SU1738853A1

SU1738853A1 - Способ получени биомассы MIcRococcUS LUтеNS ВКПМ В-2836 продуцента рестриктазы MLU 1

Info

Publication number: SU1738853A1
Application number: SU894732948A
Authority: SU
Inventors: Лидия Леонидовна Корсун; Леонид Рудольфович Лебедев
Original assignee: Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ
Priority date: 1989-08-28
Filing date: 1989-08-28
Publication date: 1992-06-07

Abstract

Использование: биотехнологи . Сущность изобретени ; провод т предварительное пассирование посевного материала на агаризованной среде, содержащей ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, и селективный отбор наиболее продуктивных клонов бактерий путем анализа их на содержание целевого фермента. Способ озвол - ет в 12-15 раз повысить содержание целевого фермента в биомассе. 1 табл. If, С

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частности к получению биомассы дл производства эн- донуклеазы рестрикции.

При получении рестриктаз важным этапом вл ютс стадии оптимизации селекции и культивировани штаммов-продуцентов с целью достижени более высокого выхода изучаемых ферментов.

Выход рестриктаз и неспецифическое нуклеазное загр знение в значительной мере обусловлены составом питательной среды и услови ми выращивани штамма-продуцента.

Эти данные свидетельствуют об отсут- СТЁИИ обобщенной теории биосинтеза рестриктаз , что обуславливает эмпиричность в подборе условий культивировани штам- мов-лродуцентов.

Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ получени биомассы

Micrococcus luteus, вклвд ающий выращива-. ние культуры при 37° с интенсивной аэрацией в среде, содержащей, г/л воды: бактопептон 10; дрожжевой экстракт 5; NaCI 5; глюкоза 1, до оптической плотности А260 1. Выход биомассы .с 1 л среды 4 г. Выход фермента из 1 г клеток после двух хроматографических стадий (фосфоцеллю- лоза Р-11 и ДЕАЕ-целлюлозаДЕ-52)800ед. акт.

Недостатком известного способа вл етс низкое содержание рестриктазы Mlu I в биомассе.

Цель изобретени - повышение содержани рестриктазы Mlu I.

Поставленна цель достигаетс тем. что способ получени биомассы Micrococcus luteus ВКПМ В-2836 - продуцента рестриктазы Mlu I предусматривает приготовление посевной культуры на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки ДНК из тиNJ со

OQ ОС СЛ Ы

муса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, последующий селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы Mlu I и минимальным загр знением неспецифическими иуклеазами, засев отобранным клоном жидкой питательной среды и выращивание в оптимальных услови х.

При реализации этого способа достигаетс уровень содержани фермента Mlu в грубом экстракте клеток 12000-15000 ед. акт./г влажных клеток. После проведени двух стадий очистки (фосфоцеллюлоза Р-11 и ДЕ АЕ-целлюлоза ДЕ-52) из 1 г клеток получают 10000-12000 ед. акт. очищенного фермента Mlu I. В качестве контрол провод т пассирование и селекцию посевного материала на средах без ДНК и с добавлением ДНК в различных концентраци х.

Результаты опытов представлены в таблице .

Проведены следующие исследовани :

анализ клонов на содержание рестриктазы Mlu I при пассировании на средес ДНК (перва дорожка - 5 мин инкубации, втора - 30 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мкг ДНК фага л мбда );

анализ клонов на содержание рестриктазы Mlu I при пассировании на среде без ДНК (контроль, перва дорожка - 5 мин инкубации, втора - 60 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мк ДНК фага ламбда);

анализ биомасс М. luteus на содержание рестриктазы Mlu I, полученных с пассированием на среде без ДНК, с пассированием на среде с ДНК. В пробы добавл ли соответственно клеточного лизата 0,5(а); 1,0(6); 2,0(в); 3,0(г); 5,0(д); 10.0(е): 0,025(ж); 0,05(3); 0.1 (и); 0,15(к); 0,25(л) и 0,75(м) мкл, инкубировали с 0,5 мкг ДНК фага л мбда в течение 1 ч при 37°С.

Из полученных данных установлено, что картина полного специфического гидролиза ДНК рестриктазой наблюдаетс в первой биомассе на дорожке в, что соответствует содержанию фермента 1000 ед. акт./r клеток , во второй - на дорожке к, что соответствует содержанию фермента 13500 ед. акт./г клеток (т. е. выше, чем в первой в 2,0/0,,4 раза). Причем во втором случае при п тикратном избытке (дорожка м) сохран етс картина рестрикции, тогда как в первом при том же избытке {дорожка е) наблюдаетс размывание фрагментов ДНК,

Пример 1. Пассирование и селекци посевного материала.

Штамм М. luteus (коллекционный номер в ВКПМ В-2836) рассевают на агариэованную среду (рыбный питательный ,агар), содержащую ДНК тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл. Выращивают в течение 18 ч при 37°С. Затем из нескольких отдельных

колоний (из 8-12) отбирают петлей половину материала и перенос т в отдельные пробирки , содержащие по 200 мкл буфера дл разрушени следующего состава: 100 мМ трис-HCI/ рН 8,0; 50 мМ NaCI; 0,1%-ный

Тритон Х-100; 0,01%-ный лизоцим. Полученные лизаты (после инкубации при 4°С в течение 30 мин) используют дл определени количества рестриктазы и неспецифического нуклеазного загр знени (по реакции расщеплени ДНК фага л мбда). Дл этого по 5 мкл лизата каждого клона инкубируют с 0,5 мкг ДНК в инкубационной смеси в течение 5 и 30 (60) мин. Затем продукты

расщеплени раздел ют электрофорезом в геле агарозы. Колонии, содержащие максимальный уровень рестриктазы при минимальном загр знении неспецифическими нуклеазами, используют дл культивировани (контрольный опыт со средой без ДНК

при необходимости, выполн ют идентично).

Пример 2. Получение биомассы.

Отобранный клон клеток засевают в 50

мл питательной среды дл получени инокул та . После инкубации на качалке при 200- 220 об/мин в течение 18 ч при 37°С полученным инокул том засевают объем среды (качалочные колбы с 250 мл среды), предназначенный дл культивировани , из

расчета 1 мл инокул та на 100 мл среды. Инкубируют в тех же услови х в течение 18 ч. Затем после охлаждени клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин. Выход биомассы: 4,1-4,3 г с 1 л среды. Содержание фермента 12000-15000 ед. акт./г влажных клеток.

Claims

Формула изобретени Способ получени биомассы

Mlcrococcus luteus ВКПМ В-2836 - продуцента рестриктазы Mlu I, предусматривающий приготовление посевной культуры на твердой питательной среде, содержащей добавку, засев ею жидкой питательной среды , выращивание в оптимальных услови х, отделение клеток, отличающийс тем, что, с целью повышени содержани рестриктазы , посевную культуру готов т на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл среды, и перед засевом провод т селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы Mlu I и минимальным загр знением неспецифическими нуклеазами.