CN111197014B

CN111197014B - 谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用

Info

Publication number: CN111197014B
Application number: CN201911242679.4A
Authority: CN
Inventors: 郑炜; 张国龙; 王孟华; 沈联兵; 蔡卫国; 郭程程; 金鑫
Original assignee: Yichang Sanxia Punuoding Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yichang Sanxia Punuoding Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: CN111197014A

Abstract

本发明公开了谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用，该菌株于2019年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019695。本发明以现有菌株谷氨酸棒状杆菌为出发菌，经过复合诱变筛选得到诱变菌株，经全基因测序，获得的新菌株具有一些特定的突变基因序列。采用诱变菌株生产L‑异亮氨酸，在一定条件下培养、发酵，其产酸水平显著提高，杂酸也明显减少，通过摇瓶配方中添加抗生素抑制回复突变，使得该菌株能稳定传代，提高了工艺的稳定性。

Description

谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，具体为一种谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其在高产L-异亮氨酸中的应用。

背景技术

L-异亮氨酸是三支链氨基酸(BCAA)之一，也是人体必须氨基酸之一，广泛用于医药、食品、保健品、饲料等领域。常见的工业生产方法有水解提取法、微生物发酵法，其中用于大规模生产最广泛的方法是微生物发酵法。当前国内生产水平和生产规模与国外还有不小差距，且产品质量较国外也有差距，主要受限于菌种能力和发酵配方水平。菌种能力主要体现在产酸水平不高，杂酸产生较多，菌株传代后易退化等。

发明内容

本发明提供一种谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用，其谷氨酸棒状杆菌原始菌株为出发菌，通过复合诱变筛选得到诱变菌株，该菌株能稳定传代，相比原始菌株，能大大提高L-异亮氨酸生产水平。

本发明的技术方案是，一种谷氨酸棒状杆菌诱变菌株，该菌株于2019年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2019695。

进一步地，该菌株的包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

进一步地，对该菌株进行斜面培养传代时，向斜面培养基中加入新霉素，加入量为0.5-2μg/mL，优选1μg/mL。

本发明还涉及所述谷氨酸棒状杆菌诱变菌株在生产L-异亮氨酸中的应用。

进一步地，采用保藏号为CCTCC NO：M2019695的谷氨酸棒状杆菌诱变菌株进行三级培养发酵，生产L-异亮氨酸，具体包括一级种液培养、二级种液培养和发酵培养，发酵培养基中加入生长因子。

进一步地，所述的生长因子加入量为发酵培养基的0.01％。

进一步地，所述一级种液培养时，培养基配方按重量百分比计，为葡萄糖2.5％，玉米浆4.0％，硫酸铵1.0％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.06％，酵母浸膏0.5％，pH在7～8。

进一步地，所述二级种液培养时，培养基配方按重量百分比计，为葡萄糖3.0％，玉米浆4.0，豆油0.3％，硫酸铵2.2％，硫酸镁0.04％，硫酸铵2.0％，磷酸二氢钾0.1％，片碱0.05％，泡敌0.001％和酵母浸膏0.2％。

进一步地，所述发酵培养基按重量百分比计，为葡萄糖3.5％，玉米浆2.0％，豆油0.05％，硫酸铵1.5％，硫酸镁0.04％，尿素0.06％，磷酸二氢钾0.08％，片碱0.05％，泡敌0.001％，生长因子0.01％，其余为饮用水。

进一步地，发酵培养时，发酵时间为60小时。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明以公司现有菌株谷氨酸棒状杆菌为出发菌，经过复合诱变筛选得到诱变菌株(CCTCCNO：M2019695)，经全基因测序，获得的新菌株具有一些特定的突变基因序列。

2、研究发现，该诱变菌株摇瓶异亮氨酸产酸水平最高可达到32g/L，较出发菌株提高约20％。生产上通过三级培养发酵，20t发酵罐规模产酸水平可稳定达到35g/L，较出发菌提高约20％，杂酸由出发菌的25％降低至17％左右，可大大降低提取难度，提高提取收率。

3、该诱变菌株在斜面培养传代至3代以后，诱变产生的正向突变效果逐渐衰退，至第6代以后，几乎恢复至出发菌株水平。为诱变菌株在斜面培养中发生回复突变，经过试验，在斜面培养基中加入0.5-2μg/ml的新霉素，可防止菌株回复突变，使得该正向突变稳定传代。

4、通过向发酵培养基中加入少量的生长因子，可促进菌体生长和增加异亮氨酸积累，相应的降低了杂酸的比例，从而降低分离提纯的难度。

附图说明

图1是实施例1中出发菌与得到的诱变菌株的部分序列比对图。

图2是实施例1中出发菌与得到的诱变菌株的另一部分序列比对图。

图3是实施例2中随着发酵时间的变化异亮氨酸积累浓度曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐明本发明。

实施例1：

将公司原有出发菌株谷氨酸棒状杆菌YZYC I-2018-10-I-10悬浮液在15W紫外灯下距离15cm处理30s，然后将诱变的菌液在0.8mg/ml的亚硝基胍(NTG)溶液体系下诱变7min，诱变菌液通过抗性筛选平板筛选，获得诱变菌株，该菌株于2019年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019695，分类命名为corynebacteriumglutamicum2019-07-I-04。

使用Nanopore测序仪，通过新一代基于纳米孔的单分子实时电信号ONT测序技术对出发菌株和诱变菌株分别进行全基因组测序，其中诱变菌株的部分核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，出发菌株谷氨酸棒状杆菌YZYC I-2018-10-I-10的部分核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

通过序列比对发现，经过诱变后，出发菌YZYC I-2018-10-I-10主要在全基因组的第34712～39408位，长度为4697bp的区间内发生碱基突变，其余部分无明显变异。该段的核苷酸序列是基因组中的高度可变区，与出发菌YZYC I-2018-10-I-10的生物功能联系十分紧密，其中两者从第34700～39500位的序列比对如图1和2所示。其中1.seq为突变菌株测序结果；1-1.seq为出发菌株测序结果。

采用本发明得到的诱变菌株生产异亮氨酸，其摇瓶异亮氨酸产酸水平可达到28～32g/L，较出发菌株提高约20％。但该菌株在斜面培养传代至3代以后，诱变产生的正向突变效果逐渐衰退，至第6代以后，几乎恢复至出发菌株水平。为抑制突变株在斜面培养中发生回复突变，经过试验，在每传3代以后，向斜面培养基中加入新霉素，可防止菌株回复突变，使得该正向突变稳定传代。

在诱变菌株传代至第4代时，向斜面培养基中加入不同浓度的新霉素，同样条件下培养，L-异亮氨酸产酸量如下表1，优选斜面培养基中加入1μg/ml新霉素防回复突变。

表1

	0μg/ml	0.5μg/ml	1μg/ml	2μg/ml
					新霉素	27g/L	29g/L	32g/L	27g/L

实施例2：诱变菌株的应用

采用该诱变菌株进行三级培养发酵，具体方法为：

一级种子液制备：

带刺三角瓶、培养基灭菌，用接种环或铲挑取斜面上适量的菌种，接入制备好的培养基中，放入恒温培养振荡器(摇床)内，30℃恒温条件下培养64～80小时。

二级培养

种子罐、培养基、接种用具、罐上接种口以及接种口周围环境进行灭菌，接种，通入无菌空气，控制罐压0.05～0.2MPa，罐温25～35℃，风量10～80m³/h，溶氧量5～100％，培养周期15～30h。

发酵培养：

发酵罐培养基进行灭菌，降温至25℃～35℃后调节种子罐罐压高于发酵罐罐压，以压差下将种子液转入发酵罐，控制罐压，0.10MPa，温度30℃左右，通过调节搅拌和通气量控制溶氧50％，中途补加氨水控制pH在7～8，补加葡萄糖控制含糖量在1.5％～5％，发酵时间60h。

发酵完成后，发酵液经膜过滤，离子交换，浓缩结晶等工序得到异亮氨酸产品。

其中，一级种液培养基的配方组成为：葡萄糖2.5％，玉米浆4.0％，硫酸铵1.0％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.06％，酵母浸膏0.5％，控制pH在7～8。

二级种液培养基的配方组成为：葡萄糖3.0％，玉米浆4.0，豆油0.3％，硫酸铵2.2％，硫酸镁0.04％，硫酸铵2.0％，磷酸二氢钾0.1％，片碱0.05％，泡敌0.001％，酵母浸膏0.2％。

发酵培养基组成为：葡萄糖3.5％，玉米浆2.0％，豆油0.05％，硫酸铵1.5％，硫酸镁0.04％，尿素0.06％，磷酸二氢钾0.08％，片碱0.05％，泡敌0.001％，生物素(生长因子)0.01％，其余为饮用水。

20t发酵罐规模产酸水平可稳定达到35g/L，较出发菌提高约20％，杂酸由出发菌的25％降低至17％左右，可大大降低提取难度，提高提取收率。

发明人通过试验发现，在发酵培养基中添加少量的(0.01％)生长因子，可促进菌体生长和增加异亮氨酸积累，相应的降低了杂酸的比例，从而降低分离提纯的难度。可有效减少杂酸的产生。结合诱变前后的菌株和相同培养基添加或不添加生长因子，设计对比试验，经检测发酵液，产酸和杂酸水平如下表2所示。

表2

	产酸水平	杂酸水平
			出发菌种，未加生长因子	2.8g/100ml	25％
出发菌种，加生长因子	3.0g/100ml	22％
			诱变后菌种，未加生长因子	3.2g/100ml	20％
诱变后菌种，加生长因子	3.5g/100ml	17％

对诱变菌株经过三级培养，在20t发酵罐下培养产生异亮氨酸随时间变化趋势如图3所示，从图3可以看出，发酵前30小时异亮氨酸迅速积累至25g/L，60小时时积累达到最高峰，约为35g/L，继续延长发酵时间异亮氨酸反而有减少趋势，因此可确定最佳发酵时间为60小时。

本发明中涉及的异亮氨酸含量测定，采用高效液相测定，具体处理是将发酵液于8000g下离心5分钟，取上清液用1μm微孔滤膜过滤，流动相稀释，然后进行检测。

检测条件为：缓冲液：0.2M磷酸二氢钠，用磷酸调pH至2.8

流动相：乙腈：缓冲液(2:98)

色谱柱：HP-C18 4.6mm×150mm；3μm(或性能相当的色谱柱)

柱温：40℃

流速：0.5ml/min，

检测器：UV 210nm

进样体积：20μl

运行时间：15min。

序列表

<110> 宜昌三峡普诺丁生物制药有限公司

<120> 谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 4697

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）

<400> 1

atgaccatta gagaagttga aaccccggcg cgccctgttc cgcggccact 50

tgatcttggt ttgctgtggg gagctttcat ccggtcgctgccgatcgcat 100

tactaattgg tgtgcttgct ggcggtgcaa cgtatttcat ccaagatggc 0150

gaaccccctg tgtacgaggt gacgtcgacg gtgtcgctcg gtgtgttatc 0200

tgatgcggat atccctgatt ggatcgttgc tcgcgcagag ccgatgtatt 0250

tggacatggc tcaagatcga gaaacaattg agcaggtgag cgcggtgact 0300

ggcgtgcagg atccggtgat cagcgccgaa tcgggggatg tgcagggagt 0350

catattgatc tctgcggaag gtgcggatgt cgcgcaggcg cggtcgcttg 0400

tcgacgagac cgtcatgact cttatccgtc gcagtgccag aatgcatgag 0450

acggcgatgt ttgcggctag tacccagtcg gagcagctta ctgcaccgtt 0500

gcgcgcgcaa atagctgcac gtcagttgga agatccgctg gctgatatta 0550

gtgaccttga gtgggaaatc cagctgattg ctcgagagat tgagacgtca 0600

attcctgagg ttgttccacc agtccaggtg tctcaaacag acaatgatgg 0650

ggagccagtt cgtccgcaac ctttaaatac agcacttgtg gttggaatgg 0700

ctgctggttt gatcgcgttg ctgccactta tctggtggaa ttttagcaac 0750

ccacgaaaag ttggccgcat gtggttgcgg ggacttcgta atcgctacgg 0800

cgtggacaca gaggcggcat cttttgctcg ttccattagt cctctcgcgg 0850

aggcgcgtgc tgtgcagtcg ctttccaccg gtgggatggt gttgttgttg 0900

ggccagtcag gatcgcttgt cgaacttgaa ggctcaggtc gtgttcatca 0950

gggtgattgg tttgatccgt ggtggcgtga agttccaccg aatgaggtgg 1000

gattagccat tgtcactgtg gaaaaacgtt ccaagaaact ccgtgacatt 1050

gagaagttag ttgctcatct cacgggcatg ggaatcccca ccatggtggc 1100

ttttaacaat aaggaggaaa ataatggctc gcatagcaat cgctcatgag 1150

cgatggacgg acattgcaag cagtgagcag gtcacccagc agttgactaa 1200

aacctggtca gaaacatacg ttcatgtacc ttttgctaag aaatcgttga 1250

ttccagagga tcttcgagac agttttcata tcagtccact ccaggtggcc 1300

taccaattaa tcaggcagcg cacctatgcg cccttgctcc ccttggtgcc 1350

acctgccatg cagtggggaa gcctgcggca ggctcacgac gtcgatgcgg 1400

ttgttgttag ccaccatgca tttgcgctcg ctgctgttgg tgcagcccaa 1450

gccattaaca agccgtctgt ggcttatgtt cattcaccag ccaggtgggc 1500

gtgggatgca cgttttcggc aggaagagaa ccgcagcaag gcagggaagg 1550

cagcgttagc agtgttgtcg gcgcgggctc gggcaaatga aactagatgg 1600

gcacctcatg tgacgagcat cgtgggcaac tcctcggctg tggtgaaaag 1650

gattgagcag cattggaacc gagaggctca ggttgttcat ccaccagtag 1700

atactgagtt ttttcacccc gatgaggcca ttgaaaaggg ggattacttc 1750

atctctgtgg gacgtttggt tccgtacaag caggtgcctt taggggtggc 1800

tgctgcggtt gccgcaggcg tccggttagt cgttgtcggt gatggtcgcg 1850

atatggatcg tgcgcgtgct tttgccggtc caaacgtgga gttcaagggg 1900

cgactgcccg gcgatgaaat gcgtgatctc atccgcggtg cccgtgcgct 1950

gcttatgccg ggtgaagagg actttggaat cgtgccggta gaagctatgg 2000

cctgcggtac cccggtgatc gccctaggca aaggtggcgc actagacaca 2050

gtcaagccag gaatcagcgg tgaactcttc tcaggagatg gggagaaaga 2100

agtcatcgct aacctggctg aagtgttgaa aaactttgat gattcccgct 2150

tcaatatctc cacgttaagg aactgggcgg agggtttttc tgaagcagcg 2200

tttcgggaga agatggccga ggttgttgac gcggtcgttt agagcatttc 2250

tgcgtagacc tgcgcagttg accgtgcagt ggcttgccaa tttagagagg 2300

caacctgcag ggtcgcgtcg tcaagcaaac tgctgcggaa ggcagcatca 2350

ttaagcgccg cagacaagct cgcccgccac tcgctcgtgc gcaatcgctt 2400

tacgacgcaa gcgccggatc ctaccgcctc cggaatgccg cccacggcgc 2450

tggcaacgac gaccgcaccg caggccatcg cctccaccgg aggcagccca 2500

aacccttcat aagaagacgc ataagcaacc acgctcgcag cacgatacaa 2550

cgccgggata tcttcacgat ccacatatcc caacccaatt gaacctgccg 2600

gacgcttcgg cccatcagta cccccaccag caagaaccag cggcacgccc 2650

aagccccgca acgcatcatt aaccacatca gggcgtttac gcggctccaa 2700

cgtacccaac tgaaacacaa aacgtttggg caaattgtac ttttcccgca 2750

cccgattcac actggcctca tcaggaatat gcgtccacgc agcaggcgct 2800

aggggagtaa ccgtggaatc ccgccccgtc aacgccttga tccgctccgc 2850

ggtgaactga gacaccgcaa tgatcgaatc cgcacgcttt aatgacctgc 2900

gaagcaacag ctgctcaccg cgcgcccgaa acttcgacat cgcccaggga 2950

gtatcaaaaa ccgacatgtc atgcaccgta gaaaccgtca agcccttttg 3000

cgcaagcggc agatcgacat caagcgaatg aaacagcgtt gccggtaccg 3050

gccgcagccc ctccacagcc cggcgcgtac cagaacctac cggccgcgtc 3100

acaggtttta cctccggtgg gagggcacca acactgtcct tttgcaccac 3150

cgcagaaaac gacggcagcc cctccacctt ggtgagtgca tggatgagct 3200

cacgctgata ggtttgcaca ccgctgccat gagggcgtag cgctagagca 3250

ccaaagacga ttgatgtcat cctcccgtgc ccttcaaaac agcacgcaca 3300

gtcagaagca aaatcttcac atccaaccaa atagaccaat gctcgatgta 3350

ccaattgtca tactcagcac gagttttgat gctggtatcg cccctcagac 3400

cattgatggc agcccaaccc gtcaaaccaa ccggcacgcg gtgacgatcg 3450

tggtaaatcg ggtaatcggc accgaacttc tcaacaaagt gagggcgttc 3500

cggacgaggt cccaccaagg tcatatcccc gcgcaaaaca ttcaaaatct 3550

gaggaagctc atcaagagaa aacttccgca tgatgcgatt caacggcgtt 3600

aaccgatcat cgtgcgatac attccatgtc acatcagact cattcaccgt 3650

cgctggcgtt aaagtgcgaa acttcagtag ctcaaaaggt tttccatcca 3700

agccgatacg agtctgacgg aacaacaacg gattacgtgg agaatccaac 3750

ttcaccagca ccgcgagcac cgccatcaaa ggagacaaca aaatcatggc 3800

aaacagcgac aaagcgatat caatcggccg tttcaacagc caccagaccg 3850

agcgataagc cgaacgcttc acaggccgga gcgagatgag ccctaattct 3900

tcagtgtcat gtctttgccc ctgaagagga agcgcgggca cgacataaaa 3950

ggtagttgga tcacgaaggg aagcacggaa cgcactgaga agaaactctt 4000

cagaatgctg actcggtgcc acgattacaa catcagcctc atgacgttgc 4050

aataattccg tgaggttatc cgaaaaatag tctgtttcca cttcgggaaa 4100

tttttccgat gctgcttgcg actccaaatc aatgatagcc acgggcgaca 4150

acccaaactg cgggttttcc tttaacgttg tcacgatctc tacggaatca 4200

tcagcggacc ccaacaccag cgtgcgatgc aaagaaatag gtgcgtggcg 4250

ccgccaggaa cgaatagctg caaagctcag tgcccaagaa attatcaggc 4300

caattgtgct gaccacaatg aaatcaaacg aatccctcgc atcgacgtgc 4350

ggattgacca caatgtatgc gaagaacccg acaattaagg ctcggggcac 4400

aactgtgggt aacgcgttga gtagagacag attaagccga tgccggtaga 4450

aatctggaag aacctgcaaa atgatgacca tcaccaatgc tgtgatccac 4500

ggcgatggga tatcgacaat ccaggcagac agaaaaatag ctacggtatc 4550

caacactcga tgtataaatt tagaaaagcg ggtgtacttc gctgctacgt 4600

gcctagcggt gcggggtatg gcctgccggt gtagagggcg gatatttgga 4650

gcaaagcgcg ctagccgact acctgtcgga aatgcttccg tgctcat 4697

<210> 2

<211> 4697

<212> DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）

<400> 2

ctgaccatta gagaagttga aacccgagcg cgccctgttc cgcaaccact 50

tgatcttggt ttgctgaagg gagctttcat ccggtcgagg ccgatcgcat 100

tactaattgg tgtgcttgct ggcggtgcaa cgtatttcat ccaagatggc 150

gaaccccctg tgtacccttg aacgtcgacg gtgtcgctcg gtagagtatc 200

tgatgcggat atccctgatt ggatcgttgc tcgaacagag ccgatgtatt 250

tggacatggc tcaagatcga gagggaattg agcaggtgag cgcggtgact 300

ggcgtgcagg atccggtgat cagcgccgaa tcgggccgtg tgcagggagt 350

catattgcaa cctgcggaag gtgcggatgt cgcgcaggcg cggtcgcttg 400

tcgacgagtc cgtcatgact cttatccgtc gcagtgccag aatgcatgag 450

acggcgatgt ttgcttctag tacccagtcg gagcagctta ctgcaccgtt 500

gcgcgcgcaa atagctgctc gtcagttgga agatccgctg gctgatatta 550

gtgaccttga gtggttaatc cagctgattg ctcgagagat tgagacgtca 600

attcctgagg ttgttccacc agtccaggtg tctcaggcag acaatgatgg 650

cgagccagtt cgtccgcaac ctttaaatac agcacttgtg gttggaatgg 700

ctgatggttt gatcgcgttg ctgccactta tcaagtggaa ttttagcaac 750

ccacgaaaag ttggccgcat gtggttgcgg ggacttcgta atcgctacgg 800

cgtggacaca gaggcggcat cttttgctcg ttccattagt cctctcgcgg 850

aggcgcgtgc tgtgcagtcg ctttccaccg gtgggatggt gttgttgttg 900

ggccagtctc caacgcttgt cgaacttgaa ggctcaggtc gtgttcatca 950

gggtgattgg tttgatccgt ggtgaagtga agttccaccg aatgaggtgg 1000

gattagccat tgtcactgtg gaaaaacgtt ccatgaaact caaagacatt 1050

gagaagttag ttgctcatct cacgggcatg ggaatcccca ccatggtggc 1100

ttttaacaat aaggaggaaa ataatggctc gcatagcaat cgctcatgag 1150

cgatggacgg acattgcaag cagtgagcag gtcacccagc agttgactaa 1200

aacctggtca gaaacatacg ttcatgtacc ttttgctaag aaatcgttga 1250

ttccagagga tcttcgagac agttcccata tcagtccact ccaggtggcc 1300

taccaattaa tcaggcagcg cacctatgcg cccttgctcc ccttggtgcc 1350

aactagatgg cagtggggaa gcctgcggca ggctcacgac gtcgatgcgg 1400

ttgttgttag ccaccatgca tttgcgctcg ctgctgttgg tgcagcccaa 1450

gccattaaca agccgtctgt ggcttatgtt cattcaccag ccaggtgggc 1500

gtgggatgca cgttaacggc aggaagagaa ccgcagcaag gcagggaagg1550

cagcgttagc agtgttgtcg gcgcgggctc gggcaaatga aactagatgg 1600

gcacctcatg tgacgagcat cgtggttaac tcctcggctg tggtgaaaag 1650

gattgagcag cattggaacc gagaggctca ggttgttcat ccaccagtag 1700

atactgagtt taaacacccc gatgaggcca ttgaaaaggg ggattacttc 1750

atctctgtgg gacgtttggt tccgtacaag caggtgcctt taggggtggc 1800

tgctgcggtt gccgcaggcg tccggttagt cgttgtcggt gaccgcttcg 1850

atatggatcg tgcgcgtgct tttgccggtc caaacgtgga gttcaagggg 1900

cgactgcccg gcgatgacat gcgtgatctc atccgcggtg cccgtgcgct 1950

gcttatgccg ggtgaagagg actttggaat cgtgcaagta gaagctatgg 2000

cctgcggtac caaaatgatc gccctaggca aaggtggcgc actagacaca 2050

gtcaagccag gaatcagcgg tgaactcttc tcaggagatg gggagaaaga 2100

agtcatcgct aacctggctg aagtgttgaa aaactttgat gattccttct 2150

tcaatatctc cacgttaagg aactgggcgt tgggtttttc tgaagcagcg 2200

tttcgggaga agatggccga ggttgttgac gcggtcgttt atagcatttc 2250

tgcgtagacc tgcgcagttg accgtgcagt ggcttgccaa tttagagagg 2300

caacctgcag ggtcgcgtcg tcaagcaaac tgctgcggaa ggcagcatca 2350

tggatagccg cagacaagct cgcccgccac ttgctcgtgc gcaatcgctt 2400

tacgacgcaa gcgccggatc ctaccgcctc cggaatgccg cccacggcgc 2450

tggcaacgac gaccgcaccg tttgccatcg cctccaccgg aggcagcctg 2500

gacccttcat aagaagacgc ataagcaacc acgctcgcag cacgatacaa 2550

cgccgggata tcttcacgat ccacatgact caacccaatt gaacctgccg 2600

gacgcttcgg cccatcagta cccccaccag caagaacctg cggttggccc 2650

aagccccgca acgcatcatt aaccacatca gggcgtttac gcggctccaa 2700

cgtacccaac tgaaacacaa aacgtttggg caaattgtac ttaagccgca 2750

cccgattcac actggcctca tcaggaatat gcgtccacgc agcaggcgct 2800

aggggagtaa ccgtggaatc ccgccccgtc aacgccttga tccgctccgc 2850

ggtgaactga gacaccgcaa tgatcgaatc cgcacgcttt aatgacctgc 2900

gaagtttgcg ctgctcaccg cgcgcccgaa acttcgacat cgcccaggga 2950

gtatcaaaaa ccgacatgtc atgcaccgta gatttcgtca agcccttttg 3000

cgcaagcggc agatcgacat caagcgaatg aaacagcgtt gccggtaccg 3050

gccgcagcac ctccacagcc cggcgcgtac cagaacctac cggccgcgtc 3100

acaggtttta cctccggtgg gagggcacca acactgtcct taagcaccac 3150

cgcagaaaac gacggcagcc cctccacctt ggtgagtgca tggatgagct 3200

cacgctgata ggtttgcaca ccgctgccat gagggcgtag cgctagagca 3250

ccaaagacga ttgatgtcat cctcccgtgc ccttcaaaac agcacgcaca 3300

gtcattagca aaatcttcac atccaaccaa atagaccaat gctcgatgta 3350

ccaattgtca tactcagcac gagttttgat gctggtatcg cccctcagac 3400

cattgatggc agcccaaccc gtcaaaccaa ccggtacgcg gtgattttcg 3450

tggtaaatcg ggtaatcggc accgaacttc tcaacaaagt gagggcgttc 3500

cggacgaggt cccaccaagg tcatatcccc gcgcaaaaca ttcaaaatct 3550

gaggaagctc atcaagagaa aacttccgca tgatgcgatt caattgcgtt 3600

aaccgatcat cgtgcgatac attccatgtc acatcagact cattcaccgt 3650

cgctggcgtt aaagtgcgaa acggcagtag ctcaaaaggt tggccatcca 3700

agccgatacg agtctgacgg aacaacaacg gattacgtgg agaatccaac 3750

ttcaccagca ccgcgagcac cgccatcaaa ggagacaaca aaatcatggc 3800

aaacagcgac aaagcgatat caatcggccg tttcaacagc caccagaccg 3850

agcgataagc cgaacgcttc acaggccgga gcgagatgag ccctaattct 3900

tcagtgtcat aaagaaatag ctgaagagga agcgcgggca cgacataaaa 3950

ggtagttgga tcacgaaggg aagcacggaa cgcactgaga agaaactctt 4000

cagaatgctg actaaatgcc acgattacaa catcagcctc atgacattgc 4050

aataattccg tgaggttatc cgaaaaatag tctgttaaca cttcgggaaa 4100

tttttccgat gctgcttgcg actccaaatc aatgatagcc acgggcgaca 4150

acccaaactg cgggttttcc tggaacgttg tcacgatctc tacggaatca 4200

tcagcggacc ccaacaccag cgtgcgatgc aaagacctag gtgcgtggct 4250

gggccaggaa cgaatagctg caaagctcag tgcccaagaa attatcaggc 4300

caattgtgct gaccacaatg aaatcaaacg aatccctcgc atcgacgtgc 4350

ggattgacca caatgtatgc gaagaacccg acaattaagg ctcgttgcac 4400

aactgtgggt aacaaattga gtagagacag attaagccga tgccggtaga 4450

aatctggaag aacctgcaag gtgatgacca tcacttatgc tgtgatccac 4500

ggcgatggga taaagacaat ccaggcagac agaaaaatag ctacggtatc 4550

caacactcga tgtcccaatt tagaaaagcg ggtgtacttc gctgctacgt 4600

gcctagcggt gcggggtatg gcctgccggt gtagagaacg gatataagga 4650

gcaaagcgcg ctagccgact acctgtcgga cctgcttccg tgctcgg 4697

Claims

1.一种谷氨酸棒状杆菌诱变菌株，其特征在于，该菌株于2019年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019695；该菌株的部分核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述谷氨酸棒状杆菌诱变菌株在异亮氨酸20t发酵罐规模产酸水平稳定达到35g/L，杂酸降低至17%，对该菌株进行斜面培养传代时，每传3代后向斜面培养基中加入新霉素，加入量为0.5~1μg/mL。

2.权利要求1所述谷氨酸棒状杆菌诱变菌株在生产L-异亮氨酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：采用保藏号为CCTCC NO：M2019695的谷氨酸棒状杆菌诱变菌株进行三级培养发酵，生产L-异亮氨酸，具体包括一级种液培养、二级种液培养和发酵培养，发酵培养基中加入生长因子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的生长因子加入量为发酵培养基的0.01%～0.02%。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述一级种液培养时，培养基配方按重量百分比计，为葡萄糖2.5%，玉米浆4.0%，硫酸铵1.0%，碳酸钙0.3%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.06%，酵母浸膏0.5%，其余为饮用水， pH在7～8。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述二级种液培养时，培养基配方按重量百分比计，为葡萄糖3.0%，玉米浆4.0，豆油0.3%，硫酸铵2.2%，硫酸镁0.04%，硫酸铵2.0%，磷酸二氢钾0.1%，片碱0.05%，泡敌0.001%和酵母浸膏0.2%，其余为饮用水。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基按重量百分比计，为葡萄糖3.5%，玉米浆2.0%，豆油0.05%，硫酸铵1.5%，硫酸镁0.04%，尿素0.06%，磷酸二氢钾0.08%，片碱0.05%，泡敌0.001%，生长因子0.01%，其余为饮用水。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：发酵培养时，发酵时间为60小时。