番目のイソロイシン残基がそれぞれァ スパラギン酸残基及びスレオニン残基へと置換された変異型酸性フォスファタ一 ゼ遺伝子保持株ェシヱリヒア ' コリ JM109ZpMPI 530が最も高い 5 ' —イノシン酸 の蓄積を示した。 実施例 1 3 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子 保持株を用いた各種ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェシエリヒア • コリ JM109/ pMPI530をアンピシリン 100 /z g/ml及び I P T G ImMを含む L培地 5 Omlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム 12g/dl及び燐酸受容体としてイノシン、 グアノシン、 ゥリ ジン又はシチジン 6 g/dlを lOOmM酢酸ナトリウムバッファー （pH4. 5) に溶解し、 これに上記の菌体を乾燥菌体重量で 100mg/dlとなるように添加し、 pHを 4. 0に維 持しながら、 30 で 22時間反応させた。 生成したヌクレオシドー 5 ' —燐酸エス テルの量を表 9に示した。 なお、 生成したヌクレオチドはヌクレオシドー 5 ' — 燐酸エステルのみでヌクレオシドー 2 ' —燐酸エステル及びヌクレオシドー 3 ' 一燐酸エステルの副生は全く認められなかった。 表 9
Figure imgf000034_0001
実施例 1 4 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子 保持株を用いた各種燐酸化合物を燐酸供与体とする 5 ' -イノシン酸の生產 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェシエリヒア ' コリ JM109ZpMPI530を、 アンピシリン 100 g/ml及び I P T G 1 mMを含む L培 地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。
イノシン 6 g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナトリウム、 ポリ燐酸ナト リゥム （商品名 ：ポリ 'ン 、 千代田化学 （株） 製品）、 フヱニル酢酸ジナトリ ゥム又は力ルバミル燐酸ジナトリゥム 10g/dlを酢酸ナトリゥムバッファー （pH4. 5) に溶解し、 これに上記の菌体を乾燥菌体重量で 100mg/dlとなるように添加し、 pHを 4. 0に維持しながら 30°Cで 22時間反応させた。 生成した 5 ' —イノシン酸の量 を表 1 0に示した。 いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく 5 ' —イノシ ン酸が生成蓄積したが、 ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合に最も 5 ' -ィ ノシン酸の蓄積量が高かった。 表 1 0
Figure imgf000035_0001
実施例 1 5 ェシヱリヒア ·ブラッタエ染色体からの酸性フォスファターゼ
をコ一ドする遺伝子の単離
( 1) N末端アミノ酸配列の決定
ェシヱリヒア，ブラッタエ JCM 1650の無細胞抽出液から精製した酸性フォスフ ァターゼを D I T Cメンブレン （ミリジヱン Zバイオサーチ社製） に吸着させ、 Prosequencer 6625 (ミリジヱン /バイオサーチ社製） を用いて N末端のアミノ酸 配列を決定した。 配列表配列番号 8に示す 15残基の N末端ァミノ酸配列が決定さ れた。
(2) 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子断片の単離
ェシヱリヒア .ブラッ夕ェ JCM 1650の培養菌体から Murray and Thomsonの方法 (Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)) に従い、 染色体 DN Aを調製した。 これを S a u 3 A Iで部分分解した後、 ショ糖密度勾配遠心分離により 3〜6Kbpの DN A断片を 画した。 プラスミ ドベクター pUC118 (宝酒造社製） を B amti Iで切 断し、 部分分解した染色体 DNA断片と連結させた。 DNAの連結は DNAライ ゲーシヨンキッ ト （宝酒造社製） を用 、、 指定された方法にて行った。 次いで、 得られた DN A混合物を用いて常法によりェシヱリヒア · コリ JM109 (宝酒造社 製） を形質転換した。 形質転換体をアンピシリン 100;/ g/mlを含む L寒天培地上に プレーティングして生育させ、 遺伝子ライブラリーを作成した。
形質転換体の生育した寒天培地の表面に 4mM p -二トロフユニル燐酸及び 100 mM メス ZN a OHバッファー （pH6.5) を含む反応液を注ぎ、 30°Cで 15分間保温 した。 フォスファターゼ活性を発現した菌は、 p—ニトロフヱノールを遊離して 黄色を示すため、 これを指標として、 形質転換体を選択した。 約 8， 000株の形質転 換体の染色体遺伝子発現ライブラリ一を探索した結果、 フォスファターゼ活性を 発現した形質転換体 14株が得られた。
フォスファターゼ活性を発現した 14株の形質転換体を単コロニー分離し、 アン ピシリン 100 ;zg/mlを含む L培地 2.5mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。 培養液 から集菌した菌体にイノシン 2g/dl及びピロ燐酸ナトリゥム 10g/dlを含む lOOmM酌 酸ナトリウムバッファー （pH5.0) 50 lを添加し、 30°C 16時間反応を行った。 H PLC分析にて 5' —イノシン酸の生成を検出し、 燐酸転移活性を持つ菌株を選 択した。 その結果、 燐酸転移活性を示し、 目的の酸性フォスファターゼ遺伝子断 片を保有すると予想される形質転換体 3株を得ることができた。 実施例 1 6 ェシヱリヒア ·ブラッ夕ェ JCM 1650由来酸性フォスファターゼ 遺伝子の塩基配列の決定 実施例 1 5で得られたェシヱリヒア ·ブラツタヱ JCM 1650由来酸性フォスフ ァ夕一ゼ遺伝子を含む DN A断片を保有すると予想される形質転換体の 1株より アルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 挿入された DNA断片の解析を行つ た。 このプラスミ ドを pEPI301と命名した。 決定した挿入された DN A断片の制限 酵素地図を図 6に示す。
さらにサブクローニングにより酸性フォスファタ一ゼ遺伝子領域を限定した結 果、 制限酵素 C 1 a I と B a m H Iで切り出される 2. 4kbpの大きさの断片中に本 酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。 そこで塩基配列の決 定のために該断片を C 1 a I及び B a m H Iで切断した pBluescript KS ( +) (ス トラテジーン社製） に結合したプラスミ ド D N Aを構築した。 pEPI305と命名した このプラスミ ド D N Aを用いて常法によりェシヱリヒア · コリ JM109 (宝酒造製） を形質転換し、 これをアンピシリン 100 / g/mlを含む L寒天培地上にプレーティン グし、 形質転換体を得た。
PEPI305を保有するェシエリヒア · コリ JM109 (宝酒造製） の形質転換体よりァ ルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 塩基配列の決定を行った。 決定したォ —プン · リーディング ·フレームの塩基配列を配列表配列番号 9に示した。 この 塩基配列より推定される蛋白質のァミノ酸配列を配列表配列番号 1 0に示した。 このアミノ酸配列中に精製酵素の N末端アミノ酸配列と完全に一致する配列が存 在した。 精製酵素の N末端は配列表配列番号 1 0の配列の 19番目のロイシン残基 から開始していたため、 配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列は前駆体蛋白質の 配列であり、 1番目のメチォニン残基から 18番目のァラニン残基までのぺプチド は翻訳後に除去されるものと考えられた。 これより推定される成熟蛋白質のァミ ノ酸配列を配列表配列番号 1 1に示した。 これより予想される成熟蛋白質の分子 量は 25. 1キロダルトンと算出され、 精製酵素 S D S— P A G Eの結果とよく一致 した。 以上の結果及び本断片を含むプラスミ ドを有する形質転換体が燐酸転移活 性を示すことから本オープン · リーディング ' フレームは目的の酸性フォスファ ターゼをコ一ドする領域であると同定した。
すなわち、 配列表番号 1 1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードす る遺伝子が、 ェシヱリヒア 'ブラッタエ JCM 1650の酸性フォスファターゼ遺伝子 である。
塩基配列、 アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った。 用 いたデーターベースは E M B L及び S W I S S— P R O Tである。 その結果、 配 列表番号 8に示される蛋白質及びそれをコードする D N Aは新規であることが判 明した。 本遺伝子のコードする前駆体蛋白質は 249個のアミノ酸から成り、 その配 列から予想される蛋白質の分子量は 27. 0キロダルトンであった。
アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った結果、 本蛋白質 はプロビデンシァ 'スチユアルティ （Providencia stuartii ) の酸性フォスファ ターゼと 77. 4.%、 実施例 8のモルガネラ '·モルガ二 （Morganella morgan ii) の酸 性フォスファターゼと 77. 1%、 サルモネラ 'チヒムリウム （Salmonella typhimu rium) の酸性フォスファ夕一ゼと 44. 3%の相同性を示した。
なお、 pEPI305をェシヱリヒア · コリ JM 109に保持させた株は、 AJ13144と命名 され、 平成 8年 2月 23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） にブタペスト条約に基づき国際寄託 され、 受託番号 FERM BP- 5423が付与されている。 実施例 1 7 ェシヱリヒア 'ブラッタエ JCM 1650 由来の酸性フォスファターゼ 遺伝子の発現による活性の増幅 実施例 1 6で作成したェシヱリヒア ' コリ JM109ZPEPI305をアンピシリン 100 ； g/ml及び I P T G I mMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。 該 培養液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。 菌体を 5 ml の lOOmM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) に懸濁し、 4 °Cで 20分間超音波処理を 行い菌体を破砕した。 処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出液を 調製した。
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、 プラスミ ド pBluescript KS ( +) で同 様に形質転換したェシヱリヒア ' コリ JM109及びェシヱリヒア 'ブラッタエ野生 株より調製した無細胞抽出液を対照として測定した結果を表 1 1に示した。 ェシ エリヒア . コリ JM109ZpBluescript KS ( + ) では燐酸転移活性は検出されず、 ェ シヱリヒア ·ブラッタエ野生株でも燐酸転移活性は低かった。 一方、 エシュリヒ ァ · コリ JM109ZpEPI305はェシヱリヒア ·ブラッタエ野生株に比べて比活性で 1 20倍と高い燐酸耘移活性を示しており、 この結果から導入した D N A断片がェシ エリヒア · コリにおいて酸性フォスファタ一ゼを高発現していることが示された。 表 1
Figure imgf000039_0001
実施例 1 8 ェシヱリヒア ·ブラッタエ JCM 1650 由来の酸性フォスファターゼ 遺伝子保持株を用いたイノシンから 5' —イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリゥム 12g/dl及びイノシン 6 g/dlを lOOmM酢酸ナトリゥムバッフ ァー （pH4.0) に溶解し、 これに上記のェシヱリヒア ' コリ JM109ZpEPI305の菌 体を乾燥菌体重量で 200mg/dlとなるように添加し、 pHを 4.0に維持しながら、 35°C で 10時間反応を行い、 経時的に生成した 5' —イノシン酸の量を測定した。 なお、 生成したイノシン酸は 5' —イノシン酸のみで 2' —イノシン酸及び 3' —イノ シン酸の副生は全く認められなかった。 結果を図 7に示す。 本菌を用いたピロ燐 酸とイノシンからの 5' —イノシン酸生産反応においては、 非常に効率よく短時 間で 5' —イノシン酸が生成蓄積した。 実施例 19 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ
遺伝子の作成 実施例 17及び 18に示したようにェシヱリヒア ·ブラッ夕ェ由来酸性フォス ファターゼ遺伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、 本菌を用いた ピロ燐酸とイノシンからの 5' —イノシン酸生産反応においては、 非常に効率よ く短時間で 5' —イノシン酸が生成蓄積する。 しカヽし、 生成した 5' —イノシン 酸が酸性フォスファターゼ自体が有する燐酸エステル加水分解活性によって分解 を受けるために 5' —イノシン酸の蓄積量がある程度以上上がらないことが判明 した。 そこで実施例 1 5にてクローニングしたェシヱリヒア 'ブラッ夕ェ由来酸 性フォスファターゼ遺伝子に P CRを用いる部位特異的変異法により変異を導入 し酵素の性質の改良を行うこととした。
DNA合成装置 （アプライ ドバイオシステム社製モデル 394) を用いてホスホア ミダイ ト法に.て配列表配列番号 12、 1'3及び 14に示すォリゴヌクレオチド Μϋ T300、 MUT310及び MUT320をそれぞれ合成した。
铸型として実施例 1 6で調製したプラスミ ド pEPI305 lng、 プライマーとして M13プライマー RV (宝酒造社製） 及び MUT310オリゴヌクレオチド各 2·5 ζπιο1及 びタック D Ν Αポリメラーゼ （宝酒造社製） 2.5ュニッ トを dATP、 dCTP、 dGTP、 d TTP各 、 塩化カリウム 50mM及び塩化マグネシウム 1.5mMを含む lOOmM トリ スー塩酸緩衝液 （ρΗ8·3) 100 に添加し、 94°Cを 30秒、 55°Cを 2分、 72°Cを 3分 のサイクルを 25回繰り返す P CR反応を行った。 P CR反応はサーマルサイクラ 一 PJ2000型 （宝酒造社製） を用いて行った。 また別に、 铸型としてプラスミ ド pE PI305 lng、 プライマーとして M13プライマ一 M3 (宝酒造社製） 及び MUT300オリ ゴヌクレオチド各 2.5 zmolを用いて同様に P CR反応を行った。 それぞれの反応 液をマイクロスピンカラム S- 400 (フアルマシア社製） を用いてゲル濾過により精 製し、 プライマーを除去した。
それぞれの PC R反応液 1 1を dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各 200^M、 塩化力リウ ム 50mM及び塩化マグネシウム 1·5πιΜを含む lOOmMトリスー塩酸緩衝液 （pH8.3) 9 5 1に添加し、 94°Cで 10分加熱後、 60分間かけて 37°Cまで冷却した後、 37°Cで 15 分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。 これにタック DN Aポリメラーゼ 2.5ュニッ トを添加して 72°Cで 3分反応を行い、 ヘテロ二本鎖を完成させた。 次に、 この反応 液に M13プライマー R V及び M13プライマー M3各 2.5 molを添加して、 94°Cを 3 0秒、 55°Cを 2分、 72°Cを 3分のサイクルを 10回繰り返す P CR反応を行った。
2回目の P CR反応の生成物を _^J__Iと B a mH Iで切断後フヱノール Zク ロロホルム抽出し、 エタノール沈殿した。 この DNA断片を C 1 a Iと B a mH Iで切断した pBluescript KS ( + ) に結合し、 得られたプラスミ ド DNAを用い て常法によりエシュリヒア · コリ JM109 (宝酒造製） を形質転換した。 これを 10 0 zg/mlのアンピシリンを含む L寒天培地上にプレーティングし、 形質転換体を得 た。
形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 塩基配列の決定を 行い、 目的の塩基が置換されていることを確認した。 このようにして成熟蛋白質 の 74番目のグリシン残基 （GGG) がァスパラギン酸残基 （G*A*T) に置換した変異 型フォスフ 7：ターゼをコ一ドする変異型遺伝子を作成した。 この変異型遺伝子を 含むプラスミ ドを PEPI310と命名した。
铸型として pEPI305、 プライマーとして MUT300と MUT320オリゴヌクレオチドを用 いて同様の操作により、 成熟蛋白質の 153番目のイソロイシン残基 （ATC) がスレ ォニン残基 （A*CC) に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝 子を作成した。 この変異型遺伝子を含むプラスミ ドを PEPI320と命名した。 さらに 铸型として pEPI310、 プライマーとして MUT300と MUT320オリゴヌクレオチドを用い て同様の操作により、 成熟蛋白質の 74番目のグリシン残基 （GGG) がァスパラギン 酸残基 （G*A*T) に、 153番目のイソロイシン残基 （ATC) がスレオニン残基 （A*C C) に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。 こ の変異型遣伝子を含むプラスミ ドを PEPI330と命名した。
それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むブラスミ ドを導入したェ シエリ ヒア . コリ JM109z pEPI310、 ェシヱリ ヒア . コリ JM109ZpEPI320、 ェシ エリヒア · コリ JM109ZPEPI330及び野生型酸性フォスファタ一ゼ遺伝子を含むプ ラスミ ドを導入したェシヱリ ヒア ' コリ JM109ZpEPI305をアンピシリ ン 100 / g/ ml及び I P T G I mMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。 該培養 液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。 菌体を 5 mlの 10 OmM燐酸カリウムバッファー （pH7. 0) に懸濁し、 4 °Cで 20分間超音波処理を行い 破砕した。 処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出液を調製した。 得られた無細胞抽出液の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を PH4. 0にて 測定し、 野生株のものと比較した。
野生型および変異型酸性フォスファタ一ゼの燐酸エステル加水分解活性及び燐 酸転移活性を測定した結果を表 1 2に示す。 変異型酸性フォスファターゼは、 野 生型酸性フォスファターゼと比較して、 燐酸エステル加水分解活性と燐酸転移活 性がいずれも低下していたが、 燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大 きく、 その結果、 変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性 Z燐 酸転移活性の比ば野生型酸性フォスファターゼに比べて低くなつていた。 表 1 2
Figure imgf000042_0001
実施例 2 0 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子
保持株を用いたイノシンから 5 ' —イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファタ一ゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェシエリヒア • コリ JM109/pEPI310、 ェシヱリ ヒア ' コリ JM109ZpEPI320、 ェシヱリ ヒア ' コリ JM109ZpEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを 導入したェシエリヒア · コリ JM109ZpEPI305をアンピシリン 100 g/ml及び I P T G l mMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリゥム l½/dl及びイノシン 6 g/dlを酢酸ナトリゥムバッファー (PH4. 0) に溶解し、 これに上記培養で得たェシエリヒア 'コリ各菌株の菌体を乾 燥菌体重量で 200mg/dlとなるように添加し、' pHを 4. 0に維持しながら、 35°Cで 32時 間反応を行い、 経時的に生成した 5 ' —イノシン酸の量を測定した。 結果を図 8 に示す。
図 8中、 縦軸は 5 ' —イノシン酸の濃度 （mg/dl) を、 横軸は反応時間 （h ) を、 また黒埋め円形はェシヱリヒア · コリ （Escherichia coli) JM109/pEPI305 黒埋 め三角形はェシヱリヒア 'コリ （Escherichia coli ) JM109/pEPI310、 白抜き円形 はェシヱリヒア . コリ （Escherichia coli) JM109/pEPI320、 白抜き四角形はェシ エリヒア · コリ （Escherichia coli) JM109/pEPI 330の各菌体を使用した場合の反 応の推移を示す。 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた イノシンから 5 ' —イノシン酸の生産反応においては生成した 5 ' —イノシン酸 の分解速度が低下しており、 その結果として 5 ' —イノシン酸の収率及び蓄積量 が向上した。 7 4番目のグリシン残基及び 1 5 3番目のイソロイシン残基がそれ ぞれァスパラギン酸残基及びスレオニン'残基へと置換された変異型酸性フォスフ ァ夕一ゼ遺伝子保持株ェシヱびヒア ' コリ JM109/PEPI330が最も高い 5 ' —イノ シン酸の蓄積を示した。 実施例 2 1 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子 保持株を用いた各種ヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェシエリヒア • コリ JM109ZpEPI330をアンピシリン 100 g/ml及び I P T G I mMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム 12g/dl及び燐酸受容体としてイノシン、 グアノシン、 ゥリ ジン又はシチジン 6 g/dlを lOOmM酢酸ナトリウムバッファー （pH4. 5) に溶解し、 これに上記の菌体を乾燥菌体重量で 200mg/dlとなるように添加し、 pHを 4. 0に維 持しながら、 35°Cで 32時間反応させた。 生成したヌクレオシドー 5 ' —燐酸エス テルの量を表 1 3に示した。 なお、 生成したヌクレオチドはヌクレオシド— 5 ' 一燐酸エステルのみでヌクレオシドー 2 ' —燐酸エステル及びヌクレオシド— 3 ' 一燐酸エステルの副生は全く認められなかった。 表 1 3 ヌクレオシド 生成物 生成量 (g/dl )
イノシン 5 ' —イノシン酸 7. 45
グアノシン 5 ' ーグァニル酸 4. 77
ゥリジン 5 ' ーゥリジル酸 8. 93
シチジン 5 ' ーシチジル酸 6. 60 実施例 2 2 燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子 保持株を用いる各種燐酸化合物を燐酸供与体とする 5 ' -イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミ ドを導入したェシエリヒア •コリ JM109ZPEPI330をアンピシリン； 100 g/ml及び I ?丁0 1 0^を含む1^培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。
イノシン 6 g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナトリウム、 ポリ燐酸ナト リウム （商品名 ：ポリゴン P、 千代田化学 （株） 製品） 、 フユニル酢酸ジナトリ ゥム又は力ルバミル燐酸ジナトリゥム 12g/dlを lOOmM酢酸ナトリゥムバッファー (pH4. 0) に溶解し、 これに上記の菌体を乾燥菌体重量で 200mg/dlとなるように 添加し、 pHを 4. 0に維持しながら、 35aCで 32時間反応させた。 生成した 5 ' —イノ シン酸の量を表 1 4に示した。 いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく 5 ' 一イノシン酸が生成蓄積したが、 ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合に最 も 5 ' —イノシン酸の蓄積量が高かった。 表 1 4 燐酸供与体 生成 5 ' 一イノシン酸 （g/dl) トリポリ燐酸ナトリウム 5. 96
ポリ燐酸ナトリウム 8. 84
フエニル酢酸ジナトリウム 7. 60
力ルバミル燐酸ジナトリウム 7. 73
実施例 2 3 プロビデンシァ •スチュアルティ染色体からの 酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする遺伝子の単離と塩基配列の確認 既知のプロビデンシァ ·スチユアルティの酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基 配列 （EMBL Accession number X64820) を基に、 該酸性フォスファターゼ遺伝子 を増幅するようにデザインした配列表配列番号 1 5及び 1 6に示す配列を有する P C R用オリゴヌクレオチドプライマ一 PRP1及び PRP2を合成した。
プロビデンシァ ·スチユアルティ ATCC 29851の培養菌体から、 Murry and Tho mpsonの方法 (Nucl. Acid Res.， 4321, 8， (1980 )) に従い染色体 D N Aを調製し た。 鍀型としてこの染色体 D N A 0. lng、 プライマーとして PRP1及び PRP2オリゴ ヌクレオチド各 2. 5 mol並びにタック D N Aポリメラーゼ （宝酒造社製） 2. 5ュニ ッ トを dATP、 dCTP、 dG;TP、 dTTP各 200 M、 塩化カリウム 50ΙΏΜ及び塩化マグネシゥ ム 1. 5mMを含.む l OOniMトリス—塩酸緩衝液 （pH8. 3) 100 1に添加し、 94 °Cを 30秒、 55 °Cを 2分、 72 °Cを 3分のサイクルを 30回繰り返す P C R反応を行った。 反応液 をァガロース電気泳動に供し、 増幅された約 l kbpの D N A断片をグラスパウダー (宝酒造社製） を用いて回収した。 この遺伝子断片を _S_^mH Iで切断後、 H Iで切断した pUC118に結合した。 このプラスミ ドを pPRPlOOと命名した。 pPRPl OOを導入したエシュリヒア · コリ JM109/PPRP100の燐酸エステル加水分解 活性及び燐酸転移活性を測定した。 その結果、 本菌は燐酸エステル加水分解活性 だけでなく、 ヌクレオシドへの燐酸転移活性も示した。
ェシヱリヒア * コリ JM109/PPRP100よりアルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調 製し、 塩基配列の決定を行った。 決定したオープン · リーディング'フレームの 塩基配列及びこの塩基配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番 号 1 7及び配列番号 1 8に示した。 本オープン · リーディング ' フレームの塩基 配列は既知のプロビデンシァ ·スチユアルティの酸性フォスファターゼ遺伝子の 塩基配列と完全に一致した。 実施例 2 4 ェンテロパクター 'ァエロゲネス、 クレブシエラ ·プランティコラ 及びセラチア ·フイカリァの染色体からの酸性フォスファタ一ゼをコ一ドする 遺伝子の単離と塩基配列の決定 ェンテロパクター ·ァエロゲネス IF0 12010、 クレブシエラ ·プランティコラ IF0 14939及びセラチア ' フイカリア IAM 13540の培養菌体から Murry and Thomp sonの方法 （Nucl. Acid Res. , 4321, 8， (1980 )) に従い、 それぞれの染色体 D N Aを調製した。 ついで、 実施例 7 ( 2 ) と同様の方法により、 約 20, 000株のェシ ユリヒア · コリ JM109の形質転換体よりなる染色体遺伝子発現ライブラリーをそ れぞれ作成し、 探索した結果、 燐酸転移活性を示す形質転換体を得ることができ た。 これらの形質転換体はそれぞれの菌株由来の酸性フォスファタ一ゼ遺伝子を 保有すると考えられた。
ェンテロパクター .ァエロゲネス IF012010由来の酸性フォスファターゼ遺伝 子を保有すると考えられるェシヱリヒア ' コリ JM109形質転換体の 1株よりアル 力リ溶菌法 (こよりプラスミ ドを調製し、'挿入された DN A断片の解析を行った。 このプラスミ ドを ρΕΝΡΙΟΟと命名した。 決定したェンテロパクター ·ァエロゲネス IF0 12010由来の挿入 DNA断片の制限酵素地図を図 9に示す。
サブクローニングにより、 酸性フォスファタ一ゼ遺伝子領域を限定した結果、 制限酵素 S a 1 I と制限酵素 J1_&J Iで切り出される 1.6kbpの断片中に本酸性フ ォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。 そこで塩基配列の決定のた めにこの S a 1 I -Kp n I断片を S a 1 I及び K p n Iで切断した pUC118に結 合したプラスミ ド DN Aを構築した。 このプラスミ ドを ρΕΝΡΙΙΟと命名した。 同様に、 クレブシエラ 'プランティコラ IF014939由来の酸性フォスファタ一 ゼ遺伝子断片を保有すると考えられるェシエリヒア ·コリ JM109形質転換体の 1 株よりアルカリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 挿入された DNA断片の解析 を行った。 このプラスミ ドを pKLPlOOと命名した。 決定したクレブシエラ ·プラン ティコラ IF014939由来の挿入 DNA断片の制限酵素地図を図 10に示す。
サブクローニングにより、 酸性フォスファタ一ゼ遺伝子領域を限定した結果、 制限酵素 Kp n Iと制限酵素 E c oR Iで切り出される 2.2kbpの断片中に本酸性 フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。 そこで塩基配列の決定の ためにこの KP n I - E c o R I断片を Kp n Iと E c o R Iで切断した pUC118 に結合したプラスミ ド DNAを構築した。 このプラスミ ドを pKLPllOと命名した また、 セラチア 'フイカリア IAM 13540由来の酸性フォスファターゼ遺伝子断 片を保有すると考えられるェシヱリヒア ' コリ JM109形質転換体の 1株よりアル カリ溶菌法によりプラスミ ドを調製し、 挿入された DN A断片の解析を行った。 このプラスミ ドを SEPlOOと命名した。 決定したセラチア ·フイカリア IAM 1354 0由来の挿入 DN A断片の制限酵素地図を図 11に示す。
サブクローニングにより、 酸性フォスファターゼ遺伝子領域を限定した結果、 制限酵素 H i ndlllで切り出される 1.4kbpの断片中に本酸性フォスファターゼ遺 伝子が含まれることが示唆された。 そこで塩基配列の決定のためにこの iiljldl I I断片を H i n dl llで切断した pUC118に結合したプラスミ ド D N Aを構築した。 このプラスミ ドを pSEPl lOと命名した。
pENP110、 pKLPl lO及び pSEPll Oをそれぞれ導入したェシヱリヒア · コリ JM109/ pENP110、 ェ、 /ヱリヒア ' コリ JM109/pK'LP110及びェシヱリヒア ' コリ JM109/pS EP110の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりそれぞれのプラスミ ドを調製し、 実 施例 8の方法に従い、 挿入断片の塩基配列の決定を行った。 決定したそれぞれの 挿入断片のオープン · リーディング' フレームの塩基配列のうちェンテロバクタ 一 .ァエロゲネス IF0 12010由来のものを配列表配列番号 1 9に、 クレブシエラ
•プランティコラ IF0 14939由来のものを配列表配列番号 2 1に、 そしてセラチ ァ * フイカリア IAM 13540由来のものを配列表配列番号 2 3に示した。 また、 各 々の推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号 2 0、 2 2、 2 4に示した。 各 D N A断片を含むプラスミ ドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示したことから、 これらのオープン · リ一ディング ·フレームは目的の酸性フォスファターゼ遺伝 子であると同定した。
塩基配列、 アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った。 用 いたデータ一ベースは E M B L及び S W I S S— P R O Tである。 その結果、 配 列表配列番号 1 9、 2 1及び 2 3に示される遺伝子はいずれも新規な遺伝子であ ることが判明した。 また、 ェンテロパクター 'ァエロゲネス IF0 12010由来の遺 伝子がコードする蛋白質は 248個、 クレブシエラ 'プランティコラ IF0 14939由来 の遺伝子がコードする蛋白質は 248個、 セラチア 'フイカリア IAM 13540由来の遺 伝子がコードする蛋白質は 244個のアミノ酸からそれぞれなるものと推定された。 なお、 これらの蛋白質は、 モルガネラ ·モルガ二及びェシヱリヒア ·ブラッタエ の酸性フォスファターゼの場合と同様、 前駆体蛋白質である可能性がある。
また、 これらの塩基配列より予想される蛋白質のァミノ酸配列を実施例 8で推 定したモルガネラ ·モルガ二 NCIMB 10466、 実施例 1 6で推定したェシヱリヒア
•ブラッタエ JCM 1650及び既知のプロビデンシァ ·スチユアルティ （EMBL Acce ssion number X64820) の酸性フォスファターゼの前駆体蛋白質のアミノ酸配列と 共にアミノ酸の一文字表記で図 1 2に示した。 図中ですベてのアミノ酸配列にお いて共通のァミノ酸残基を配列の下に *で示した。
図 1 2に示したように 6種類の菌株由来の酸性フォスファターゼのアミノ酸配 列は非常に相同性が高く、 130個のァミノ酸残基がすべてのァミノ酸配列において 共通していた。 これより、 これらの酸性フォスファターゼは非常に類似する機能 を持つことが予想される。 ' 実施例 2 5 プロビデンシァ ·スチユアルティ、 ェンテロパクター ·
ァエロゲネス、 クレブシエラ ·プランティコラ 及び セラチア ·フィカリア由来の酸性フォスファターゼ
遺伝子の発現による活性の増幅 実施例 2 3にて構築したェシヱリヒア ' コリ JM109/pPRP100、 実施例 2 4にて 構築したェシヱリ ヒア ' コリ JM109/pENP110、 ェシヱリ ヒア ' コリ JM109/pKLPl 10及びェシヱリヒア ' コリ JM109/PSEP110をアンピシリン 100 ;/ g/ml及び I P T G ImMを含む L培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間培養した。 該培養液から遠心分離に より菌体も集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。 菌体を 5 mlの lOOmM燐酸カリウムバ ッファー （PH7. 0) に懸濁し、 4 °Cで 20分間超音波処理を行い破砕した。 処理液を 遠心分離して不溶性画分を除き、 無細胞抽出液を調製した。
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、 プロビデンシァ ·スチユアルティ A TCC 29851、 ェンテロパクター · ァエロゲネス IFO 12010、 クレブシエラ ' プラン ティコラ IF0 14939、 セラチア · 7イカリア ΙΑΜ 13540及びプラスミ ド pUC118で 同様に形質転換したェシエリヒア 'コリ JM109より調製した無細胞抽出液の活性 を対照として測定した結果を表 1 5に示した。 いずれの菌も野生株の燐酸転移活 性は低かった。 また、 ェシヱリヒア ' コリ JM109/pUC118では燐酸転移活性は検出 されなかった。 一方、 酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したェシヱリヒア · コ リ JM109の形質転換体はいずれも野生株に比べて高い燐酸転移活性を示しており、 この結果から導入した遺伝子断片がェシエリヒア ' コリにおいて酸性フォスファ 夕一ゼを高発現していることが示された。 表 1 5
Figure imgf000049_0001
産業上の利用分野 本発明により、 酸性ホスファターゼを pH3. 0〜5. 5の条件下でヌクレオシド並び にポリ燐酸 （塩） 、 フエニル燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 （塩） から成る群よ り選択される燐酸供与体に作用させることにより、 安価かつ効率よくヌクレオシ ドー 5 ' —燐酸エステルを製造することができる。 特に、 本発明により提供され る燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異を有する酸性フォスファターゼを 用いることにより、 一層効率よくヌクレオシド— 5 ' —燐酸エステルを製造する ことができる。
配列表
(1 )一般情報
(i) 出願人： 味の素株式会社
(ii) 発明の名称： .ヌクレオシドー 5 燐酸エステルの製造法 (iii) 配列数： 24 - (iv) 連絡先：
(A)宛名
(B)番地
(C)市
(D)州
(E)国
(F) ZIP：
(V) コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：
(B)コンピュータ
(C)操作システム
(D)ソフ トウェア
(vi) 現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人 Z事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号：
(2) 配列番号 1の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： タンパク質
(V ) フラグメ ン ト型： N末端フラグメ ント (vi) 起源：
(A)生物名： モノレカ、、ネラ '·モルガ二 (Morganella morganii)
(B)株名： NCIMB 10466
(xi) 配列： SEQ ID N0:1:
Ala lie Pro Ala Gly Asn As Ala ThrThr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Asn Glu
20
(2) 配列番号 2の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 750 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： Genomic DNA
(vi) 起源：
Λ生物名： モノレカ不ラ · モノレガ'二 (Morganella morganii) (B)株名： NCIMB 10466
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1. - 747
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： sig_peptide
(B) 存在位置： 1..60
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： mat_p印 tide
(B) 存在位置: 61..747
(xi) 配列： SEQ ID NO: 2： ATG AAG AAG AAT ATT ATC GCC GGT TGT CTG TTC TCA CTG TTT TCC CTT 48
Met Lys Lys Asn lie l ie Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu
-20 -15 -10 -5
TCC GCG CTG GCC GCG ATCCCG GCG GGC AAC GAT GCC ACC ACC AAG CCG 96
Ser Ala Leu Ala Ala l ie Pro Ala Gly *Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
1 5 10
GAT TTA TAT TAT CTG AAA AAT GAA CAG GCT ATC GAC AGC CTG AAA CTG 144
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gin Ala He Asp Ser Leu Lys Leu
15 20 25
ΠΑ CCG CCA CCG CCG GAA GTC GGC AGT ATT CAG TTT TTA AAT GAT CAG 192
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Gin Phe Leu Asn Asp Gin
30 35 40
GCA ATG TAT GAG AAA GGC CGT ATG CTG CGC AAT ACC GAG CGC GGA AAA 240
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
45 50 55 60
CAG GCA CAG GCA GAT GCT GAC CTG GCC GCA GGG GGT GTG GCA ACC GCA 288
Gin Ala Gin Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala
65 70 75
TTT TCA GGG GCA TTC GGC TAT CCG ATA ACC GAA AAA GAC TCT CCG GAG 336
Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro l ie Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu
80 85 90
CTG TAT AAA CTG CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGT GAT CTT GCC 384
Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
95 100 105
ACC CGC TCC GCC AAA GAA CAT TAC ATG CGC ATC CGG CCG TTT GCG TTT 432
Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
110 115 120
TAC GGC ACA GAA ACC TGT AAT ACC AAA GAT CAG AAA AAA CTC TCC ACC 480
Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr
125 130 135 140 AAC GGA TCT TAC CCG TCA GGT CAT ACG TCT ATC GGC TGG GCA ACC GCA 528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
145 150 155
CTG GTG CTG GCG GAA GTG AAC CCG GCA AAT CAG GAT GCG ATT CTG GAA 576
Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala* Asn Gin Asp Ala lie Leu Glu
160 165 170
CGG GGT TAT CAG CTC GGA CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAT CAC TGG 624
Arg Gly Tyr Gin Leu Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp
175 180 185
CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG ATT GTC GGT TCA GCC GCT GTC GCG 672
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Gly Ser Ala Ala Val Ala
190 195 200
ACA TTA CAT TCC GAT CCG GCA TTT CAG GCG CAG TTA GCG AAA GCC AAA 720
Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gin Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys
205 210 215 220
CAG GAA TTT GCA CAA AAA TCA CAG AAA TAA 750
Gin Glu Phe Ala Gin Lys Ser Gin Lys
225 229
(2) 配列番号 3の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 249 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： タンパク質
(vi) 起源：
(A)生物名 ： モルガネラ ·モルガ二 (Morganella morganii )
(B)株名 ： NCIMB 10466
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 3： Met Lys Lys Asn lie l ie Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu - 20 -15 -10 -5
Ser Ala Leu Ala Ala l ie Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
1 5 10
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gin* Ala lie As Ser Leu Lys Leu
15 20 25
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Gin Phe Leu Asn Asp Gin
30 35 40
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 45 50 55 60
Gin Ala Gin Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala
65 70 75
Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro l ie Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu
80 85 90
Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met lie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
95 100 105
Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
110 115 120
Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr 125 130 135 140
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
145 150 155
Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gin Asp Ala lie Leu Glu
160 165 170
Arg Gly Tyr Gin Leu Gly Gin Ser Arg Val He Cys Gly Tyr His Trp
175 180 185
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Gly Ser Ala Ala Val Ala
190 195 200
Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gin Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys 205 210 215 220 Gin Glu Phe Ala Gin Lys Ser Gin Lys
225 229
(2) 配列番号 4の配列の情報：
(i) 配列の性質： ' ,
(A) 配列の長さ： 229 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸.
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： タンパク質
(vi) 起源：
(A)生物名 ： モルガネラ ·モルガ二 (Morganella morganii)
(B)株名 ： NCIMB 10466
(xi) 配列： SEQ ID N0:4 :
Ala lie Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Asn Glu Gin Ala lie Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro
20 25 30
Pro Glu Val Gly Ser l ie Gin Phe Leu Asn Asp Gin Ala Met Tyr Glu
35 40 45
Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gin Ala Gin Ala
50 55 60
Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala 65 70 75 80
Phe Gly Tyr Pro lie Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu
85 90 95
Leu Thr Asn Met lie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
100 105 110
Lys Glu His Tyr Met Arg l ie Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu
115 120 125 Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Ser Tyr
130 135 140
Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala 145 150 . 155 160
Glu Val Asn Pro Ala Asn Gin Asp Ala *I le Leu Glu Arg Gly Tyr Gin
165 170 175
Leu Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser Asp Val
180 185 190
Asp Ala Ala Arg lie Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser
195 200 205
Asp Pro Ala Phe Gin Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys Gin Glu Phe Ala
210 215 220
Gin Lys Ser Gin Lys
225 229
(2) 配列番号 5の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi) 配列： SEQ ID NO: 5 :
ATTACCATGA TTACGAATTC 20
(2) 配列番号 6の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi) 配歹 ij : SEQ ID NO: 6 : '
GCGGTTGCCA CATCCCCTGC G 21
(2) 配列番号 7の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 7 :
TTGCCCAGCC GGTAGACGTA T 21
(2) 配列番号 8の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配歹リの； &さ-' 15 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： タンパク質
(V) フラグメ ント型： N末端フラグメント
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： ェシヱリ ヒア 'ブラッタエ （Escherichia blattae)
(B)株名 ： JCM 1650
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 8：
Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu
1 5 10 15 (2) 配列番号 9の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ.： 750 bases
(B) 配列の型： 核酸 ·
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA
(vi) 起源:
(A)生物名： ェシヱリヒア ·ブラッタエ （Escherichia blattae)
(B)株名： J CM 1650
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1. . 747
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： sig_peptide
(B) 存在位置： 1. . 54
(ix) 配列の特徵：
(A) 特徴を表す記号： mat_p印 tide
(B) 存在位置： 55. . 747
(xi) 配列： SEQ ID NO: 9：
ATG AAA AAA CGT GTT CTG GCA GTT TGT TTT GCC GCA TTG TTC TCT TCT 48
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser
-18 -15 -10 -5
CAG GCC GTG GCG CTG GTC GCT ACC GGC AAC GAC ACT ACC ACG AAA CCG 96
Gin Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro
1 5 10
GAT CTC TAC TAC CTC AAG AAC AGT GAA GCC ATT AAC AGC CTG GCG CTG 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala lie Asn Ser Leu Ala Leu
15 20 25 30 TTG CCG CCA CCA CCG GCG GTG GGC TCC ATT GCG TTT CTC AAC GAT CAG 192 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser l ie Ala Phe Leu Asn As Gin
35 40 45
GCC ATG TAT GAA CAG GGG CGC CTG CTG CGC AAC ACC GAA CGC GGT AAG 240 Ala Met Tyr Glu Gin Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
50 55 60
CTG GCG GCG GAA GAT GCA AAC CTG AGC AGT GGC GGG GTG GCG AAT GCT 288 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala
65 70 75
TTC TCC GGC GCG TTT GGT AGC CCG ATC ACC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336 Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro l ie Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala
80 85 90
CTG CAT AAA TTA CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAC GCC GGG GAT CTG GCG 384 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met He Glu Asp Ala Gly As Leu Ala
95 100 105 110
ACC CGC AGC GCG AAA GAT CAC TAT ATG CGC ATT CGT CCG TTC GCG TTT 432 Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
115 120 125
TAT GGG GTC TCT ACC TGT AAT ACC ACC GAG CAG GAC AAA CTG TCC AAA 480 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys
130 135 140
AAT GGC TCT TAT CCG TCC GGG CAT ACC TCT ATC GGC TGG GCT ACT GCG 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
145 150 155
CTG GTG CTG GCA GAG ATC AAC CCT CAG CGC CAG AAC GAG ATC CTG AAA 576 Leu Val Leu Ala Glu l ie Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu He Leu Lys
160 165 170
CGC GGT TAT GAG CTG GGC CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAC CAC TGG 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val l ie Cys Gly Tyr His Trp
175 180 185 190 CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG GTA GTG GGA TCT GCC GTT GTG GCG 672 Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala
• 195 200 205
ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCG TTC CAG CAG CAG TTG CAG AAA GCG AAG 720 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
210 215 220
GCC GAA TTC GCC CAG CAT CAG AAG AAA TAA 750 Ala Glu Phe Ala Gin His Gin Lys Lys
225 230
(2) 配列番号 10の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 249 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： タンパク質
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： ェシヱリヒア ·ブラッタエ （Escherichia blattae)
(B)株名 ： J CM 1650
(xi) 配列： SEQ ID NO: 10：
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser
-18 -15 -10 -5
Gin Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro
1 5 10
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala lie Asn Ser Leu Ala Leu
15 20 25 30
Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser l ie Ala Phe Leu Asn As Gin
35 40 45
Ala Met Tyr Gl u Gin Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala
65 70 75
Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro l ie Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala
80 85 90
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 95 100 105 110
Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
115 120 125
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys
130 135 140
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
145 150 155
Leu Val Leu Ala Glu l ie Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu lie Leu Lys
160 165 170
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp 175 180 185 190
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala
195 200 205
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
210 215 220
Ala Glu Phe Ala Gin His Gin Lys Lys
225 230
• (2) 配列番号 11の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 231 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： タンパク質
(vi ) 起源： (A)生物名 ： ェシヱリヒア 'ブラッタエ （Escherichia blattae)
(B)株名 ： JCM 1650
(xi) 配列： SEQ ID NO: 11 :
Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu
1 5 - 10 15
Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala l ie Asn Ser Leu Ala Leu Leu Pro
20 25 30
Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser lie Ala Phe Leu Asn Asp Gin Ala Met
35 40 45
Tyr Glu Gin Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala
50 55 60
Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala Phe Ser 65 70 75 80
Gly Ala Phe Gly Ser Pro lie Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala Leu His
85 90 95
Lys Leu Leu Thr Asn Met lie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg
100 105 110
Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg l ie Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly
115 120 125
Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys Asn Gly
130 135 140
Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser l ie Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val 145 150 155 160
Leu Ala Glu lie Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu lie Leu Lys Arg Gly
165 170 175
Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val l ie Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser
180 185 190
Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala Thr Leu
195 200 205 PC 6 01
- 61 -
His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys Ala Glu
210 215 220
Phe Ala Gin His Gin Lys Lys
225 230
(2) 配列番号 12の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi) 配列： SEQ ID NO: 12:
CCTCGAGGTC GACGGTATCG 20
(2) 配列番号 13の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi) 配列： SEQ ID NO: 13:
ATTCGCCACA TCGCCACTGC T 21
(2) 配列番号 14の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 22 bases PC 96/014
- 62 -
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： ·
(xi) 配列： SEQ ID NO: 14:
TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG 22
(2) 配列番号 15の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 25 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数'. 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi) 配列： SEQ ID NO: 15:
CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT 25
(2) 配列番号 16の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 25 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス：
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 16:
CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA 25 (2) 配列番号 17の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 747 bases
(B) 配列の型： 核酸 ·
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： Genomic DNA
(vi) 起源：
(A)生物名 ： プロビデンシァ ·スチユアルティ
(B)株名 ： ATCC 29851
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置: 1. . 744
(xi) 配列： SEQ ID NO: 17:
ATG AAA AAA CTA TTA GCA GTA TTC TGC GCA GGG GCT TTT GTT TCA ACC 48 Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr
1 5 10 15
AGT GTA TTT GCG GCG ATC CCT CCC GGC AAT GAT GTG ACA ACT AAA CCC 96 Ser Val Phe Ala Ala lie Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro
20 25 30
GAT CTT TAT TAT TTA AAA AAC TCA CAG GCT ATT GAT AGT TTA GCG TTA 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gin Ala lie Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
TTG CCG CCA CCA CCT GAA GTG GGC AGT ATC TTA TTT TTA AAC GAC CM 192 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser lie Leu Phe Leu Asn Asp Gin
50 55 60
GCG ATG TAT GAA AAA GGC CGT ΠΑ TTG CGA AAT ACT GAG CGT GGA GAA 240 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu
65 70 75 80 CAA GCC GCT AAG GAT GCT GAT CTG GCT GCG GGC GGT GTT GCG AAC GCA 288 Gin Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
85 90 95
TTT TCT GAA GCT TTT GGT TAT CCC ATT ACC GAA AAG GAT GCG CCT GAA 336 Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro l ie -Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu
100 105 110
ATT CAT AAA TTG CTG ACG AAT ATG ATT GAA GAT GCG GGG GAT TTA GCA 384 lie His Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
115 120 125
ACT CGC TCA GCC AAA GAG AAA TAC ATG CGC ATT CGT CCA TTT GCG TTC 432 Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140
TAC GGT GTT GCT ACC TGT AAC ACG AAA GAT CAG GAC AAA TTA TCT AAG 480 Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Asp Lys Leu Ser Lys
145 150 155 160
AAT GGC TCT TAT CCT TCT GGA CAC ACC GCA ATT GGC TGG GCA TCT GCA 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala lie Gly Trp Ala Ser Ala
165 170 175
CTC GTA TTG TCA GAA ATT AAC CCA GAA AAC CAA GAT AAA ATT TTA AAA 576 Leu Val Leu Ser Glu lie Asn Pro Glu Asn Gin Asp Lys lie Leu Lys
180 185 190
CGT GGT TAT GAA CTT GGC CAA AGC CGA GTC ATC TGT GGT TAC CAT TGG 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp
195 200 205
CAA AGT GAT GTT GAT GCA GCT CGT ATC GTT GCA TCG GGT GCG GTA GCA 672 Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg lie Val Ala Ser Gly Ala Val Ala
210 215 220
ACT Α CAC TCC AAC CCT GAA TTC CAA AAA CAG TTA CAA AAA GCC AAA 720 Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gin Lys Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225 230 235 240 GAC GAA TTT GCT AAA CTG AAA AAA TAG 747 Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys
245
(2) 配列番号 18の配列の情報： 、
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 248 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸 , (D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： タンパク質
(vi) 起源：
(A)生物名 ：プロビデンシァ ·スチユアルティ
(B)株名 ： ATCC 29851
(xi) 配列： SEQ ID NO: 18：
Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr
1 5 10 15
Ser Val Phe Ala Ala l ie Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro
20 25 30
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gin Ala lie Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Leu Phe Leu Asn Asp Gin
50 55 60
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu
65 70 75 80
Gin Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
85 90 95
Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro l ie Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu
100 105 110
lie His Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
115 120 125 Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140
Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala lie Gly Trp Ala Ser Ala
165 170 175
Leu Val Leu "Ser Glu l ie Asn Pro Glu Asn Gin Asp Lys lie Leu Lys
180 185 190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp
195 200 205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Ala Ser Gly Ala Val Ala
210 215 220
Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gin Lys Gin Leu Gin Lys Ala Lys 225 230 235 240
Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys
245
(2) 配列番号 19の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 747 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： ェンテロバクタ- ァェロケネス
(B)株名 ： IFO 12010
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1. . 744 (xi ) 配列： SEQ ID NO: 19 :
ATG AAA AAG CGC GTT CTC GCC CTC TGC CTC GCC AGC CTG TTT TCC GTT 48
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val
1 5 . 10 15
AAC GCT TTC GCG CTG GTC CCT GCC GGC AAT GAT GCA ACC ACC AAA CCG 96
Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
20 25 30
GAT CTC TAT TAT CTG AAA AAT GCA CAG GCC ATC GAT AGT CTG GCG CTG 144
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala lie Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
TTG CCG CCG CCG CCG GAA GTT GGC AGC ATC GCA TTT TTA AAC GAT CAG 192
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Ala Phe Leu Asn Asp Gin
50 55 60
GCG ATG TAT GAG AAA GGA CGG CTG TTG CGC AAT ACC GAA CGT GGC AAG 240
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
65 70 75 80
CTG GCG GCT GAA GAT GCT AAC CTG AGC GCC GGC GGC GTC GCG AAT GCC 288
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
85 90 95
TTC TCC AGC GCT TTT GGT TCG CCC ATC ACC GAA AAA GAC GCG CCG CAG 336
Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro l ie Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gin
100 105 110
TTA CAT AAG CTG CTG ACA AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGC GAT CTG GCC 384
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu Asp Ala Gly As Leu Ala
115 120 125
ACC CGC AGC GCG AAA GAG AAA TAT ATG CGC ATT CGC CCG TTT GCG TTC 432
Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140
TAC GGC GH TCA ACC TGT AAC ACT ACC GAG CAG GAC AAG CTG TCG AAA 480
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys 6/01402
- 68 -
145 150 155 160
AAC GGA TCT TAC CCT TCC GGC CAT ACC TCT ATC GGT TGG GCA ACC GCG 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
165 170 175
CTG GTA CTG GCG GAG ATC AAT CCG CAG CGG CAA AAC GAA ATT CTC AAA 576 Leu Val Leu Ala Glu He Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu lie Leu Lys
180 185 190
CGC GGC TAT GAA TTG GGC GAA AGC CGG GTT ATC TGC GGC TAT CAT TGG 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp
195 200 205
CAG AGC GAT GTC GAT GCG GCG CGG ATA GTC GGC TCG GCG GTG GTG GCG 672 Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210 215 220
ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCC TTC CAA CAG CAG TTG CAG AAA GCA AAG 720 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225 230 235 240
GAT GAA TTC GCC AAA ACG CAG AAG TAA 747 Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gin Lys
245
(2) 配列番号 20の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 248 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 夕ンパク質
(vi) 起源：
(A)生物名 ： ェンテロバクタ一 ·ァエロゲネス
(B)株名 ： IFO 12010
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 20： Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val
1 5 10 15
Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn As Ala Thr Thr Lys Pro
20 25 30
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala lie Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Ala Phe Leu Asn As Gin
50 55 60
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 65 70 75 80
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
85 90 95
Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro He Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gin
100 105 110
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met lie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
115 120 125
Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg He Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser He Gly Trp Ala Thr Ala
165 170 175
Leu Val Leu Ala Glu l ie Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu lie Leu Lys
180 185 190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val He Cys Gly Tyr His Trp
195 200 205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210 215 220
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys 225 230 235 240 Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gin Lys
245
(2 ) 配列番号 21の配^の情報：
(i ) 2列の性質： *
(A) 配列の長さ： 747 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi) 起源：
(A)生物名 ： クレブジエラ ·プランティコラ
(B)株名 ： IF0 14939
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1. . 744
(xi ) 配列： SEQ ID N0-.21 :
ATG AAA AAG CGT GTA CTC GCC CTT TGC CTT GCC AGC CTC TTT TCA GTT 48 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val
1 5 10 15
AGC GCC TTT GCG CTG GTT CCC GCC GGC AAT GAT GCC ACC ACC AAG CCC 96 Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
20 25 30
GAT CTC TAC TAT CTG AAA AAT GCC CAG GCC ATT GAC AGC CTG GCG CTG 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala lie Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
TTG CCA CCG CCG CCG GAA GTG GGC AGC ΑΠ GCG TTT TTA AAC GAT CAG 192 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Ala Phe Leu Asn Asp Gin
50 55 60 GCG ATG TAT GAG AAA GGC CGT CTG CTG CGC GCC ACC GCC CGC GGC AAG 240
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys
65 70 75 80
HG GCG GCA GAA GAT GCC AAC CTG AGC GCG GGT GGC GTG GCC AAC GCC 288
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
85 90 95
TTC TCC GCA GCA TTC GGC TCC CCG ATC AGC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336
Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro l ie Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala
100 105 110
CTG CAC AAA CTG CTC ACC AAC ATG ATT GAA GAC GCG GGC GAT CTG GCG 384
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
115 120 125
ACC CGA GGC GCG AAA GAG AAG TAT ATG CGT ATT CGT CCG TTT GCC TTC 432
Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140
TAC GGC GTG TCC ACC TGC AAT ACC ACC GAA CAG GAT AAG CTG TCG AAA 480
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys
145 150 155 160
AAC GGC TCC TAC CCT TCC GGA CAC ACC TCT ATC GGC TGG GCG ACC GCC 528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
165 170 175
CTG GTG CTG GCC GAA ATC AAC CCG CAG CGC CAG AAT GAG ATT CTC AAG 576
Leu Val Leu Ala Glu l ie Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu lie Leu Lys
180 185 190
CGC GGC TAT GAG CTC GGT GAA AGT CGG GTG ATC TGC GGT TAC CAC TGG 624
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp
195 200 205
CAG AGC GAT GTT GAC GCC GCG CGG ΑΠ GTC GGC TCG GCG GTG GTT GCA 672
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210 215 220 ACC CTG CAT ACC AAT CCG GCC TTC CAG CAG CAG CTG CAA AAA GCC AAA 720 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225 230 235 240
GAC GAG TTT GCG AAA CAG CAG AAA TAG 747 Asp Glu Phe Ala Lys Gin Gin Lys *
245
(2) 配列番号 22の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 248 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： タンパク質
(vi) 起源：
(A)生物名 ： クレブジエラ ·プランティコラ
(B)株名 ： IFO 14939
(xi) 配列： SEQ ID NO: 22:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val
1 5 10 15
Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
20 25 30
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala lie Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser l ie Ala Phe Leu Asn Asp Gin
50 55 60
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys
65 70 75 80
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala
85 90 95 1
- 73 -
Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro l ie Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala
100 105 110
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met l ie Glu As Ala Gly As Leu Ala
115 120 125
Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lie Gly Trp Ala Thr Ala
165 170 175
Leu Val Leu Ala Glu l ie Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu lie Leu Lys
180 185 190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp
195 200 205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg l ie Val Gly Ser Ala Val Val Ala
210 215 220
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225 230 235 240
Asp Glu Phe Ala Lys Gin Gin Lys
245
(2) 配列番号 23の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 735 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： ニ本鎮
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源： (A)生物名：セラチア ·フイカリア
(B)株名： IAM 13540
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1. . 732 ^
Cxi ) 配列： SEQ ID NO: 23:
ATG AAA AAA ATA TTA TTA GCC ACA TTA AGC TGC GCC GCG TTG ACG CAG 48 Met Lys Lys lie Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin
1 5 10 15
TTT TCC TTT GCC GCC AAA GAT GTC ACT ACC CAC CCT GAG GTT TAT ΤΠ 96 Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe
20 25 30
CTG CAA GAA TCA CAG TCC ATC GAC AGC CTG GCA CTA TTG CCG CCG CCG 144 Leu Gin Glu Ser Gin Ser He As Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro
35 40 45
CCG GCG ATG GAC AGC ATT GAT TTC CTG AAT GAC AAA GCG CAA TAC GAC 192 Pro Ala Met Asp Ser l ie Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala irln Tyr Asp
50 55 60
GCC GGG AAA ATA GTG CGC AAT ACT CCG CGT GGC AAG CAG GCT TAT GAT 240 Ala Gly Lys lie Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gin Ala Tyr Asp
65 70 75 80
GAC GCC CAC GTT GCC GGG GAC GGC Gn GCC GCC GCA TTT TCC AAC GCC 288 Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala
85 90 95
TTC GGC CTA GAA ATA GCC CAA CGG AAA ACG CCG GAG CTG TTT AAG CTG 336 Phe Gly Leu Glu lie Ala Gin Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu
100 105 110
GTG ATG AAA ATG CGT GAA GAC GCC GGC GAT TTG GCG ACC CGC AGC GCC 384 Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
115 120 125 AAA AAT CAC TAT ATG CGC ATT CGC CCC TTT GCG TTT TAT AAC GAA GCG 432 Lys Asn His Tyr Met Arg He Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala
130 135 140
ACC TGC CGA CCG GAC GAA GAA AGC ACC CTG TCG AAG AAC GGT TCT TAC 480 Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr
145 150 155 160
CCT TCC GGC CAT ACC ACC ATC GGC TGG GCG ACC GCG CTG GTG CTG GCT 528 Pro Ser Gly His Thr Thr lie Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
165 170 175
GAA ATC AAC CCC GCC AGG CAG GGT GAA ATC CTG CAG CGC GGC TAT GAT 576 Glu lie Asn Pro Ala Arg Gin Gly Glu l ie Leu Gin Arg Gly Tyr Asp
180 185 190
ATG GGC CAA AGC CGG GTT ATC TGC GGT TAT CAC TGG CAA AGC GAC GTG 624 Met Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser Asp Val
195 200 205
ACT GCG GCG CGC ATG GCG GCG TCG GCC ATG GTG GCG CGT TTG CAT GCC 672 Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala
210 215 220
GAA CCC ACC TTC GCC GCC CAG CTG CAA AAG GCC AAA GAC GAA TTC AAC 720 Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gin Leu Gin Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn
225 230 235 240
GGC CTG AAA AAG TAA 735 Gly Leu Lys Lys
(2) 配列番号 24の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 244 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 夕ンパク質 (vi) 起源：
(A)生物名：セラチア 'フイカリア
(B)株名： IAM 13540
(xi) 配列： SEQ ID NO: 24:
Met Lys Lys lie Leu Leu Ala Thr Lea Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin
1 5 10 15
Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe
20 25 30
Leu Gin Glu Ser Gin Ser lie Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Ala Met Asp Ser l ie As Phe Leu Asn As Lys Ala Gin Tyr Asp
50 55 60
Ala Gly Lys lie Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gin Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala
85 90 95
Phe Gly Leu Glu lie Ala Gin Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu
100 105 110
Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
115 120 125
Lys Asn His Tyr Met Arg lie Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala
130 135 140
Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr 145 150 155 160
Pro Ser Gly His Thr Thr lie Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
165 170 175
Glu lie Asn Pro Ala Arg Gin Gly Glu l ie Leu Gin Arg Gly Tyr Asp
180 185 190
Met Gly Gin Ser Arg Val lie Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser Asp Val
195 200 205
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一 II 一
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Claims

請求の範囲
1 . 性フォスファターゼを pH3. 0〜5. 5の条件下でヌクレオシド並びにポリ 燐酸 （塩） 、 フエニノ.レ燐酸 （塩） 及び力ルバミル燐酸 （塩） から成る群より選択 される燐酸供与体に作用させてヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルを生成せしめ、 これを採取することを特徴とするヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製造法。
2 . 酸性フォスファターゼが燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異を 有する請求項 1記載のヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製造法。
3 . 酸性フォスファターゼが、 配列表配列番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2 もしくは 2 4に示されるアミノ酸配列又はこれらのァミノ酸配列のいずれかと実 質的に相同であるアミノ酸配列を含む請求項 1記載のヌクレオシドー 5 ' —燐酸 エステルの製造法。
4 . 酸性フォスファターゼが、 配列表配列番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2 又は 2 4に示されるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、 か つ、 配列表配列番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2又は 2 4に示されるアミノ酸配 列を含む酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異を 有する変異型酸性フォスファターゼである請求項 2記載のヌクレオシド— 5 ' — 燐酸エステルの製造法。
5 . 前記変異が、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 7 2番 目のグリシン残基及び/又は 1 5 1番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基 への置換に相当するアミノ酸の置換である請求項 4記載のヌクレオシドー 5 ' — 燐酸エステルの製造法。
6 . 前記変異が、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列においては 7 2 番目のグリシン残基及びノ又は 1 5 1番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残 基への置換、 配列表配列番号 1 1に示すァミノ酸配列においては 7 4番目のグリ シン残基及び Z又は 1 5 3番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基への置換、 配列表配列番号 1 8、 2 0又は 2 2に示すアミノ酸配列においては 9 2番目のグ リシン残基及び Z又は 1 7 1番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基への置 換、 配列表配列番号 2 4に示すァミノ酸配列においては 8 8番目のグリシン残基 及び/又は 1 6 7番目のィソロイシン残基の他のァミノ酸残基の置換である請求 項 5記載のヌクレオシドー 5 ' —燐酸エステルの製造法。
7 . 配列表配列番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2又は 2 4に示されるァミノ 酸配列のいずれかと実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、 かつ、 配列表配列 番号 4、 1 1、 1 8、 2 0、 2 2又ば 2 4に示されるアミノ酸配列を含む酸性フ ォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性を低下させる変異を有する変異型酸 性フォスファターゼ。
8 . 前記変異が、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 7 2番 目のグリシン残基及び/又は 1 5 1番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基 への置換に相当するァミノ酸の置換である請求項 7記載の変異型酸性フォスファ ターゼ。
9 . 前記変異が、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列においては 7 2 番目のグリシン残基及び Z又は 1 5 1番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残 基への置換、 配列表配列番号 1 1に示すアミノ酸配列においては 7 4番目のグリ シン残基及び Z又は 1 5 3番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基への置換、 配列表配列番号 1 8、 2 0又は 2 2に示すアミノ酸配列においては 9 2番目のグ リシン残基及び/又は 1 7 1番目のイソロイシン残基の他のァミノ酸残基への置 換、 配列表配列番号 2 4に示すァミノ酸配列においては 8 8番目のグリシン残基 及びノ又は 1 6 7番目のィソロイシン残基の他のァミノ酸残基の置換である請求 項 8記載の変異型酸性フォスファターゼ。
1 0 . 配列表配列番号 1 1、 2 0、 2 2及び 2 4に示されるアミノ酸配列のい ずれかを含む酸性フォスファターゼ。
1 1 . 請求項 7〜1 0のいずれか一項に記載の酸性フォスファタ一ゼをコ一ド する遺伝子。
1 2 . 請求項 1 1に記載の遺伝子を含む組換え D N A。
1 3 . 請求項 1 2に記載の組換え D N Aを保有する微生物。
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