CN116694540B - 一株大肠埃希氏菌及其在生产苏氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）cglzh1003，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏日期为2022年8月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.25466。本发明采用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1003，发酵结束后L‑苏氨酸的含量显著提高、副产物L‑异亮氨酸的含量极低，更易于L‑苏氨酸的提取纯化，大大增加了苏氨酸产品的一次合格率，该菌株具有良好的稳定性，培养基简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株大肠埃希氏菌及其在生产苏氨酸中的应用。
背景技术
L-苏氨酸是人体必需氨基酸之一，是构成蛋白的重要组成部分，具有恢复人体疲劳、促进生长发育的效果，广泛应用于食品、饲料和医疗等方面。在食品方面，苏氨酸是一种重要的食品强化剂，可提高食品中蛋白质的营养价值，使食品中营养成分更加充足合理，苏氨酸与葡萄糖加热后可产生焦香和巧克力香味，具有增香作用；在饲料方面，苏氨酸是猪饲料的第二或第三限制性氨基酸，是家禽饲料的第三或第四限制性氨基酸，在动物体内具有极其重要的生理作用，如促进生长、提高免疫机制等，在饲料中添加苏氨酸能精确平衡饲料的氨基酸组成，降低饲料粗蛋白水平，提高饲料中氮的利用率，降低饲料成本；在医学方面，苏氨酸具有恢复人体疲劳、促进人体发育和抗脂肪肝的疗效，也是制造高效抗生素单酰胺菌素的中间体，苏氨酸在人体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。
到目前为止，苏氨酸的生产方法有蛋白质水解法、化学合成法和微生物发酵法。蛋白质水解法和化学合成法通常操作复杂，污染严重，产率低，成本高，一般不适合大规模生产苏氨酸。而微生物发酵法由于具有生产成本低、资源利用率高、环境污染小等优点，现已成为工业化生产苏氨酸的主流方法。长期以来，市场对苏氨酸的需求持续稳定增长，特别是在饲料添加剂、食品添加剂、等方面的用量快速增长。但是目前发酵法生产苏氨酸仍然存在菌种不稳定、发酵杂酸较多的问题，时常出现发酵生产异常，使苏氨酸的生产成本居高不下，发酵杂酸较多也一直影响着产品质量，时常出现产品含量不合格要进行返工提纯的操作，浪费人力物力，增加生产成本。因此，选育优良稳定的L-苏氨酸生产菌株对工业生产具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产苏氨酸中的应用。
本发明提供一株大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）cglzh1003，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2022年8月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCCNo.25466。
本发明还提供一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）cglzh1003（下面简称为“大肠埃希氏菌cglzh1003”）发酵生产L-苏氨酸。使用该菌株进行发酵生产L-苏氨酸，发酵液中具有较高的L-苏氨酸含量和较低的副产物L-异亮氨酸含量。
采用大肠埃希氏菌cglzh1003发酵生产L-苏氨酸，包括如下步骤：
（1）斜面培养：将保藏的大肠埃希氏菌ecozh1003活化至固体斜面培养基，37℃培养24h；
（2）摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种于摇瓶液体培养基中，置于回旋式摇床37℃培养，摇床转速200rpm；
（3）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基内培养；
（4）发酵培养：将培养至对数生长期的种子液接种于发酵培养基中发酵培养；
（5）提取纯化：将发酵液提取纯化得到L-苏氨酸晶体。
所述种子培养控制条件为：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%。
所述发酵培养控制条件为：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L。
所述具体提取纯化步骤如下：
（1）膜过滤：将发酵液经过膜过滤，去除菌体，得到含有L-苏氨酸的过滤清液，膜孔径50~100nm；
（2）蒸发浓缩结晶：使用蒸发结晶设备对含有L-苏氨酸的过滤清液进行蒸发浓缩，控制温度和流量，通过蒸发水分使L-苏氨酸从谬液中析出结晶，得到L-苏氨酸晶浆；
（3）离心分离：将L-苏氨酸晶浆通过离心机进行离心分离，去除晶浆中的母液，得到L-苏氨酸湿晶体，母液回收处理；
（4）干燥：将L-苏氨酸湿晶体进行干燥得到L-苏氨酸产品。
所述的固体斜面培养基包括蔗糖1~2 g/L、磷酸氢二钠1~5 g/L、磷酸氢二钾1~5g/L、蛋白胨10~15 g/L、氯化钠1~5 g/L、琼脂粉15~25 g/L。
所述的摇瓶液体培养基包括蔗糖30~50 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、硫酸铵10~20g/L、硫酸镁0.1~5 g/L、多肽粉2~5 g/L、蛋白胨1~10 g/L。
所述的种子培养基包括蔗糖30~50 g/L、硫酸铵5~20 g/L、磷酸二氢钾1~3 g/L、硫酸镁0.2~2 g/L、多肽粉3~10 g/L、酵母浸粉5~10 g/L。
所述的发酵培养基包括蔗糖60~100 g/L、硫酸铵15~30 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、硫酸镁0.1~5 g/L、多肽粉3~5 g/L、玉米浆干粉10~20 g/L。
本发明的有益效果为：本发明通过大量诱变筛选试验，获得一株L-苏氨酸高产大肠埃希氏菌ecozh1003，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25466，经过检测鉴定，该菌株具有独特的生理和生化特性，可在科研、工业生产等领域进行应用。本发明中生产L-苏氨酸的大肠埃希氏菌ecozh1003，发酵结束后L-苏氨酸的含量有了显著提高、副产物L-异亮氨酸的含量极低，更易于L-苏氨酸的提取纯化，大大增加了苏氨酸产品的一次合格率，该菌株具有良好的稳定性，并且培养基简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产，具有较好的实际应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
下述实施例中，若未特别指明，所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中的试剂和材料为市场或其他公共渠道获得。
一株大肠埃希氏菌ecozh1003，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25466。
实施例1
一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌ecozh1003发酵生产L-苏氨酸，包括如下步骤：
S1）斜面培养：将保藏的大肠埃希氏菌ecozh1003活化至固体斜面培养基，37℃培养24h；固体斜面培养基包括蔗糖1~2 g/L、磷酸氢二钠1~5 g/L、磷酸氢二钾1~5 g/L、蛋白胨10~15 g/L、氯化钠1~5 g/L、琼脂粉15~25g/L。
S2）摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种于摇瓶液体培养基中，置于回旋式摇床37℃培养，摇床转速200rpm；摇瓶液体培养基包括蔗糖30~50 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、硫酸铵10~20 g/L、硫酸镁0.1~5 g/L、多肽粉2~5 g/L、蛋白胨1~10 g/L。
S3）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基内培养，种子罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%;所述的种子培养基包括蔗糖30~50 g/L、硫酸铵5~20 g/L、磷酸二氢钾1~3g/L、硫酸镁0.2~2 g/L、多肽粉3~10 g/L、酵母浸粉5~10 g/L。
S4）发酵培养：将培养至对数生长期的种子液接种于发酵培养基中发酵培养，发酵罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L，发酵培养结束得到含有L-苏氨酸的发酵液; 发酵培养基（g/L）为蔗糖60~100、硫酸铵15~30、磷酸二氢钾1~5、硫酸镁0.1~5、多肽粉3~5、玉米浆干粉10~20。
S5）提取纯化：将含有苏氨酸的发酵液经过提取纯化后得到L-苏氨酸的晶体，具体步骤如下：
（1）膜过滤：将含有L-苏氨酸的发酵液经过膜过滤，去除菌体，得到含有L-苏氨酸的过滤清液，膜孔径50~100nm；
（2）蒸发浓缩结晶：使用蒸发结晶设备对含有L-苏氨酸的过滤清液进行蒸发浓缩，控制温度和流量，通过蒸发水分使L-苏氨酸从谬液中析出结晶，得到L-苏氨酸晶浆；
（3）离心分离：将含有大量L-苏氨酸晶体的晶浆通过离心机进行离心分离，去除晶浆中的母液，得到L-苏氨酸湿晶体，母液回收处理；
（4）干燥：将L-苏氨酸湿晶体进行干燥得到L-苏氨酸产品。
通过使用30 L发酵罐培养，培养结束发酵液中L-苏氨酸含量为182.69 g/L、副产物L-异亮氨酸含量为0.02g/L，经过提取纯化，得到L-苏氨酸晶体3699.48g，L-苏氨酸晶体中副产物L-异亮氨酸含量小于0.01%。
实施例2
一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌ecozh1003发酵生产L-苏氨酸，包括如下步骤：
S1）斜面培养：将保藏的大肠埃希氏菌ecozh1003活化至固体斜面培养基，37℃培养24h；固体斜面培养基（g/L）为蔗糖1~2、磷酸氢二钠1~5、磷酸氢二钾1~5、蛋白胨10~15、氯化钠1~5、琼脂粉15~25。
S2）摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种于摇瓶液体培养基中，置于回旋式摇床37℃培养，摇床转速200rpm；摇瓶液体培养基（g/L）为蔗糖30~50、磷酸二氢钾1~5、硫酸铵10~20、硫酸镁0.1~5、多肽粉2~5、蛋白胨1~10。
S3）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基内培养，种子罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%;所述的种子培养基（g/L）为蔗糖30~50、硫酸铵5~20、磷酸二氢钾1~3、硫酸镁0.2~2、多肽粉3~10、酵母浸粉5~10。
S4）发酵培养：将培养至对数生长期的种子液接种于发酵培养基中发酵培养，发酵罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L，发酵培养结束得到含有L-苏氨酸的发酵液; 发酵培养基（g/L）为蔗糖60~100、硫酸铵15~30、磷酸二氢钾1~5、硫酸镁0.1~5、多肽粉3~5、玉米浆干粉10~20。
S5）提取纯化：将含有苏氨酸的发酵液经过提取纯化后得到L-苏氨酸的晶体，具体步骤如下：
（1）膜过滤：将含有L-苏氨酸的发酵液经过膜过滤，去除菌体，得到含有L-苏氨酸的过滤清液，膜孔径50~100nm；
（2）蒸发浓缩结晶：使用蒸发结晶设备对含有L-苏氨酸的过滤清液进行蒸发浓缩，控制温度和流量，通过蒸发水分使L-苏氨酸从谬液中析出结晶，得到L-苏氨酸晶浆；
（3）离心分离：将含有大量L-苏氨酸晶体的晶浆通过离心机进行离心分离，去除晶浆中的母液，得到L-苏氨酸湿晶体，母液回收处理；
（4）干燥：将L-苏氨酸湿晶体进行干燥得到L-苏氨酸产品。
通过使用50立方发酵罐培养，培养结束发酵液中L-苏氨酸含量为176.32 g/L、副产物L-异亮氨酸含量为0.02g/L，经过提取纯化，得到L-苏氨酸晶体5.95t，L-苏氨酸晶体中副产物L-异亮氨酸含量小于0.01%。
实施例3
诱变筛选方法
以大肠埃希氏菌MG1655变种为出发菌，经过多轮硫酸二乙酯（DES）化学诱变、常压室温等离子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP ）诱变处理，同时结合结构类似物抗性定向筛选，筛选获得具有L-苏氨酸高产并且副产物L-异亮氨酸含量较低的菌株。
硫酸二乙酯（DES）化学诱变方法：将大肠埃希氏菌斜面活化，接种于肉汤培养基中，37℃ 200r/min培养12h，然后用pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，磷酸缓冲液均匀悬浮后取4mL，在装有16mL pH7.0磷酸缓冲液的250mL带玻璃珠三角瓶中加入0.2mL DES原液，37℃恒温震荡诱变30min，加入Na2S2O3终止反应，摇匀，取1mL转入肉汤培养基进行中间培养，37℃200r/min振荡培养过夜，离心，洗涤，弃去上清液，收集菌体，稀释后分别涂布基本营养培养基平板和抗性平板。
ARTP诱变选育方法：从新鲜活化斜面上挑取一环菌种于种子培养基中，180 r/min、37 ℃ 摇床培养4 h，取1 mL种子液于1.5 mL EP管，4000 rpm离心，去除上清液，加入1mL生理盐水，混匀，反复三次，将菌悬液稀释，使菌悬液OD600为0.6~1.0；取10 µL 稀释菌液均匀涂到无菌不锈钢载片上，ARTP 诱变条件：射频功率120 W，处理距离2 mm，载气流量10SLM (Standard liters per minute)，处理温度为室温（20~40 ℃），诱变处理时间选择致死率达到90%以上的处理时间。将处理过的载片放入装有1 mL 无菌生理盐水的EP管中，震荡混匀，然后稀释到10-1、10-2倍，取100 µL均匀涂布到平板上，每个梯度做两个平行，37 ℃培养48 h。
抗性菌株筛选方法：用接种环从诱变后的平板中取一满环菌种于无菌离心管中，用无菌水离心洗涤两次，然后悬于无菌水中制成菌悬液，按浓度梯度制备一系列的β-羟基正缬氨酸、邻甲基-L-苏氨酸、α-甲基蛋氨酸抗性培养基平板，直接将菌悬液分别涂布于抗性平板上，37 ℃培养2～3 d。根据出发菌株耐受结构类似物的浓度确定诱变菌株筛选用结构类似物浓度，随机挑选生长菌落进行筛选。
菌种初筛：将种子培养基分装到96孔板中，每个0.1mL，将平板上的单菌落挑到种子液孔板中，180 r/min，37 ℃培养18h，并同时接种到另一块平板上，37℃ 培养22 h后放入冰箱。将发酵培养基分装到孔板中，每个0.09 mL，种子液接0.015 mL，180 r/min，37℃培养24 h。挑取发酵结束L-苏氨酸含量较高并且副产物L-异亮氨酸含量较低的菌株，将平板上对应序号的菌种挑至斜面，37℃ 培养24 h，甘油管保存。
菌种复筛：将初筛甘油管保藏的菌种分别划一支斜面，37℃培养24 h。从斜面上挑一环菌至500 mL种子摇瓶中，180 r/min，37℃培养18 h，转接500 mL发酵摇瓶，180 r/min，37℃培养24 h，测发酵液中L-苏氨酸含量和L-异亮氨酸含量，挑取L-苏氨酸含量较高并且副产物L-异亮氨酸含量较低的菌种保存。
遗传稳定性试验：
将上述筛选获得的菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代。摇瓶传代方法：把菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至发酵摇瓶培养。选择遗传稳定的菌株用于进一步研究。
将最终获得的一株L-苏氨酸高产菌株ecozh1003再连续传种十次，使用30L发酵罐培养考察其L-苏氨酸的产量及副产物L-异亮氨酸产量。结果如下：
表1 菌株ecozh1003的遗传稳定性
从表1中可以看出，突变菌株ecozh1003的遗传稳定性良好，连续传代10次在30L发酵罐培养结束的L-苏氨酸产量均保持较高水平，并且波动很小，同时副产物L-异亮氨酸含量均保持极低水平，菌株ecozh1003的遗传稳定性良好。
对比实验：
使用本发明中的大肠埃希氏菌ecozh1003和原菌株ATCC13032变种，结合本发明中的相关工艺分别进行30L罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如下表：
表2 突变菌株和出发菌发酵性能比较
从表2中可以看出，本发明中的菌株ecozh1003相比出发菌在发酵结束后L-苏氨酸产量有了较大提高，而副产物L-异亮氨酸产量则大幅降低，菌株ecozh1003生产L-苏氨酸的能力得到了较大提升，并且副产物L-异亮氨酸大量减少，应用于苏氨酸工业化生产，更易于L-苏氨酸的提取纯化，大大增加了苏氨酸产品的一次合格率，可以产生较好的经济效益，具有良好的工业化应用前景。
对该菌株进行传代保藏，命名为大肠埃希氏菌ecozh1003，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25466，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌ecozh1003的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列（其基因序列如SEQ NO.1所示）等项目进行了检测鉴定，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》以及International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，菌株编号ecozh1003的鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。
本发明所述的大肠埃希氏菌ecozh1003及其在发酵生产苏氨酸中的应用，菌种稳定性大大提高，L-苏氨酸产量有了较大提高，同时发酵液中的副产物L-异亮氨酸含量极低，采用该菌种发酵生产L-苏氨酸，L-苏氨酸产量较高而副产物L-异亮氨酸含量极低，应用于苏氨酸工业化生产，更易于L-苏氨酸的提取纯化，大大增加了苏氨酸产品的一次合格率，减少返工率，大大降低生产成本，可以产生较好的经济效益，该菌种工艺具有显著先进性，并且发酵原材料简单易得、工艺控制简单、生产技术水平稳定，更易于工业化生产推广。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (10)
1.一株大肠埃希氏菌，其特征在于：所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）cglzh1003，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2022年8月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCCNo. 25466。
2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：采用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）cglzh1003发酵生产L-苏氨酸。
3.根据权利要求2所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：采用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）cglzh1003发酵生产L-苏氨酸，包括如下步骤：
（1）斜面培养：将保藏的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1003活化至固体斜面培养基，37℃培养24h；
（2）摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种于摇瓶液体培养基中，置于回旋式摇床37℃培养，摇床转速200rpm；
（3）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基内培养；
（4）发酵培养：将培养至对数生长期的种子液接种于发酵培养基中发酵培养；
（5）提取纯化：将发酵液提取纯化得到L-苏氨酸晶体。
4.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：所述发酵液提取纯化的具体步骤如下：
（1）膜过滤：将发酵液经过膜过滤，去除菌体，得到含有L-苏氨酸的过滤清液，膜孔径50~100nm；
（2）蒸发浓缩结晶：使用蒸发结晶设备对含有L-苏氨酸的过滤清液进行蒸发浓缩，控制温度和流量，通过蒸发水分使L-苏氨酸从谬液中析出结晶，得到L-苏氨酸晶浆；
（3）离心分离：将L-苏氨酸晶浆通过离心机进行离心分离，去除晶浆中的母液，得到L-苏氨酸湿晶体，母液回收处理；
（4）干燥：将L-苏氨酸湿晶体进行干燥得到L-苏氨酸产品。
5.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：固体斜面培养基包括蔗糖1~2 g/L、磷酸氢二钠1~5 g/L、磷酸氢二钾1~5 g/L、蛋白胨10~15 g/L、氯化钠1~5 g/L、琼脂粉15~25 g/L。
6.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：摇瓶液体培养基包括蔗糖30~50 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、硫酸铵10~20 g/L、硫酸镁0.1~5 g/L、多肽粉2~5 g/L、蛋白胨1~10 g/L。
7.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：种子培养基包括蔗糖30~50 g/L、硫酸铵5~20 g/L、磷酸二氢钾1~3 g/L、硫酸镁0.2~2 g/L、多肽粉3~10 g/L、酵母浸粉5~10 g/L。
8.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：发酵培养基包括蔗糖60~100 g/L、硫酸铵15~30 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、硫酸镁0.1~5 g/L、多肽粉3~5 g/L、玉米浆干粉10~20 g/L。
9.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：种子培养控制条件为：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%。
10.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：发酵培养控制条件为：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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