RU2044055C1 - Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki - Google Patents
Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki Download PDFInfo
- Publication number
- RU2044055C1 RU2044055C1 RU93036452A RU93036452A RU2044055C1 RU 2044055 C1 RU2044055 C1 RU 2044055C1 RU 93036452 A RU93036452 A RU 93036452A RU 93036452 A RU93036452 A RU 93036452A RU 2044055 C1 RU2044055 C1 RU 2044055C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- azeanae
- kaz
- enzyme
- restriction endonuclease
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология для получения эндонуклеазы рестрикции KaZ 48KI, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-PuGGNC!CPy-3′ Рестриктаза, продуцируемая предлагаемым штаммом, является ложным изошизомером рестриктазы 2ra II и может найти применение в генно-инженерных исследованиях. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Klebsiellaazeanal ВКМ В-2008Д выделен из клинических изолятов (г.Киев) и обеспечивает высокий уровень содержания фермента не менее 400000 ед.на 1 г сырого вещества биомассы клеток. Выход очищенного фермента составляет 10000-12000 ед/г биомассы клеток.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий Klebsiella azeanae, который может быть и использования для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-PuGGNC!CPy-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Kaz48kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является ложным изошизомером известной рестриктазы DraII и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.
Известны изошизомеры рестриктазы DraII, выделенные из различных штаммов: Deinococcus radiophillus, Vibrio nereis, Escherichia coli H709c.
Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм Escherichia coli H709c, продуцирующий рестриктазу Есо01091, которая является истинным изошизомером рестриктазы DraII, и узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов ДНК 5'-PuG!GNCCPy-3' [1] Выход очищенного фермента Есо0109 составляет 3000 ед на 1 г биомассы клеток.
Задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на стандартных питательных средах.
Предлагаемый штамм Klebsiella azeanae 48k был получен в результате целенаправленного поиска штаммов продуцентов рестриктаз среди клинических изолятов (г. Киев) при помощи разработанного нами метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде, с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Kaz48кI в предлагаемом штамме 400000-500000 единиц/на грамм сырой биомассы клеток.
Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2008Д.
Штамм Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д имеет следующие характеристики.
Культурально-морфологические признаки.
Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, неподвижны. Располагаются одиночно, парами или цепочками. Грамотрицательные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные.
Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, с ровными краями, сероватого цвета, величиной 1-1,5 мм в диаметре. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть. Кроме этого, штамм может расти на синтетических средах, например М9 (в г/л: NaH2PO4 6, KH2PO4 3, NaCl 0,5, NH4Cl 1, глюкоза 4, казаминовые кислоты 0,2).
Физиолого-биохимические признаки.
Клетки растут в пределах от 4 до 50оС, оптимальная температура роста 37оС, оптимум рН 6,8-7,4. Факультативный анаэроб. В качестве источника углерода используют многие углероды. Лактозу, сахарозу, глюкозу и магннит сбраживают с образованием кислоты и газа. Лизин не декарбоксилируют, образуют уреазу, реакция по аргининдигидролазе положительная. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Индол не образуют. При росте H2S не выделяют.
Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LВ (6% агар) под вазелиновым маслом.
Штамм бактерий Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LВ (6% агар) под вазелиновым маслом.
П р и м е р 1. Тестирование ферментов рестрикции. Для поиска рестриктазы использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт. [2] Для этого одну-две большие колонии (около 5 х 106 1 х 107 клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18оС). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), и инкубируют еще 60 мин при 4оС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага диаметр 80 vir в 40 мкл буфера С (10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37оС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.
П р и м е р 2. Получение и очистка рестриктазы. Культуру клеток Klebsiella azeanae 48k выращивают в 1 л LВ-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37оС до титра 2 х 109 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2оС (48000). Для определения активности рестриктазы Kaz48kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 45оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.
За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. Уровень активности рестриктазы Kaz48kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма Klebsiella azeanae, около 400000-500000 ед в пересчете на 1 г сырой биомассы. Рестриктаза Kaz48kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE целлюлозой (DE-52 Whatman) и фосфоцеллюлозой Р-11 (Whatman) с последующей хроматографией на гидроксилапатите и ДЕ-сферодексе (Рharmacia). Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против буфера: 100 мМ NaCl; 20 мМ трис-HCl (рН 7,6); 7 мМ 2-меркаптоэтанол; 1 мМ ЭДТА, 50% глицерин. Выход очищенного фермента составляет 10000-12000 ед на 1 г сырой биомассы. Очищенный фермент стабилен при -20оС в течение полугода. При +20оС рестриктаза Kaz48kI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дней, при +37оС 50% в течение 14 дней, при +65оС 95% в течение 60 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.
П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Kaz48kI и места гидролиза ДНК. Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность 5'-PuGGNCCPy-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда: 2816, 28798, 48474, 48502. Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Kaz48kI на ДНК pBR322, используя совместный гидролиз рестриктазами: PstI и Kaz48kI, EcoRI и Kaz48kI, BamHI и Kaz48kI, CfrBI и Laz48kI, EcoRII и Kaz48kI.
Показано, что рестриктаза Kaz48kI гидролизует эту ДНК в позициях: 525σ, 1440, 1482, 44345. Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Kaz48kI была использована ДНК pBR322. После отжига с синтетическим праймером (ccw HindIII-16 mer) и реакции полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Kaz48kI. Часть пробы вторично подвергают полимеризации и оба полученных препарата исследуют в условиях, предложенных Simcon с соавторами [3] Четыре стандартные секвенирующие реакции проводят согласно протоколу Sanger с соавторами [4]
Таким образом, проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Kaz48kI является ложным изошизомером рестриктазы DraII и узнает последовательность нуклеотидов: -5'-PuGGNC!CPy-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Kaz48kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции: рН 7,8-8,0; 45оС; 0-50 мМ NaCl.
Таким образом, проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Kaz48kI является ложным изошизомером рестриктазы DraII и узнает последовательность нуклеотидов: -5'-PuGGNC!CPy-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Kaz48kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции: рН 7,8-8,0; 45оС; 0-50 мМ NaCl.
Таким образом, полученный штамм Klebsiella azeanae ВКМ В-2008В, как продуцент специфической эндонуклеазы Kaz48kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 400000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 10000-12000 ед. на г биомассы клеток, что 4 раза превышает выход известной рестриктазы Есо0109, выделенной из штамма E coli Н709с, являющегося прототипом предлагаемого.
Claims (1)
- Штамм бактерий Klebsiella azeanae ВКМ В-2008 D продуцент эндонуклеазы рестрикции Kaz 48 К1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93036452A RU2044055C1 (ru) | 1993-07-15 | 1993-07-15 | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93036452A RU2044055C1 (ru) | 1993-07-15 | 1993-07-15 | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2044055C1 true RU2044055C1 (ru) | 1995-09-20 |
RU93036452A RU93036452A (ru) | 1996-07-10 |
Family
ID=20145118
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93036452A RU2044055C1 (ru) | 1993-07-15 | 1993-07-15 | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2044055C1 (ru) |
-
1993
- 1993-07-15 RU RU93036452A patent/RU2044055C1/ru active
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
1. Mize K. and Nakajima k. "Restriction endonuclease Eco 0109 from Escherichia coli H 709c with heptanucleotide recognition site 5'-PuG ! GNCCPy-3', Gene, 1985, 36, 363-367. * |
2. Белавин П.А. и Дедков В.С. Прикладная биохимия и микробиология, 1988, 24, 6, 129-132. * |
3. Simcon T.G., Marsj S.J. et al., Gene, v.109, 121-123, 1991. * |
4. Sanger F., Nicklen S. et al, Proc. Nate. Acad. Sci. USA, v.74, 5463-5467. 1977. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4561010B2 (ja) | D−ヒダントインハイドロラーゼをコードするdna、n−カルバミル−d−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするdna、該遺伝子を含む組み換えdna、該組み換えdnaにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、d−アミノ酸の製造方法 | |
FR2559781A1 (fr) | Nouveau vecteur plasmidique hybride de e. coli conferant le pouvoir de faire fermenter le saccharose et son procede de preparation | |
RU2044055C1 (ru) | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki | |
US4430432A (en) | Endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof | |
RU2044053C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco27k1 | |
RU2044054C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 110 ki | |
RU2053298C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 75 ki | |
RU2070925C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 71 ki | |
RU2038382C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции cfrbi | |
RU2054037C1 (ru) | Рекомбинатная плазмидная днк peco29ki, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции eco29ki и штамм escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco29ki | |
SU1761803A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II | |
DK157562B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af mindst to deoxyribonukleaser | |
SU1678832A1 (ru) | Штамм бактерий LастовасILLUS рLаNтаRUм - продуцент рестриктазы LP @ | |
RU2287012C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Glacial ice bacterium I - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Gla I | |
SU1761804A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS coaGULaNS - продуцент рестриктазы Всо AI | |
SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
SU1095645A1 (ru) | Способ получени эндонуклеазы рестрикции | |
SU1678833A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы В @ 1 | |
SU1738853A1 (ru) | Способ получени биомассы MIcRococcUS LUтеNS ВКПМ В-2836 продуцента рестриктазы MLU 1 | |
SU1532583A1 (ru) | Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121 | |
RU2270859C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Bisi | |
SU1650697A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I | |
RU2177998C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
SU1707077A1 (ru) | Способ получени рестриктазы BSp DI | |
RU2054042C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк eco 1831ki, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикации eco 1831ki, штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 1831ki |