SU1544802A1 - Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера - Google Patents
Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера Download PDFInfo
- Publication number
- SU1544802A1 SU1544802A1 SU884420991A SU4420991A SU1544802A1 SU 1544802 A1 SU1544802 A1 SU 1544802A1 SU 884420991 A SU884420991 A SU 884420991A SU 4420991 A SU4420991 A SU 4420991A SU 1544802 A1 SU1544802 A1 SU 1544802A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- strain
- btu
- restrictase
- units
- thuringiensis
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биотехнологии и генной инженерии и представл ет собой штамм BACILLUS THURINGIENSIS ВКПМ В-4287, продуцирующий рестриктазу, названную BTU-1 и узнающую последовательность нуклеотидов 5 @ - ATCGAT-3 @ . Штамм выделен из природного материала в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктазы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов. Штамм хорошо растет на простой по составу питательной среде и выдел ет только одну рестриктазу, что значительно упрощает ее выделение. Выход фермента составл ет 5000 ед/г сырой биомассы. 1 табл.
Description
Изобретение относитс к области биотехнологии и генной инженерии и представл ет собой штамм В. thurin- giensis, продуцирующий эндонуклеазу (рестриктазу), названную Btu-I и узнающую последовательность нуклеотидов 5 -ATCGAT-З .
Рестриктаза Btu может быть использована при исследовании первичной структуры ДНК и в генной инженерии при конструировании рекомбинантных
ДНК.
Целью изобретени вл етс создание высокопродуктивного штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 - продуцента рестриктазы Btu-I изоши- зомера С1а I, продуцирующего только одну рестриктазу.
Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) позвол ет получить рестриктазу Btu-I и ошизомер Cla I
в количестве до 5000 ед./г сырой биомассы. Предлагаемый штамм хорошо растет на питательной среде простого состава и продуцирует одну рестриктазу , что значительно упрощает ее выделение.
Предлагаемый штамм В.thuringiensis ВКПМ В-4287 (ВНИИ генетики 16-И-48) выделен из природного материала в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаэы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов .
Исследуемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими
признаками.
Морфологические признаки: грамм- положительные палочки, перетрихи размером (1,5-1,9)«(3-6) мкм, образует
(/
С
ел
Јъ Ј 00 О ГО
10
поры и выт нутые мелкие ромбовидые кристаллы.
Культуральные признаки: на агари- зованной среде Хоттингера через 24 ч роста при 30°С гатамм В. thurin- iensis (ВНИИ генетики 16-И-48) образует шероховатые колонии с серым тливом, кра ровные, центр более лотный, возвышаетс в виде пуговки , вокруг которой четко виден ваик , d 3-10 мм.
О
На среде МПА через 24 ч при 30 С бразует колонии с ровными кра ми, . поверхность шероховата , в центре е|цва заметное возвышение, по краю валик, d 3-8 мм.
На дрожже-полисахаридной среде 100 г сорбита, 60 мл дрожжевого автолиз эта, 1 г (NH4)S04, pH 5,8, 20 г агара на 1 л среды штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) образует колонии плоские, с несколько различными кра ми, центр более плотный, блест щий, d 3-8 мм.
Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Штамм В. thuringiensis сбраживает глюкозу, сахарозу. Не использует маннозу, салицин, эскулин. Образует TWE (TW-эстеразу), не образует лецитин .
Отношение к источникам азота„ Усваивает аминный азот белков.
Отношение к температуре: растет от 28-37°С, оптимум 30°С.
Отношение к рН среды: растет При рН от 5,8-7,2, оптимум рН 7,,0.
Отношение к кислороду: аэроб,, Щтамм не патогенен. Культура хранитс на агаризованной среде Хоттингера под вазелиновым маслом.
Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) продуцирует рестрик- тазу со специфичностью 5 ATCGAT,, названную Bru-I, согласно общепризнанной номенклатуре. Рестриктаза Btu-I чувствительна к метилированию внутреннего аденинового основани в сайте узнавани .
Оптимальное значение рН дл действи рестриктазы 7,5-8,0, оптимальна температура действи рестриктазы 37-40 С, дл активности Фермента требуютс ионы Mg24(5-10 мМ) „ Фермент активизируетс небольшими концентраци- ими NaCl (25-50 MF). За единицу ак- ивности принимаетс количество фер- чента, вызывающее полное расщепление
15
2
2
5
0
5
1 мкг ДНК cbara л мбда за 1 ч инкубации при 37°С. Состав буфера: 10 мМ трис-HCl, 50 мК NaCl, 10 мМ MgCl, 0 мМ 2-МЭ, рН 7,5. Дл определени последовательности нуклеотидов, узнаваемых рестриктазой Btu-I, проводили гидролиз ею ДНК различного происхождени , дл которой известна нукле- отидна последовательность: бактериофага л мбда ( Л ), ф XI 74 РФ, Ml 3, вируса SV 40, плазмиды РВР322.. Расщепление ДНК провод т в реакционной среде следующего состава: 10 мМ трис- HCl (рН 7,5) 6 мМ 2-мерпатоэтанола, 6 мМ MgCl2 и 50 мМ NaCl при 37°С. Количество фрагментов, полученных при расщеплении различных ДНК рестриктазой Btu-I позвол ет однозначно установить сайт узнавани - 5 ATCGAT (Gene , 10, 357, 1980).
Количество сайтов расщеплени дл рестриктазы Btu-I и С1а на ДНК различного происхождени приведено в таблице.
5
0
5
0
5
Таким образом, рестриктаза Btu вл етс изошизомером ранее описанной и широко используемой в генной инженерии , молекул рной биологии и биотехнологии рестриктазы Cla I. Рестриктаза Btu-I по характеру своего действи аналогично рестриктаэе Cla Т чувствительна к dam-метилированию.
Пример. Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) поддерживают в пробирках на агаризованной среде Хоттингера под вазелиновым маслом . Дл оживлени штамм пересевают на агар Хоттингера и инкубируют при 37°С 19 ч Затем пересевают в пробирки с 5 мл бульона Хоттингера и инкубируют при 37°С 4 ч на качалке. Такую культуральную жидкость внос т в соотношении 1:50 в 250 мл бульона Хоттингера в колбы объемом 650 мл и выращивают на круговой качалке при 250 об/мин при 37 С до поздней логарифмической фазы (19 ч). Культуральную жидкость охлаждают до 4°С и центрифугируют на центрифуге Sorval-3c при 6000 об/Мин 30 мин. Выход сырой
биомассы 5 г с 1 л купьтуральной жид- кости. Биомассу хран т при -20°С.
Дл выделени фермента 1 г биомассы суспендируют в 6 мл буфера А (20 мМ трис-HCl; рН 7,5; 10 мМ 2-мер- каптоэтанола, 0,1 мМ ЭДТА, 5% глицерина ), обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 50 W в течение
15
20
8 мин и центрифугирую при 18000 об/мин, ю 4000 ед./мл. Препарат фермента хра- 60 мин. Полученный басклеточный экстракт со скоростью 1 мл/мин нанос т на колонку размером 1,51 1,9 см с ДЭАЭ-трисакрилом (ДЕАЕ-Trisacrylm LKB, уравновешенную буфером А и подсоединенную к системе FPLC фирмы Pharmacia (Швеци ).
Колонку промывают тем же буфером и элюируют градиентом NaCl 0-0,5 М в буфере А. Общий объем градиента 35 мл. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,06-0,09 М NaCl, объедин ют , диализуют против буфера А и нанос т на колонку Моно Q HR 5/5 (Pharmacia), уравновешенную буфером А. Элюируют градиентом NaCl (0- 0,5 М) в буфере А. Общий объем градиента 20 мл. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,2-0,25 М NaCl, объедин ют, диализуют против буфера В (60 мМ КР04; рН 7,4; 10 мМ 2-мерпатоэтанола; О,1 мМ ЭДТА; 5% глицерина) и нанос т на колонку Моно S HR 5/5 (Pharmacia), уравновешенн т при -20°С. Выход фермента соста л ет 5000 ед./г сырой биомассы.
Таким образом, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом: не требует дл культивирова ни сложной питательной среды и превосходит его по продуктивности в 10 раз (5000 ед./г сырой биомассы против 450 ед./г сырой биомассы).
Кроме того, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) хорошо растет на простой питательной среде и обладает коротки временем культивировани : за 19 ч накапливает 5 г сырой биомассы/л культуральной жидкости.
Claims (1)
- 30 Формула изобретениШтамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 - продуцент рестри тазы Btu-I изошиэомера С1а I.25ную буфером В. Элюируют градиентом NaCl (0-0,5 К) в буфере В. Общий объем градиента 20 мл. Наиболее активные фракции,.элюируемые при 0,32- 0,38 М NaCl, концентрируют диализом против буфера В с 50% глицерина и 50 мК NaCl. Получают 1,25 мл препарата рестриктазы Btu-I с активностью4000 ед./мл. Препарат фермента хра-н т при -20°С. Выход фермента составл ет 5000 ед./г сырой биомассы.Таким образом, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом: не требует дл культивировани сложной питательной среды и превосходит его по продуктивности в 10 раз (5000 ед./г сырой биомассы против 450 ед./г сырой биомассы).Кроме того, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) хорошо растет на простой питательной среде и обладает коротким временем культивировани : за 19 ч накапливает 5 г сырой биомассы/л культуральной жидкости.30 Формула изобретениШтамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 - продуцент рестриктазы Btu-I изошиэомера С1а I.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884420991A SU1544802A1 (ru) | 1988-05-04 | 1988-05-04 | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884420991A SU1544802A1 (ru) | 1988-05-04 | 1988-05-04 | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1544802A1 true SU1544802A1 (ru) | 1990-02-23 |
Family
ID=21373157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU884420991A SU1544802A1 (ru) | 1988-05-04 | 1988-05-04 | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1544802A1 (ru) |
-
1988
- 1988-05-04 SU SU884420991A patent/SU1544802A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Штамм Caryophanon latum. Nucl. Acids Res, 1981, 9, 4833. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wood et al. | Integration of synthetic globin genes into an E. coli plasmid | |
| US5114853A (en) | Recombinant dna, transformant containing said dna, and process for preparing heat-stable glucose dehydrogenase by use of said transformant | |
| US4464471A (en) | Biologically engineered plasmid coding for production of β-glucosidase, organisms modified by this plasmid and methods of use | |
| HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
| SU1544802A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера | |
| US5061628A (en) | Restriction endonuclease FseI | |
| EP0164754A1 (en) | Process for producing N-acetylneuraminate lyase | |
| Frolova et al. | Amylases of the fungus Aspergillus flavipes associated with Fucus evanescens | |
| KR20090079570A (ko) | Ｇｍｐ 전환활성이 감소된 구아노신 모노포스페이트카이네이즈 변이체 | |
| US20020068349A1 (en) | Gene encoding recombinant trehalose phosphorylase, vector containing the gene, transformant transformed by the gene, and method for producing recombinant trehalose phosphorylase with the use of transformant | |
| SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
| CN112391364B (zh) | 一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| Lipeski et al. | Comparison of proteins involved in chondroitin sulfate utilization by three colonic Bacteroides species | |
| JP3557276B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| SU1095645A1 (ru) | Способ получени эндонуклеазы рестрикции | |
| RU2044054C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 110 ki | |
| RU2115728C1 (ru) | Штамм бактерии bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ggtnacc-3' | |
| RU2044055C1 (ru) | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki | |
| RU2313575C1 (ru) | ПЛАЗМИДА pNAN5, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ L-АСПАРАГИНАЗЫ ЕсА2, ШТАММ BACILLUS CEREUS 1576-pNAN5 - ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ЕсА2 И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | |
| SU1532583A1 (ru) | Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121 | |
| RU2044053C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco27k1 | |
| SU1712415A1 (ru) | Способ получени рестриктазы В @ AI | |
| KR20020097246A (ko) | Ｌ-리보오스 이소메라아제를 코드하는 ｄｎａ와 그 용도 | |
| SU1514774A1 (ru) | Штамм бактерий мокахееба брес1еб продуцент саит-специфической эндонуклеазы μ,,,αι |