KR20090079570A

KR20090079570A - Ｇｍｐ 전환활성이 감소된 구아노신 모노포스페이트카이네이즈 변이체

Info

Publication number: KR20090079570A
Application number: KR1020080005649A
Authority: KR
Inventors: 김철하; 최종수; 조진만; 양영렬; 김혜원; 김창겸; 홍국기; 이진남; 이지혜
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2009-07-22
Also published as: KR101000669B1; WO2009091228A3; WO2009091228A2

Abstract

본 발명은 5'-구아노신-모노포스페이트 (5'-guanosine-monophosphate)에서 5'-구아노신-다이포스페이트(5'-guanosine-diphosphate)로의 전환 활성이 약화된 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈(guanosine mono-phosphate kinase) 변이체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 세포 성장에 영향이 없으면서 40℃에서 GMP 전환 활성이 야생형 대비 50% 이하로 감소된 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체에 관한 것이다.

구아노신 모노포스페이트 카이네이즈(guanosine monophosphate kinase) 변이체, GMP, GDP

Description

ＧＭＰ 전환활성이 감소된 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체{A MUTATED GUANOSINE MONOPHOSPHATE KINASE HAVING WEAK GMP CONVERSION ACTIVITY}

본 발명은 5'-구아노신 모노포스페이트(5'-guanosine monophosphate; 이하 GMP라 칭한다)의 전환 활성이 야생형 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈(guanosine monophosphate kinase)에 비하여 50% 이하로 감소된 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈(이하 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈라 칭한다) 변이체 및 이를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.

GMP는 5'-이노신 모노포스페이트(5'-inosine monophosphate; 이하 IMP라 칭한다)와 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. GMP는 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 IMP과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.

지금까지 알려진 GMP의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 5'-GMP를 직접 발 효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산(xanthosine 5'-monophosphate; 이하 XMP라 칭한다)를 코리네형 미생물을 이용하여 GMP으로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산(5'-크산틸산)를 에세리키아 콜리를 이용하여 GMP로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.

위에서 전기한 방법으로 GMP를 생산 할 경우 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈라는 효소가 생성된 GMP를 GDP로 전환하는 반응이 발생한다. 상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈는 GMP를 구아노신 다이포스페이트(5'-guanosine-di-phosphate: 이하 GDP라 칭한다)로 전환 시키는 효소로서 GTP, DNA, RNA등의 생성에 관여하는 세포성장에 필수적인 효소이다. 그러나, GMP를 생산하는 공정에 있어서는 생성된 GMP를 GDP로 전환시키므로, GMP의 수율을 떨어뜨리는 요인이기도 하다. 이 효소의 기작은 다음과 같다.

GMP + ATP -----------> GDP + AMP + PPi

구아노신 모노포스페이트 카이네이즈

이와 같은 반응은 생성된 GMP를 소모시키는 반응이며, 아데닌 트리포스페이트(adenine triphosphate; 이하 ATP라 칭한다)를 사용하는 반응이므로, GMP 생산성을 낮추는 부정적 영향을 준다. 이 반응을 막기 위해, 기존 에는 반응 온도를 42℃로 높여서 반응을 최소화하였다 (생물공학회지 제77권 제3호 104-112. 1999. 일본). 그러나 산업화 스케일에서 반응 온도를 42℃로 할 경우, 세포 생육에 저해 정도가 심각하여 GMP 생성반응에 필요한 에너지 요소인 ATP의 재생 활성(regeneration activity)이 낮은 현상이 나타나 반응이 완전히 이루어지지 않았고, 그 결과로 많은 양의 기질들이 남았다. 반응이 완전하게 마무리 되기 위해서는 반응온도를 약 40℃ 정도로 낮추어 ATP 공급체인 세포의 생육을 좀 더 길게 유지해야 했다. 하지만, 이것은 GDP의 생성을 높여 GMP의 수율을 낮추는 좋지 않은 효과를 나타내었다.

이에 본 발명자들은 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈는 세포의 생육에 필수 유전자이므로 파쇄(Knock-out)할 수 없었고, 활성을 무작정 낮춘다면 GMP 전환반응의 기질에 해당되는 XMP 및 구아노신의 정상적인 발효에 영향이 있을 수 있으므로 생육과 기질 발효에 영향이 없으면서도 최대한 GMP를 GDP로 전환하는 활성이 감소되는 것이 필요하고, 세포 성장 온도와 반응 온도가 다르다는 점에 착안하여 온도에 따라 GMP 전환 활성이 조절되는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체가 필요하다고 판단하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 40℃에서 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 GMP 전환활성이 야생형에 비하여 50% 이하로 감소된 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 40℃에서 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 GMP 전환활성이 야생형에 비하여 50% 이하로 감소된 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체들은 세포 생육에 영향이 없으면서도 GMP 전환 활성이 낮으며, 특히 XMP를 GMP로 전환시키는 반응이 일어나는 전환 반응 온도인 40℃에서의 활성이 현저히 낮아서, GMP 생산 수율 향상에 기여할 수 있다.

본 발명은 40℃에서 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 GMP 전환활성이 야생형에 비하여 50% 이하로 감소된 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 제공한다. 구체적으로는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈(guanosine monophosphate kinase)의 아미노산 위치 중 10~13, 41~97, 123~128, 150~154 또는 179~187의 부분에 변이를 가진 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 제공한다.

본 발명은 GMP 생산 수율 저해 요인인 GDP로의 전환 활성을 약화 시키기 위해 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 변이체를 개발하는 것이다. 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈는 DNA, RNA 등의 생성에 관여하는 효소로서 세포 성장에 필수적인 역할을 하지만, 생성된 GMP를 GDP로 전환하므로 GMP의 생산 수율을 떨어뜨리는 요인이기도 하다. 세포 성장에 영향을 주지 않도록 효소 활성을 유지시키면서, GDP로의 전환 반응을 약화시켜야 하는 두 가지의 조건은 매우 상반된 것으로 동시에 만족시키기에 매우 어려운 조건이다.

본 발명은 이와 같은 문제를 해결하기 위하여, 세포 성장에 영향이 없는 최소한의 활성을 갖는 변이체와 세포 성장과 전환 반응시의 차이점인 온도 조건에 대한 활성이 다른 변이체를 만들어 상호 모순적인 조건을 맞출 수 있었다.

본 발명은 세포 성장에 영향을 주지 않는 범위 내에서 GMP전환 활성 약화와 열에 대한 민감성이 부여된 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체 개발을 위해 효소의 단백질 3차 구조를 구조생물학 이론을 적용하여 원하는 특성을 갖는 효소 변이체를 제공한다.

주어진 단백질의 기능은 그 단백질의 구조, 특히 3차원 구조와 밀접한 관계 가 있다. 대부분의 단백질은 1차 구조, 즉 아미노산 서열이 단백질의 3차원 구조 형성에 필요한 모든 정보를 포함하고 있으며, 이러한 아미노산 서열로부터 3차원 구조를 모델링하는 것은 어렵지 않다. 일반적으로 효소 단백질의 주요 특성인 생촉매 역가, 안정성 및 기질에 대한 특이성 등은 아미노산들의 연속적인 1차원적 사슬이 3차원 공간에서 적합한 구조로 접힘으로써 나타나게 된다. 이러한 사실은 단백질의 3차 구조를 변경함으로써 인위적으로 대상 효소의 고유 특성을 변경할 수 있음을 쉽게 유추할 수 있으며 실제 많은 연구그룹들이 단백질 구조 이론을 적용하여 성공적으로 효소특성을 변경한 예가 발표되어 왔다 (Karen M. Polizzi, Javier F. Chaparro-Riggers, Eduardo Vazquez-Figueroa1 and Andreas S. Bommarius, Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase, Biotechnol. J. 2006 1: 531-536, Andreas Markus Loening, Timothy David Fenn4, Anna M.Wu1 and Sanjiv Sam Gambhir, Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output, Protein Engineering, Design & Selection 2006 19(9): 391-400).

본 발명에서는 단백질의 주요 특성 중 하나인 열 안정성을 조절하는 것을 주요 목표로 삼았다. 열에 대한 단백질의 안정성을 결정하는 주요 인자로는 반데르발스 상호작용 (van der Waals interaction) (Berezovsky IN, Tumanyan VG, Esipova NG. Representation of amino acid sequences in terms of interaction energy in protein globules. FEBS Lett. 1997 418(1-2): 43-6), 단백질 코어부분의 소수성 정도(core hydrophobicity)(Schumann J, Bohm G, Schumacher G, Rudolph R, Jaenicke R. Stabilization of creatinase from Pseudomonas putida by random mutagenesis. Protein Sci. 1993 2(10): 1612-20.), 수소결합 네트워크 (hydrogen bond interaction) (Jaenicke R. Stability and folding of domain proteins. Prog. Biophys. Mol. Biol. 1999 71(2): 155-241.), 이온결합 (ionic interaction) (Vetriani C, Maeder DL, Tolliday N, Yip KS, Stillman TJ, Britton KL, Rice DW, Klump HH, Robb FT. Protein thermostability above 100 degrees C: a key role for ionic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 95(21): 12300-5), 그리고 패킹 밀도 (packing density) (Hurley JH, Baase WA, Matthews BW. Design and structural analysis of alternative hydrophobic core packing arrangements in bacteriophage T4 lysozyme. J. Mol. Biol. 1992 224(4): 1143-59) 등을 들 수 있다.

지금까지 발표된 연구들은 주로 효소의 열 안정성을 높이는 방향으로 연구가 진행되어 왔고, 특히 Korkegian 등은 소수성 아미노산 잔기의 패킹 밀도를 증가하도록 인위적으로 단백질을 조절하여 성공적으로 열 안정성을 부여할 수 있음을 보였다 (Aaron Korkegian, Margaret E. Black, David Baker, Barry L. Stoddard, Computational Thermostabilization of an Enzyme, Science, 2005 308: 857). 본 발명에서는 이러한 연구로부터 아이디어를 얻어 역으로 대상 단백질의 핵심부분 패킹밀도를 줄임으로써 온도가 증가하였을 때 온도 민감성을 부여할 수 있다.

여기서 패킹 밀도는 분자의 반데르발스 엔벨럽(van der Waals envelope) 분자부피와 공간상에서 실제로 차지하고 있는 부피의 비율로 정의 되는 값으로 단백 질의 지역적인 패킹 밀도는 단백질의 많은 구조 특성을 알 수 있다. 단백질내의 패킹 밀도가 높은 부분은 온도가 증가하여 증가된 열역학적 에너지에 견딜 수 있도록 도와줌으로 결과적으로 높은 온도에서도 원래 가지고 있는 구조를 유지할 수 있다. 반면에 본 발명에서는 상대적으로 효소 역가에 영향을 주지 않으면서 단백질 구조를 이루는 코어부분의 패킹밀도를 감소시켜 세포 성장온도에서는 성장에 필요한 효소역가를 유지하지만 반응온도로 온도를 증가시켰을 경우에는 효소 역가가 기존 야생형 대비 현저히 낮게 제어할 수 있는 효소를 개발하였다.

변이 위치를 위와 같은 방법으로 선정한 뒤, 공지의 분자생물학적인 방법인 포인트 변이법(point mutagenesis)을 이용하여 효소 변이체를 제작할 수 있다. 이어서, 상기 효소 변이체를 플라스미드 형태로 대장균에 도입한 후, 각각의 GMP 전환 활성을 비교하여 야생형 대비 활성 수준이 낮고, 온도 민감성이 부여된 다양한 변이체들을 얻을 수 있었다.

본 발명의 한 양태에서, 상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 27 내지 36 중 어느 하나의 핵산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 핵산 분자를 포함한 벡터를 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 국한되지 않는다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 구조 분석을 통한 GMP 전환 활성 약화 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 ( guanylate mono - phosphate kinase ) 변이 위치의 선정

현재까지 코리네박테리움의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 단백질 3차 구조가 밝혀져 있지 않기 때문에 단백질 구조 관점에서 새로운 변이체를 디자인 하기 위해서는 코리네박테리움 암모니아게네스의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 구조를 모델링을 선행하였다. 단백질 3차 구조는 호몰로지 모델링(Homology modeling) 기법을 이용하여 사이빌펙키지(Sybylpackage) 내에 있는 컴포저(Composer) 모듈을 사용하여 제작하였다. 모델은 이미 단백질 구조가 밝혀진 마이코박테리엄 투벌큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈를 기본 템플레이트(template)로 코리네박테리움 암모니아게네스의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 단백질 3차 구조를 모델링 하여 얻었다.

트리포스(Tripos)사의 소프트웨어 사이빌펙키지(Sybylpackage)를 이용하여 패킹 밀도를 분석하였다. 분석 결과 패킹 밀도는 0.26 ~ 0.62 범위에 있었으며 이중 패킹 밀도가 0.57 이상인 아미노산을 변이 후보로 1차 선정을 하였다. 1차 후보 로 선정된 아미노산들은 코리네박테리움 암모니아게네스의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 아미노산 잔기 번호를 기준으로 10~13, 41~97, 103~105, 111~115, 123~128, 135~136, 150~154, 179~187의 위치였다.

이들 아미노산 잔기가 차지하는 표면적은 전체의 22% 정도로 패킹밀도가 단백질 내에서 상대적으로 높은 영역으로 ATP, GTP 가 결합하는 영역, 리드(Lid) 영역 및 단백질 코어 부분 등에 산재 되어있다(도 1).

1차 선정된 아미노산 잔기 중에서 효소 역가에 영향을 줄 수 있는 기질 바인딩부분과 리드(Lid) 영역은 변이 후보에서 제외를 하고 주로 단백질의 몸을 이루는 코어부분에 존재하면서 패킹 밀도가 높은 아미노산 잔기를 주요 변이 후보로 선정하였다.

후보 아미노산은 패킹밀도를 줄이기 위해서 소수성이면서 부피가 큰 아미노산 잔기를 같은 소수성을 가지면서 부피가 작은 다른 종류의 아미노산으로 치환하는 방법 (예, Leu → Val, Leu → Ala, Ile → al)과 단백질 내부에 묻혀있는 소수성 아미노산 잔기 중심에 부피는 비슷하거나 작은 친수성인 아미노산 잔기를 대체하는 방법을 (예, Leu → Ser, Val → Thr, Leu →Thr 등) 사용하였다. 위와 같은 방법으로 아래 테이블에 나와 있는 최종 10종의 변이체를 선별하였다.

No.	변이체 후보
1	GMK L154A (루신 → 알라닌)
2	GMK L187S (루신 → 세린)
3	GMK L13K / L97A (루신 → 리신 / 루신 → 알라닌)
4	GMK L124V, L127V (루신 → 발린 / 루신 → 발린)
5	GMK L10N / V12T / L28T (루신 → 아스파라긴 / 발린 → 쓰레오닌 / 루신 → 쓰레오닌)
6	GMK L10N (루신 →아스파라긴)
7	GMK L124V (루신 → 발린)
8	GMK V12T (발린 → 쓰레오닌)
9	GMK L28N (루신 → 아스파라긴)
10	GMK L13A / L97A / I183V / T184K (루신 → 알라닌 / 루신 → 알라닌 / 이소루이신 →발린 / 쓰레오닌 →루신)

실시예 2: 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 ( guanylate mono - phosphate kinase) 야생형의 클로닝

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 하여 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통하여 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 (guanylate mono-phosphate kinase)를 코딩하는 유전자(gmk 유전자)를 얻었다. 얻어진 gmk 유전자의 단편을 제한효소 EcoR Ⅴ (New England Biolabs, Beverly, MA)와 PstI (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용하여 공지의 분자생물학적 기술로 pECCG1117 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 도입하였다. 또한 CJ1 프로로모터(등록특허 제10-6620092)를 KpnI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 EcoRⅤ (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 pECCG117-gmk 벡터에 도입하여 pHC131T-gmk 벡터를 제작하였다(도 2).

gmk 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같 다.

서열번호 1 (gmk - 5)

5'- GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGC - 3'

서열번호 2 (gmk - 3)

5'- AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG - 3'

실시예 3: 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 ( guanylate mono - phosphate kinase) 변이체의 제작

구아노신 모노포스페이트 카이네이즈의 야생형 이용하여 상기의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체를 제조하기 위한 프라이머를 제작하였고 이를 서열번호 3 ~ 16에 나타내었다. GMK 아미노산 배열 중에 바뀌는 위치를 도 3에 표시하였다.

NO.	아미노산 변위 위치 및 변이	서열 번호	서열 (5'-seq.-3')	사용 위치 (도2 참조)
Mut1	L154A	1	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGC	5' 프라이머
Mut1	L154A	3	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATGGCCGCAACTGCGTCATCTAGGTTGTCATTGACAATCACGCGGTCGAACTCCGACTGACACGCCAGCTCTTCACGGGCCGTATC C GC TCGACGCTCAATAAC	3' 변이 프라이머
Mut2	L187S	1	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGC	5' 프라이머
Mut2	L187S	4	AACTGCAGCTATCCTTG CGA GATAGCAGTG	3' 변이 프라이머
Mut3	L13K / L97A	5	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGCGGACGCCTTGTCGTG AAG GCAGGGCCTTCCG	5' 변이 프라이머
		6	GCCGGGAGTCCTC GGC GGCTTCCTTCACG	3' 변이 프라이머
		7	CGTGAAGGAAGCC GCC GAGGACTCCCGGC	5' 변이 프라이머
		2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3' 프라이머
Mut4	L124V / L127V	8	CTGAGGCAGAG GTG GTATTT GTA GCTCCGCCATCG	5' 변이 프라이머
		2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3' 프라이머
		1	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGC	5' 프라이머
		9	CGATGGCGGAGC TAC AAATAC CAC CTCTGCCTCAG	3' 변이 프라이머
Mut5	L10N / V12T / L28T	10	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGCGGACGC AAT GTC ACG CTGGCAGGGCCTTCCGCTGTTGGTAAATCCACGGTGGTCTCGCGC AAT CGTCACGGTG	5' 변이 프라이머
Mut5	L10N / V12T / L28T	2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3' 프라이머
Mut6	L10N	11	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGCGGACGC AA T GTCGTGCTGGCAGGGCCTTC	5' 변이 프라이머
Mut6	L10N	2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3' 프라이머
Mut7	L124V	12	CTGAGGCAGAG GTG GTATTTTTAGC	5' 변이 프라이머
		2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3' 프라이머
		1	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGC	5' 프라이머
		13	GCTAAAAATAC CAC CTCTGCCTCAG	3' 변이 프라이머
Mut8	V12T	14	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGCGGACGCCTTGTC ACG CTGGCAGGGCC	5' 변이 프라이머
Mut8	V12T	2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3'프라이머
Mut9	L28N	15	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGCGGACGCCTTGTCGTGCTGGCAGGGCCTTCCGCTGTTGGTAAATCCACGGTGGTCTCGCGC AAT CGTCACGGTG	5' 변이 프라이머
Mut9	L28N	2	AACTGCAGCTATCCTTGCAGGATAGCAGTGATG	3' 프라이머
Mut10	L13A / L97A / I183V / T184K	1	GCGCGATATCATGAACAGCGCTAATCACCGC	5' 프라이머
		16	CTATCCTTGCAGGATAGC CTTCAC GGCCGCAACTG	3' 변이 프라이머
		사용된 주형: L13K / L97A mutant

상기 프라이머를 이용하여 위치 특이적 변이 (site-directed mutagenesis)를 수행하였고, 공지의 분자생물학적 지식으로 아마노산 한 종에 여러 개의 뉴클레오타이드 조합이 있을 수 있으므로 빈번하게 발생하는 대표적인 것으로 선택하여 프라이머를 디자인하였다. 수행 방법은 pHC131T-gmk를 주형으로(단, 변이체 7번의 경우만 주형으로 변이체 6번을 사용함)하여 상기의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통하여 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 (guanylate mono-phosphate kinase) 변이체를 코딩하는 유전자들을 얻었다(도 4). 얻어진 gmk 유전자의 단편을 제한효소 EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 PstI (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용하여 공지의 분자생물학적 기술로 pHC131T 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 도입하여 pHC131T-gmk 변이체 벡터를 제작하였고, 각각을 변이체 1 ~ 10(이하 Mut1 ~ Mut10으로 칭한다)으로 명명하였다.

실시예 4: 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 ( guanylate mono - phosphate kinase) 변이체들의 GMP 전환 활성 측정

구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체들의 활성 저하 정도를 확인하기 위해 gmk 야생형과 변이체들을 포함한 pHC131T 벡터를 대장균에 도입(transformation)한 후 배양하였고, 세포를 파쇄한 후 효소의 활성을 측정하였다. 구체적인 실험 내용은 다음과 같다. 박토 트립톤 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 카나마이신 50 mg/L를 포함한 5 mL 배지에 각 변이체를 접종하고 37℃에서 12 시간 배양하였다. 배양 후 2 mL 배양액의 세포를 회수(harvest)한 후 트리 스 버퍼(Tris-HCl, 10mM, pH 8.0) 400μl에 다시 풀어주었다. 세포 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파괴한 후 원심분리를 통해 상등액 만을 분리하였다. 상등액 중에 100μl를 효소액으로 사용하였다. 반응액은 트리스 버퍼(Tris-HCL, 1M, pH8.0) 150μl, MgCl₂6H₂O(0.2M) 100μl, KCl(2M) 100μl, GMP(50g/L) 50μl, ATP(50g/L) 50μl, 증류수 450μl로 만들어 4℃에 보관하였다가 반응 시에는 샘플 별로 2개씩 만들어서 각각 30℃와 40℃로 준비하였다. 샘플은 벡터만 포함된 음성 대조군(negative control), 야생형의 gmk가 포함된 양성 대조군 (positive control) 그리고 총 10종의 변이 gmk를 포함한 변이체들로 각각 100μl 효소액을 첨가하여 15분간 반응하였다. 반응 종료는 0.35% TCA(trichloroacetic acid) 800μl에 반응액 200μl를 첨가하여 수행하였다. 초기 넣어준 GMP양에서 줄어든 GMP양을 측정하여 GMP에 전환 활성의 차이를 측정하였고 그 결과는 도 4에 나타내었다. GMP전환 활성 측정 결과 야생형 대비 50%, 25%, 20%, 10%, 5% 등의 낮아진 활성을 갖는 변이체들이 만들어진 것을 확인할 수 있었고, 특히 전환 반응 온도인 40℃수준에서의 활성이 현저히 낮은 것을 확인하였다. 구체적으로, 야생형 활성이 0.16에서 0.14(dGMP/total protein)인 반면, mut1 내지 mut10은 0.09 내지 -0.01 사이의 활성을 나타내었다.

도 1은 추정된 코리네박테리움 암모니아게네스의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 단백질 3차 구조로, 1차 변이 후보 아미노산 잔기를 나타낸 것이다.

도 2는 pHC131T-gmk 벡터 구조에 관한 것으로, pECCG117 벡터에 CJ1 프로모터와 gmk ORF를 클로닝한 것이다.

도 3은 돌연변이 발생 아미노산 위치를 나타낸 것이다.

도 4는 gmk 변이체 제작 방법에 관한 모식도를 나타낸 것이다. gmk 변이체 제작을 위해 변이를 중심으로 5' 프라이머와 3' 변이 프라이머 그리고 5' 변이 프라이머 서열의 부분별 PCR을 행한 후, 최종적으로 5' 프라이머와 3' 프라이머로 PCR하여 변이체 유전자을 완성하였다. 이것은 도2에서와 같이 gmk 위치에 치환 되었다.

도 5는 코리네박테리움 암모니아게네스의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체들의 온도 별 GMP전환도 비교 결과를 나타낸 것이다.

<110> CJ jeiljedang <120> A mutated guanosine monophosphate kinase having weak GMP conversion activity <130> PA07-0417 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcgcgatatc atgaacagcg ctaatcaccg c 31 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aactgcagct atccttgcag gatagcagtg atg 33 <210> 3 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aactgcagct atccttgcag gatagcagtg atggccgcaa ctgcgtcatc taggttgtca 60 ttgacaatca cgcggtcgaa ctccgactga cacgccagct cttcacgggc cgtatccgct 120 cgacgctcaa taac 134 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aactgcagct atccttgcga gatagcagtg 30 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgcgatatc atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcgtgaagg cagggccttc 60 cg 62 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gccgggagtc ctcggcggct tccttcacg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgtgaaggaa gccgccgagg actcccggc 29 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgaggcaga ggtggtattt gtagctccgc catcg 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgatggcgga gctacaaata ccacctctgc ctcag 35 <210> 10 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcgcgatatc atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcaat gtcacgctgg cagggccttc 60 cgctgttggt aaatccacgg tggtctcgcg caatcgtcac ggtg 104 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcgcgatatc atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcaat gtcgtgctgg cagggccttc 60 60 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctgaggcaga ggtggtattt ttagc 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gctaaaaata ccacctctgc ctcag 25 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcgcgatatc atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcacgctgg cagggcc 57 <210> 15 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcgcgatatc atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcgtgctgg cagggccttc 60 cgctgttggt aaatccacgg tggtctcgcg caatcgtcac ggtg 104 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctatccttgc aggatagcct tcacggccgc aactg 35 <210> 17 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (154) <223> Leucine -> alanine <400> 17 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Val Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Ala Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 18 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (187) <223> Leucine -> Serine <400> 18 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Val Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Ser Gln Gly 180 185 <210> 19 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Leucine -> Lysine <220> <221> VARIANT <222> (97) <223> Leucine -> Alanine <400> 19 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Val Lys Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Ala Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 20 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (124) <223> Leucine -> Valine <220> <221> VARIANT <222> (127) <223> Leucine -> Valine <400> 20 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Val Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Val Val Phe Val Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 21 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Leucine -> Asparagine <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Valine -> Threonine <220> <221> VARIANT <222> (28) <223> Leucine -> Threonine <400> 21 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Asn Val Thr Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Thr Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 22 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Leucine -> Asparagine <400> 22 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Asn Val Val Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 23 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (124) <223> Leucine -> Valine <400> 23 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Val Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Val Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 24 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Valine -> Threonine <400> 24 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Thr Leu Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser 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Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Asn Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Leu Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 26 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Leucine -> Alanine <220> <221> VARIANT <222> (97) <223> Leucine -> Alanine <220> <221> VARIANT <222> (183) <223> Isoleucine -> Valine <220> <221> VARIANT <222> (184) <223> Threonine -> Leucine <400> 26 Met Asn Ser Ala Asn His Arg Gly Arg Leu Val Val Ala Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Leu Arg His Gly Val 20 25 30 Asp Arg Leu Tyr Phe Ser Val Ser Met Thr Thr Arg Ala Pro Arg Pro 35 40 45 Gly Glu Gln Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe Val Ser Pro Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Arg Arg Ile Asp Ala Gly Glu Met Leu Glu Trp Ala Asp Ile His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Lys Glu Ala 85 90 95 Ala Glu Asp Ser Arg Pro Val Leu Ile Glu Val Asp Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Arg Asn Val Lys Lys Ala Leu Pro Glu Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala 115 120 125 Pro Pro Ser Trp Glu Val Leu Val Asp Arg Leu Thr Gly Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Pro Gln Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Asp Thr Ala Arg Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ala Cys Gln Ser Glu Phe Asp Arg Val Ile Val Asn Asp Asn Leu 165 170 175 Asp Asp Ala Val Ala Ala Val Lys Ala Ile Leu Gln Gly 180 185 <210> 27 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 27 ctatccttgc aggatagcag tgatggccgc aactgcgtca tctaggttgt cattgacaat 60 cacgcggtcg aactccgact gacacgccag ctcttcacgg gccgtatccg ctcgacgctc 120 aataacctct tgaggttcgg tgccacgacc agtgagacgg tcaactaaca cttcccacga 180 tggcggagct aaaaatacca actctgcctc aggaagcgct ttcttgacgt tgcgcgcgcc 240 ttccaaatcc acctcaatca acaccggccg ggagtcctct agggcttcct tcacgggtgc 300 tgcgggtgtt ccagatcgtt gtagaccccc gtgaatatct gcccactcga gcatttcacc 360 ggcgtcaatg cggcgctgga attcttccgg actaacaaag aagtagtcca ccccgtcctg 420 ttcacctgga cgaggggcgc gtgtagtcat agacacgctg aagtacagcc tgtctacacc 480 gtgacgcaag cgcgagacca ccgtggattt accaacagcg gaaggccctg ccagcacgac 540 aaggcgtccg cggtgattag cgctgttcat 570 <210> 28 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 28 ctatccttgc gagatagcag tgatggccgc aactgcgtca tctaggttgt cattgacaat 60 cacgcggtcg aactccgact gacacgccag ctcttcacgg gccgtatcaa gtcgacgctc 120 aataacctct tgaggttcgg tgccacgacc agtgagacgg tcaactaaca cttcccacga 180 tggcggagct aaaaatacca actctgcctc aggaagcgct ttcttgacgt tgcgcgcgcc 240 ttccaaatcc acctcaatca acaccggccg ggagtcctct agggcttcct tcacgggtgc 300 tgcgggtgtt ccagatcgtt gtagaccccc gtgaatatct gcccactcga gcatttcacc 360 ggcgtcaatg cggcgctgga attcttccgg actaacaaag aagtagtcca ccccgtcctg 420 ttcacctgga cgaggggcgc gtgtagtcat agacacgctg aagtacagcc tgtctacacc 480 gtgacgcaag cgcgagacca ccgtggattt accaacagcg gaaggccctg ccagcacgac 540 aaggcgtccg cggtgattag cgctgttcat 570 <210> 29 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 29 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcgtgaagg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg cttgcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccgc cgaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagt tggtattttt agctccgcca tcgtgggaag tgttagttga ccgtctcact 420 ggtcgtggca ccgaacctca agaggttatt gagcgtcgac ttgatacggc ccgtgaagag 480 ctggcgtgtc agtcggagtt cgaccgcgtg attgtcaatg acaacctaga tgacgcagtt 540 gcggccatca ctgctatcct gcaaggatag 570 <210> 30 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 30 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcgtgctgg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg cttgcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccct agaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagg tggtatttgt attagctccg ccatcgtggg aagtgttagt tgaccgtctc 420 actggtcgtg gcaccgaacc tcaagaggtt attgagcgtc gacttgatac ggcccgtgaa 480 gagctggcgt gtcagtcgga gttcgaccgc gtgattgtca atgacaacct agatgacgca 540 gttgcggcca tcactgctat cctgcaagga 570 <210> 31 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 31 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcaat gtcacgctgg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg caatcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccct agaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagt tggtattttt agctccgcca tcgtgggaag tgttagttga ccgtctcact 420 ggtcgtggca ccgaacctca agaggttatt gagcgtcgac ttgatacggc ccgtgaagag 480 ctggcgtgtc agtcggagtt cgaccgcgtg attgtcaatg acaacctaga tgacgcagtt 540 gcggccatca ctgctatcct gcaaggatag 570 <210> 32 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 32 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcaat gtcgtgctgg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg cttgcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccct agaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagt tggtattttt agctccgcca tcgtgggaag tgttagttga ccgtctcact 420 ggtcgtggca ccgaacctca agaggttatt gagcgtcgac ttgatacggc ccgtgaagag 480 ctggcgtgtc agtcggagtt cgaccgcgtg attgtcaatg acaacctaga tgacgcagtt 540 gcggccatca ctgctatcct gcaaggatag 570 <210> 33 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 33 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcgtgctgg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg cttgcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccct agaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagg tggtattttt agctccgcca tcgtgggaag tgttagttga ccgtctcact 420 ggtcgtggca ccgaacctca agaggttatt gagcgtcgac ttgatacggc ccgtgaagag 480 ctggcgtgtc agtcggagtt cgaccgcgtg attgtcaatg acaacctaga tgacgcagtt 540 gcggccatca ctgctatcct gcaaggatag 570 <210> 34 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 34 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcacgctgg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg cttgcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccct agaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagt tggtattttt agctccgcca tcgtgggaag tgttagttga ccgtctcact 420 ggtcgtggca ccgaacctca agaggttatt gagcgtcgac ttgatacggc ccgtgaagag 480 ctggcgtgtc agtcggagtt cgaccgcgtg attgtcaatg acaacctaga tgacgcagtt 540 gcggccatca ctgctatcct gcaaggatag 570 <210> 35 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 35 atgaacagcg ctaatcaccg cggacgcctt gtcgtgctgg cagggccttc cgctgttggt 60 aaatccacgg tggtctcgcg caatcgtcac ggtgtagaca ggctgtactt cagcgtgtct 120 atgactacac gcgcccctcg tccaggtgaa caggacgggg tggactactt ctttgttagt 180 ccggaagaat tccagcgccg cattgacgcc ggtgaaatgc tcgagtgggc agatattcac 240 gggggtctac aacgatctgg aacacccgca gcacccgtga aggaagccct agaggactcc 300 cggccggtgt tgattgaggt ggatttggaa ggcgcgcgca acgtcaagaa agcgcttcct 360 gaggcagagt tggtattttt agctccgcca tcgtgggaag tgttagttga ccgtctcact 420 ggtcgtggca ccgaacctca agaggttatt gagcgtcgac ttgatacggc ccgtgaagag 480 ctggcgtgtc agtcggagtt cgaccgcgtg attgtcaatg acaacctaga tgacgcagtt 540 gcggccatca ctgctatcct gcaaggatag 570 <210> 36 <211> 570 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 36 ctatccttgc aggatagcct tcacggccgc aactgcgtca tctaggttgt cattgacaat 60 cacgcggtcg aactccgact gacacgccag ctcttcacgg gccgtatcaa gtcgacgctc 120 aataacctct tgaggttcgg tgccacgacc agtgagacgg tcaactaaca cttcccacga 180 tggcggagct aaaaatacca actctgcctc aggaagcgct ttcttgacgt tgcgcgcgcc 240 ttccaaatcc acctcaatca acaccggccg ggagtcctcg gcggcttcct tcacgggtgc 300 tgcgggtgtt ccagatcgtt gtagaccccc gtgaatatct gcccactcga gcatttcacc 360 ggcgtcaatg cggcgctgga attcttccgg actaacaaag aagtagtcca ccccgtcctg 420 ttcacctgga cgaggggcgc gtgtagtcat agacacgctg aagtacagcc tgtctacacc 480 gtgacgcaag cgcgagacca ccgtggattt accaacagcg gaaggccctg ccttcacgac 540 aaggcgtccg cggtgattag cgctgttcat 570

Claims

야생형에 비하여 구아노신 모노포스페이트 전환활성이 50% 이하로 감소된 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체.
제1항에 있어서,

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈(guanosine monophosphate kinase)의 아미노산 위치 중 10~13, 41~97, 123~128, 150~154 또는 179~187의 부분에 변이를 가진 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체.
제1항에 있어서,

상기 변이체는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 아미노산 위치 중 10번째 루신이 아스파라긴으로(L10N), 12번째 발린이 쓰레오닌으로(V12T), 13번째 루신이 리신으로(L13K), 28번째 루신이 아스파라긴으로(L28N), 97번째 루신이 알라닌으로(L97A), 124번째 루신이 발린으로(L124V), 127번째 루신이 발린으로(L127V), 154번째 루신이 알라닌으로(L154V), 183번째 이소루이신이 발린으로(I183V), 184번째 쓰레오닌이 리신으로(T184K) 또는 187번째 루신이 세린으로(L187S) 변이된 것 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체.
제1항에 있어서,

상기 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈는 전환 반응 온도인 40℃에서 야생형에 비하여 구아노신 모노포스페이트의 전환활성이 더 감소된 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체.
제1항에 있어서,

상기 변이체는 서열 번호 17 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈 변이체.
제1항에 따른 구아노신 모노포스페이트 카이네이즈를 암호화하는 서열번호 27 내지 36 중 어느 하나의 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.