JP6088176B2 - アスコルビン酸リン酸化酵素改変体 - Google Patents
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項1.以下の(A)〜(C)のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基の1個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(C)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が30%以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
項2.更に、配列番号1で示されるアミノ酸配列において、116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列を有する、項1に記載の酵素改変体。
項3.項1又は2に記載の酵素改変体をコードする単離されたDNA。
項4.項3に記載のDNAを含むベクター。
項5.項4に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる、形質転換体。
項6.以下の(A)〜(C)のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させ、アスコルビン酸−2−リン酸を製造する方法:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基の1個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(C)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が30%以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
項7.前記リン酸基供与体がポリリン酸である、項6に記載の方法。
A=Ala=アラニン、C=Cys=システイン、
D=Asp=アスパラギン酸、E=Glu=グルタミン酸、
F=Phe=フェニルアラニン、G=Gly=グリシン、
H=His=ヒスチジン、I=Ile=イソロイシン、
K=Lys=リシン、L=Leu=ロイシン、
M=Met=メチオニン、N=Asn=アスパラギン、
P=Pro=プロリン、Q=Gln=グルタミン、
R=Arg=アルギニン、S=Ser=セリン、
T=Thr=トレオニン、V=Val=バリン、
W=Trp=トリプトファン、Y=Tyr=チロシン
本発明のアスコルビン酸リン酸化酵素改変体は、以下の(A)〜(C)のいずれかに示す特徴を有するものである:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基の1個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(C)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が30%以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
本発明は前記リン酸化酵素改変体をコードする単離されたDNAを提供する。本発明の酵素改変体をコードするDNAは、後述する方法に従って導入される宿主細胞内において、本発明の酵素改変体を発現し得るものであれば如何なるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。
本発明は、更に、前記DNAを宿主細胞内に導入して発現させるために用いられる、前記DNAを含むベクターを提供する。このようなベクターとしては、適切な宿主細胞内で該DNAがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
本発明は、前記DNAを含むベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を提供する。宿主細胞としては、前述の本発明の酵素改変体をコードするDNAを含む発現ベクターにより形質転換され、当該DNAによりコードされた酵素改変体を発現することができる細胞であれば、特に制限はされない。
本発明は、前述される本発明の酵素改変体を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させ、アスコルビン酸−2−リン酸を製造する方法を提供する。本発明のAsA2Pを製造する方法においては、アスコルビン酸、リン酸基供与体及び酵素改変体を溶媒に添加して反応液組成物を調製し、酵素反応を行うことができる。あるいは、本発明の酵素改変体の産生能を有する微生物の培養物を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させることによりアスコルビン酸−2−リン酸を製造してもよい。
アスコルビン酸リン酸化酵素改変体の調製
アスコルビン酸リン酸化酵素への変異の導入は、下表1に示されるプライマーセットを使用して、アスコルビン酸リン酸化酵素のN末端側をコードする領域とC末端側をコードする領域の2か所をそれぞれ増幅した。この時、使用したプライマーに、目的の箇所にアミノ酸置換が生じるように変異が導入されているため、得られるPCR産物には目的の箇所に各変異が導入されている。得られたPCR産物をベクターに挿入して形質転換体を作製し、当該形質転換体により各アスコルビン酸リン酸化酵素改変体を作製した。
A115R/H116Q酵素改変体(改変体3)の作製方法を例に変異の導入及び形質転換体の作製について以下に記載する。
Sphingomonas trueperi (JCM10278)からゲノムDNAを調製し、特開平4−53494号公報に記されるアスコルビン酸リン酸化酵素遺伝子をPCRにより増幅した。PCRに用いたプライマーセットは、プライマー1(フォワードプライマー)及びプライマー6(リバースプライマー)、ならびにプライマー3(フォワードプライマー)及びプライマー2(リバースプライマー)である。得られたPCR産物を制限酵素(NcoI及びNheI、又はNheI及びXhoI)で消化し、NcoI及びXhoIで制限酵素処理したpET22b(+)ベクター(Novagen)との三者ライゲーションによりこれらを連結して、アスコルビン酸リン酸化酵素発現用ベクターを得た。なお、該ベクターには、配列番号1で示されるアミノ酸配列が挿入されており、更にT7プロモーター、産生されるタンパク質をペリプラズムに移行するためのpelBシグナル、タンパク質精製のためのHisタグ遺伝子、及び薬剤選択のためのアンピシリン耐性遺伝子が保持されている。ベクターに挿入された塩基配列と対応するアミノ酸配列を図2に示す。
アスコルビン酸リン酸化酵素発現用ベクターを有する大腸菌BL21(DE3)株の形質転換体の培養は、0.2重量%グルコース、0.5重量%カザミノ酸、0.1mg/mlアンピシリンを含むLB培地(ナカライテスク(株)製:(組成)1重量%トリプトン;0.5重量%乾燥酵母エキス;0.5重量%塩化ナトリウム)中で、培養温度27℃にてインキュベートした。培養液の600nmにおける光学密度が0.5になったら、0.1mMとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、更に培養温度27℃で16〜24時間、培養を行った。
アフィニティー精製の条件は次の通りである。
カラム:His−Trap HP(GE healthcare製)
平衡化緩衝液:20mM トリス−HCl(pH7.5)、50mM塩化ナトリウム
溶出緩衝液:20mM トリス−HCl(pH7.5)、50mM塩化ナトリウム、1M イミダゾール
(溶出緩衝液を0−50%のグラジエントで溶出)
流速:5.0ml/min
精製機器:AKTA prime plus(GE healthcare)
後述する試験例及び比較例において採用されたHPLC解析条件は次の通りである。
カラム:YMC−Pack ODS−A(150×4.6mm)(YMC社製)
溶離液:
酢酸緩衝溶液(80mM,pH5.0)/メタノール=98/2(体積比)
(2.8mMヘキシルアミン及び0.1mM EDTAを含有する)
検出波長:254nm
流速:0.8ml/min
カラム温度:35℃
注入量:10μl
HPLC機器:日立HPLC LaChrom Elite seri L−2000
アスコルビン酸(300mM)、リン酸基供与体としてポリリン酸(2重量%)(商品名:ポリリン酸、ナカライテスク社製)、及びTriton X−100(1重量%)を含む超純水(NaOHでpH4.5に調整)に、上記表1において改変体1〜8として示されるアミノ酸変異が導入されたアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体を各15μg/mlとなるよう添加し、37℃の恒温エアーインキュベーター内で一晩反応させた。その後、反応液をHPLCに使用される溶離液(酢酸緩衝溶液)で100倍に希釈し、HPLC解析に供して生成されたAsA2Pの量を測定した。結果を図4に示す。
改変体7及び改変体8として示されるアミノ酸変異が導入されたアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体について、産生されたAsA2P量の測定結果を図5に抜き出し比較した。図5に示されるように、改変体8(A115R/H116)を用いた場合は、前記試験例1に示される改変体3(A115R/H116Q)と同様にAsA2Pの経時的な分解が抑制されていることが示された。これに対し、改変体7(A115/H116Q)を用いた場合はAsA2Pの分解が生じ、経時的にAsA2Pの量が低下した。即ち、第115位のアミノ酸残基をアラニンからアルギニンに置換することによって反応産物の分解が抑制され、第116位のヒスチジンのグルタミンへの置換は反応生成物の分解に影響を与えないことが示された。
改変体3に更に一アミノ酸変異を導入したTriple mutantを作製し、AsA2Pの生成について評価した。アスコルビン酸(100mM)、リン酸基供与体としてポリリン酸(2重量%)(商品名:ポリリン酸、ナカライテスク社製)、及びTriton X−100(1重量%)を含む超純水(NaOHでpH4.5に調整)に、A115Rに加えて上記表1において改変体9〜23として示されるアミノ酸変異が導入されたアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体を各15μg/mlとなるよう添加し、37℃の恒温エアーインキュベーター内で一晩反応させた。その後、反応液をHPLCに使用される溶離液(酢酸緩衝溶液)で100倍に希釈し、HPLC解析に供して生成されたAsA2Pの量を測定した。コントロールとして改変体3(A115R/H116Q)を使用し、同様の条件で反応及び測定を行った。結果を図6に示す。
野生型アスコルビン酸リン酸化酵素を用いた場合のAsA2Pの生成について評価した。アスコルビン酸(50mM)、リン酸供与体としてポリリン酸(2重量%)(商品名:ポリリン酸、ナカライテスク社製)、及びTriton X−100(1重量%)を含む超純水(NaOHでpH4.5に調整)に、野生型アスコルビン酸リン酸化酵素を4.5μg/ml、9μg/ml、18μg/ml又は90μg/mlとなるよう添加し、37℃の恒温エアーインキュベーターで反応させた。反応から0、1、2、4、6、8、及び16時間点において、反応液をHPLCに使用される溶離液(酢酸緩衝溶液)で100倍に希釈し、HPLC解析に供して生成されたAsA2Pの量を測定した。結果を図7に示す。
配列番号2は、野生型アスコルビン酸リン酸化酵素において24位のプロリン残基〜249位バリン残基に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
配列番号5は、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体(改変体3)のアミノ酸配列である。
配列番号6は、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体(改変体3)をコードする塩基配列である。
配列番号7は、プライマー1の塩基配列である。
配列番号8は、プライマー2の塩基配列である。
配列番号9は、プライマー3の塩基配列である。
配列番号10は、プライマー4の塩基配列である。
配列番号11は、プライマー5の塩基配列である。
配列番号12は、プライマー6の塩基配列である。
配列番号13は、プライマー7の塩基配列である。
配列番号14は、プライマー8の塩基配列である。
配列番号15は、プライマー9の塩基配列である。
配列番号16は、プライマー10の塩基配列である。
配列番号17は、プライマー11の塩基配列である。
配列番号18は、プライマー12の塩基配列である。
配列番号19は、プライマー13の塩基配列である。
配列番号20は、プライマー14の塩基配列である。
配列番号21は、プライマー15の塩基配列である。
配列番号22は、プライマー16の塩基配列である。
配列番号23は、プライマー17の塩基配列である。
配列番号24は、プライマー18の塩基配列である。
配列番号25は、プライマー19の塩基配列である。
配列番号26は、プライマー20の塩基配列である。
配列番号27は、プライマー21の塩基配列である。
配列番号28は、プライマー22の塩基配列である。
配列番号29は、プライマー23の塩基配列である。
配列番号30は、プライマー24の塩基配列である。
配列番号31は、プライマー25の塩基配列である。
配列番号32は、プライマー26の塩基配列である。
配列番号33は、プライマー27の塩基配列である。
配列番号34は、プライマー28の塩基配列である。
配列番号35は、プライマー29の塩基配列である。
配列番号36は、プライマー30の塩基配列である。
配列番号37は、プライマー31の塩基配列である。
Claims (7)
- 以下の(A)〜(H)のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、115位以外のアミノ酸残基の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(C)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換、且つ116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(D)前記(C)のアミノ酸配列において、115位及び116位以外のアミノ酸残基の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(E)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換、116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換、且つ130位のアスパラギン残基がトレオニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(F)前記(E)のアミノ酸配列において、115位、116位、及び130位以外のアミノ酸残基の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(G)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換、116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換、且つ55位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(H)前記(G)のアミノ酸配列において、115位、116位、及び55位以外のアミノ酸残基の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−2−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。 - 以下の(A)、(C)、(E)、又は(G)のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(C)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換、且つ116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(E)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換、116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換、且つ130位のアスパラギン残基がトレオニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体;
(G)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、115位のアラニン残基がアルギニン残基に置換、116位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換、且つ55位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体。 - 請求項1又は2に記載の酵素改変体をコードする単離されたDNA。
- 請求項3に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターにより宿主生物を形質転換して得られる、形質転換体。
- 請求項1又は2に記載のアスコルビン酸リン酸化酵素改変体を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させ、アスコルビン酸−2−リン酸を製造する方法。
- 前記リン酸基供与体がポリリン酸である、請求項6に記載の方法。
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