CN109609408B - 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents

一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109609408B
CN109609408B CN201811617317.4A CN201811617317A CN109609408B CN 109609408 B CN109609408 B CN 109609408B CN 201811617317 A CN201811617317 A CN 201811617317A CN 109609408 B CN109609408 B CN 109609408B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gamma
polyglutamic acid
fermentation
strain
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811617317.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109609408A (zh
Inventor
刘元元
杨传伦
徐泽平
吴文雷
刘海玉
傅英旬
和富明
张心青
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Original Assignee
Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd filed Critical Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Priority to CN201811617317.4A priority Critical patent/CN109609408B/zh
Publication of CN109609408A publication Critical patent/CN109609408A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109609408B publication Critical patent/CN109609408B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株γ‑聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ‑聚谷氨酸的方法，所提供的γ‑聚谷氨酸生产菌株为芽孢杆菌，经16S rDNA鉴定为一株枯草芽孢杆菌，菌株代码为YJY18‑11,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.16159。该菌株可应用于生产γ‑聚谷氨酸，该方法发酵所得γ‑聚谷氨酸含量可达40g/L以上。

Description

一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备 γ-聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该 菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子型的聚 氨基酸，分子量一般在10-2000kDa之间。是一种多功能的环保型生物高分子 材料。γ-聚谷氨酸水溶性、生物相容性、生物降解性等特点，得益于其主链上 含有的大量游离羧基。这些活性基团就容易发生交联、螯合、衍生化等反应。 在农业、环境治理、化妆品、医药、食品等领域具有广泛的应用前景。
自1937年Ivanovic等人发现炭疽芽孢杆菌的细胞荚膜中含有γ-聚谷氨酸 以来，众多学者相继开展了对γ-聚谷氨酸的研究。γ-聚谷氨酸获得方法有化 学合成法、提取法和微生物发酵法，利用微生物发酵生产聚谷氨酸的研究十分 活跃。目前已知的γ-聚谷氨酸生产菌株大多是芽孢杆菌属。包括地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、 耐热芽孢杆菌(B.thermotolerant)、碳疽芽孢杆菌(B.anthracis)和解淀粉芽 孢杆菌(B.anm Loliquefaciens)。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所产生的 γ-PGA能够分泌到细胞外部并积累到相对较高的浓度，近年来主要研究或投产 的工程菌一般都是此二者。
目前文献报道的大规模(500L发酵罐)的发酵生产γ-聚谷氨酸最高浓度一 般在35g/L左右，偶尔也有文献报道其采用的菌株在10L发酵罐中发酵γ-聚 谷氨酸最终浓度可达到50g/L以上或者更高，但是均未见在生产中可以实际应 用的报道出现，因此现有工业化生产γ-聚谷氨酸最高浓度一般在35g/L左右。 提高γ-聚谷氨酸的生产浓度、降低发酵成本是每个γ-聚谷氨酸生产厂家一直 研究的问题。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，通过液体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，利用该方法生产的γ-聚谷氨 酸为胞外代谢产物，所采用的菌株代码为YJY18-11，中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.16159；该菌株可应用于生产γ-聚 谷氨酸，该方法发酵所得γ-聚谷氨酸含量可达40g/L以上。
本发明提供的具体技术方案是：
首先获得了一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，该菌株的 菌株代码为YJY18-11，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏 号为CGMCCNo.16159，其具体获得方法如下：
(1)以包括多种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌等为原始菌 株，分类培养建立菌种库；
(2)以LB培养基为基础培养基，各菌株分别培养5天，检测γ-聚谷氨酸 含量，根据能否检测到γ-聚谷氨酸进行一级筛分，筛选了20个菌株，然后根据 γ-聚谷氨酸产生量筛选其中的4株产量最高的菌株作为驯化菌株；
(3)对该菌株的生理生化特性等进行比较深入的研究，最终筛选出一株产 γ-聚谷氨酸能力强、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株，将其命名为 YJY-01；
(4)以该菌株为出发菌株，采用常规诱变方法，如UV，DMS，MMS，NTG等， 结合低能离子注入法，反复多次诱变，复筛，最终获得了高产菌株YJY18-11；
发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生 物保藏，保藏编号为CGMCC No.16159，经检测其为存活状态。
上述高产γ-聚谷氨酸的菌株，其在LB平板培养基上的形态特征如下：
菌落呈圆形，突起，边缘整齐，无色到乳白色，半透明，表面光滑、粘稠， 能拉丝。
发明人同时对其进行了16S rDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示， 该序列为菌株YJY18-11的16S rDNA的全序列；所测得的16S rDNA序列进行BLSTN 比对，比对结果显示，菌株YJY18-11的16S rDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属 (Bacillus)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为芽 孢杆菌属(Bacillus)的5株菌株有100％的同源性，因而进一步确定本发明所 提供的菌株为一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株。
本发明的另一个目的是，提供利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌 株YJY18-11生产γ-聚谷氨酸的方法。
本发明所获得的菌株，可以应用于日常的生产当中，特别是可以应用于γ- 聚谷氨酸的生产，具体步骤主要包括枯草芽孢杆菌的发酵以及γ-聚谷氨酸的分 离和纯化步骤，其中在枯草芽孢杆菌的发酵中应用γ-聚谷氨酸产生和积累诱导 工序，所述的γ-聚谷氨酸产生和积累诱导工序具体步骤如下：
A.谷氨酸钠添加量优化：
γ-聚谷氨酸的产生与谷氨酸钠含量密切相关，添加合适的谷氨酸钠可以增 加γ-聚谷氨酸的含量；
B.谷氨酸钠使用方法：
谷氨酸钠添加入培养基中用于促进γ-聚谷氨酸的合成；在培养过程中通过 培养基质、补加、流加的方式补充谷氨酸钠；
C.发酵控制：
首先要用普通碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳源，通过不断 补料把菌体维持在半饥饿状态，从而加速γ-聚谷氨酸的合成。
其中所述的谷氨酸钠的添加量为5％-5.5％。
之所以谷氨酸钠作为诱导因子，主要是由于γ-聚谷氨酸是一种谷氨酸单体 通过γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子型的聚谷氨酸，发酵γ-聚谷氨酸所用菌株 为谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸生产菌株，需要在培养基中加入谷氨酸钠以促进γ- 聚谷氨酸的生产。发明人经过研究后发现针对本发明所述的菌株而言，要使其 产生γ-聚谷氨酸，诱导调控的方法主要通过三个方面：1、在培养基中加入谷氨 酸钠，在菌株生长初期补充，从而在氨基酸来源上直接给予菌体补充；2、在一 定生长期补充菌体生产γ-聚谷氨酸所需的原料—谷氨酸钠；3、在培养菌体生长 的某一阶段以流加的方式补加谷氨酸钠及葡萄糖等补充入菌体中促进菌体的生 长及γ-聚谷氨酸生产原料的补充，发明人发现通过上述三个方面的诱导，结合 对于发酵过程的参数条件控制，可以实现γ-聚谷氨酸产量的提高。
具体的生产步骤如下：
(1)枯草芽孢杆菌的发酵制备：
A.菌种活化；
B.液体种子制备；
C.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用液体深层发酵方法 生产得到枯草芽孢杆菌菌体；
其中发酵过程具体为：将液体种子以5-10％(v/v)的接种量接到发酵培养基 中，30-37℃培养15-20h，补加20％-30％碳源与无机盐培养基，总共培养65-80h；
(2)γ-聚谷氨酸的提取和纯化：
A.发酵液酸化
将上述发酵的发酵液调节pH 2-4；
B.γ-聚谷氨酸除菌浓缩工艺：
发酵液酸化后，离心，沉淀16-20h后，用微滤膜处理得到澄清液体；将除 菌后的发酵液，进行超滤浓缩，在浓缩过程中不断加入蒸馏水以缓解粘度大引 起膜过滤时的速度缓慢，最终将发酵液浓缩，浓缩液最终pH调节5.5-6.5。
C.γ-聚谷氨酸的纯化：
γ-聚谷氨酸浓缩液加入乙醇，沉淀去除上清，加入水溶，再次醇沉，沉淀， 冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸纯品。
其中所述酸化所用酸为硫酸、盐酸；调节最终超滤液的pH所用碱为KOH。
在上述工艺过程的基础上，更进一步的具体过程如下：
(1)菌种活化：将4℃条件下保存在LB培养基上的试管斜面菌种移至室温 条件下(20℃-25℃)活化4h-8h；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用无菌接种环接种1-3个单菌落于 装有灭菌LB培养基中，培养16h后将其转接到灭菌的种子培养基的三角瓶中， 培养温度30-37℃，转速160-200rpm，培养16-24h至对数生长期；
(3)发酵、诱导过程：将步骤(2)中的种子液以5-10％(v/v)的接种量接 种于发酵罐，500L发酵罐发酵培养基装液量为200-300L，发酵温度为30-37℃， 罐压0.01-0.05Mpa，转速300-400rpm，当发酵至15-20h后，开始流加培养基， 通过葡萄糖的反馈调节流加培养基的速度，控制葡萄糖的终浓度为0.1％-0.3％， 总发酵时间为65-80h；
(4)发酵液酸化
将上述发酵的发酵液调节pH 2-4；
(5)γ-聚谷氨酸除菌浓缩工艺：
发酵液酸化后，离心，沉淀16-20h后，用0.45-0.22um微滤膜处理得到澄 清液体；将除菌后的发酵液，进行超滤浓缩，在浓缩过程中不断加入蒸馏水以 缓解粘度大引起膜过滤时的速度缓慢，最终将发酵液浓缩到原体积的30％-50％， 浓缩液最终pH调节5.5-6.5；
(6)γ-聚谷氨酸的纯化：
γ-聚谷氨酸浓缩液按照体积比1:1.75-2.5比例加入乙醇，沉淀去除上清， 加入水溶解后，再次按照上述比例醇沉，沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸纯品。
其中菌株产γ-聚谷氨酸条件的确定，其方法如下：
(1)采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量和 培养时间，确定液体种子最佳培养条件和液体发酵最佳培养条件；
(2)采用单因子试验和正交试验，通过改变培养基的碳氮源和无机盐组成 确定该菌株液体种子最佳培养基组成和液体发酵的最佳培养基组成。
经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株、液体种子培养基组成及发酵 条件如下：
液体种子培养基组成(每升)为：葡萄糖15-30g/L，酵母膏5-10g/L，谷 氨酸钠15-30g/L，K2HPO4·3H2O 1.5-3g/L，MgSO4 0.25-0.5g/L，加蒸馏水至 1000mL，pH 7.0-7.5；
液体种子培养条件：接种量为每个三角瓶接种1-3个单菌落，培养温度30-37 ℃，摇床转速160-200rpm，培养时间为16-24h；
经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株液体发酵培养基组成和发酵条 件如下：
液体培养基(每升)组成：葡萄糖20-60g/L，谷氨酸钠30-70g/L，NH4Cl 5-20g/L，MnSO4·H2O 0.01-0.1g/L，MgSO40.01-0.2g/L，K2HPO4·3H2O 10-40 g/L，pH 7.5-9，加水至1000mL；
所述流加培养基：葡萄糖50-100g/L，磷酸氢二钾1-10g/L，硫酸镁0.1 -2g/L，氯化铵10-50g/L，谷氨酸钠50-100g/L，加水至1000mL；
液体发酵条件：种子液以5-10％(v/v)的接种量接种于发酵罐，500L发酵 罐发酵培养基装液量为200-300L，发酵温度为30-37℃，罐压0.01-0.05Mpa， 转速300-400rpm，当发酵至15-20h后，开始流加培养基，通过葡萄糖的反馈调 节流加培养基的速度控制葡萄糖的终浓度为0.1％-0.3％，总发酵时间为65-80h。
利用上述方法枯草芽孢杆菌发酵，液体发酵后γ-聚谷氨酸含量可达40g/L 以上。
经过上述提取和纯化过程所得γ-聚谷氨酸产品外观为白色粉末，可溶于 水。经液相色谱分析，证明为γ-聚谷氨酸(如附图1、2所示)，并检测γ-聚 谷氨酸含量，色谱峰为单一对称峰，含量为92.30％。
利用本发明所获菌株生产γ-聚谷氨酸具有以下优点：
1、利用该菌株工业化发酵制备γ-聚谷氨酸发酵水平达到40g/L以上，比 现有市场发酵水平的文献报道多5g/L以上，更加适合工业化发酵生产的需要；
2、该菌株的代谢产物γ-聚谷氨酸主要为胞外产物，可以通过有机溶剂纯 化，得到γ-聚谷氨酸，同时有机溶剂可以回收使用，减轻环境压力，同时也降 低生产成本；
3、该菌株为枯草芽孢杆菌，其菌体可以作为微生物菌剂使用，一般可以用 于生物菌肥、生防菌剂，提高土壤的肥效，提高植物的抗病能力，促使整个生 产过程没有固体废弃物产生，大大提高了发酵液的综合利用及其附加值，增加 了生产的收益。
综上所述，本发明提供了一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体 发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，该菌株可应用于生产γ-聚谷氨酸，该方法发酵 所得γ-聚谷氨酸含量可达40g/L以上。
保藏信息
保藏时间：2018年7月25日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.16159
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
分类命名:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
附图说明
图1为γ-聚谷氨酸标准品液相色谱分析结果示意图；
图2为本发明实施例1所获得的γ-聚谷氨酸液相色谱分析结果示意图；
图1为标准品谱图，基本无杂峰，说明纯度高；图2为实施例1中所得液 体样品测定结果，有杂峰，说明纯度相对低，但两个图的主峰出峰位置(保留 时间)是一致的，说明二者是同一物质，即所得样品为γ-聚谷氨酸。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详 细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于 本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施 例中均采用常规现有技术完成，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号CGMCC No. 16159的菌株。
菌株的获得：
一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，该菌株的菌株代码为 YJY18-11，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCCNo.16159，其具体获得方法如下：
(1)以包括多种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌等为原始菌 株，分类培养建立菌种库；
(2)以LB培养基为基础培养基，各菌株分别培养5天，检测γ-聚谷氨酸 含量，根据能否检测到γ-聚谷氨酸进行一级筛分，筛选了20个菌株，然后根据 γ-聚谷氨酸产生量筛选其中的4株产量最高的菌株作为驯化菌株；
(3)对该菌株的生理生化特性等进行比较深入的研究，最终筛选出一株产 γ-聚谷氨酸能力强、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株，将其命名为 YJY-01；
(4)以该菌株为出发菌株，采用常规诱变方法，如UV，DMS，MMS，NTG等， 结合低能离子注入法，反复多次诱变，复筛，最终获得了高产菌株YJY18-11；
发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生 物保藏，保藏编号为CGMCC No.16159，经检测其为存活状态。
上述高产γ-聚谷氨酸的菌株，其在LB平板培养基上的形态特征如下：
菌落呈圆形，突起，边缘整齐，无色到乳白色，半透明，表面光滑、粘稠， 能拉丝。
发明人同时对其进行了16S rDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示， 该序列为菌株YJY18-11的16S rDNA的全序列；所测得的16S rDNA序列进行BLSTN 比对，比对结果显示，菌株YJY18-11的16S rDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属 (Bacillus)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为芽 孢杆菌属(Bacillus)的5株菌株有100％的同源性，因而进一步确定本发明所 提供的菌株为一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株。
实施例1
一种液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，其具体步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃条件下保存的LB培养基上的试管斜面菌种移至室温 条件下活化4h；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用无菌接种环接种2个单菌落于装 有灭菌种子培养基的三角瓶中，培养温度30℃，摇床转速170rpm，培养时间24h；
种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏7g/L，谷氨酸钠19g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4 0.20g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.3，灭菌条件121℃，0.15Mpa， 灭菌20min。
(3)发酵、调控过程：将液体种子以7％(v/v)的接种量接到发酵培养基 中，500L发酵罐发酵培养基装液量为300L，罐压0.05Mpa，转速400rpm，32℃ 培养16h，开始流加补料培养基，通过葡萄糖的反馈调节流加培养基的速度，控 制葡萄糖的终浓度为0.15％，总发酵时间74h。
发酵培养基组成：葡萄糖30g/L，谷氨酸钠50g/L，NH4Cl 10g/L，MnSO4·H2O 0.03g/L，MgSO4 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 21g/L，加水至1000mL，pH 8.5，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
流加培养基：葡萄糖60g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化铵20 g/L，谷氨酸钠70g/L，加水至1000mL，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
发酵结束以后，发酵液γ-聚谷氨酸含量为43g/L。
(4)发酵液酸化：取3000mL上述发酵的发酵液用浓硫酸调节pH3.5；
(5)γ-聚谷氨酸除菌浓缩工艺：发酵液酸化后，4000r/min离心10分钟后， 沉淀16h，用0.45um微滤膜处理得到澄清液体；将除菌后的发酵液，用超滤膜 6000浓缩，在浓缩过程中将除菌液用蒸馏水稀释10倍，最终将发酵液浓缩到原 体积的30％，浓缩液最终pH调节6.0。
(6)γ-聚谷氨酸的纯化：γ-聚谷氨酸浓缩液按照1:1.75比例加入乙醇， 沉淀去除上清，加入1000mL水溶，再次按1:1.75的比例加入乙醇醇沉，沉淀， 冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸纯品115.46g，经HPLC法检测，含量达到89.5％。
实施例2
一种液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，其具体步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃条件下保存的LB培养基上的试管斜面菌种移至室温 条件下活化4h；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用无菌接种环接种2个单菌落于装 有灭菌种子培养基的三角瓶中，培养温度32℃，摇床转速180rpm，培养时间20h；
种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏8g/L，谷氨酸钠20g/L K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4 0.20g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.5，灭菌条件121℃，0.15Mpa， 灭菌20min；
(3)发酵、调控过程：将液体种子以5％(v/v)的接种量接到发酵培养基 中，500L发酵罐发酵培养基装液量为250L，罐压0.05Mpa，转速400rpm，32℃ 培养18h，开始流加补料培养基，通过葡萄糖的反馈调节流加培养基的速度，控 制葡萄糖的终浓度为0.1％，总发酵时间70h。
发酵培养基组成：葡萄糖50g/L，谷氨酸钠50g/L，NH4Cl 10g/L，MnSO4·H2O 0.03g/L，MgSO4 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，加水至1000mL，pH 8.5，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
流加培养基：葡萄糖55g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化铵20 g/L，谷氨酸钠70g/L，加水至1000mL，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
发酵结束以后，发酵液γ-聚谷氨酸含量为47g/L。
(4)发酵液酸化：取4000mL上述发酵的发酵液用浓硫酸调节pH3.0；
(5)γ-聚谷氨酸除菌浓缩工艺：发酵液酸化后，4000r/min离心10分钟后， 沉淀18h，用0.45um微滤膜处理得到澄清液体；将除菌后的发酵液，用超滤膜 6000浓缩，在浓缩过程中将除菌液用蒸馏水稀释12倍，最终将发酵液浓缩到原 体积的40％，浓缩液最终pH调节6.5。
(6)γ-聚谷氨酸的纯化：γ-聚谷氨酸浓缩液按照1:2.0比例加入乙醇，沉 淀去除上清，加入1500mL水溶，再次按1:2.0比例加入乙醇醇沉，沉淀，冷冻 干燥得到γ-聚谷氨酸纯品165.25g，经HPLC法检测，含量达到86.3％。
实施例3
一种液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，其具体步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃条件下保存的LB培养基上的试管斜面菌种移至室温 条件下活化4h；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用无菌接种环接种3个单菌落于装 有灭菌种子培养基的三角瓶中，培养温度35℃，摇床转速190rpm，培养时间16h；
种子培养基组成：葡萄糖18g/L，酵母膏8g/L，谷氨酸钠20g/L K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4 0.20g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0，灭菌条件121℃，0.15Mpa， 灭菌20min；
(3)发酵、调控过程：将液体种子以5％(v/v)的接种量接到发酵培养基 中，500L发酵罐发酵培养基装液量为300L，罐压0.05Mpa，转速400rpm，35 ℃培养17h，开始流加补料培养基，通过葡萄糖的反馈调节流加培养基的速度， 控制葡萄糖的终浓度为0.2％，总发酵时间65h。
发酵培养基组成：葡萄糖60g/L，谷氨酸钠60g/L，NH4Cl 10g/L，MnSO4·H2O 0.03g/L，MgSO4 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 25g/L，加水至1000mL，pH 8.0，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
流加培养基：葡萄糖70g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化铵20 g/L，谷氨酸钠70g/L，加水至1000mL，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
发酵结束以后，发酵液γ-聚谷氨酸含量为45g/L。
(4)发酵液酸化：取5000mL上述发酵的发酵液用盐酸调节pH3.0；
(5)γ-聚谷氨酸除菌浓缩工艺：发酵液酸化后，4000r/min离心10分钟后， 沉淀20h，用0.45um微滤膜处理得到澄清液体；将除菌后的发酵液，用超滤膜 6000浓缩，在浓缩过程中将除菌液用蒸馏水稀释15倍，最终将发酵液浓缩到原 体积的50％，浓缩液最终pH调节6.3。
(6)γ-聚谷氨酸的纯化：γ-聚谷氨酸浓缩液按照1:2.5比例加入乙醇，沉 淀去除上清，加入1000mL水溶，再次按1:2.5比例加入乙醇醇沉，沉淀，冷冻 干燥得到γ-聚谷氨酸纯品198.45g，经HPLC法检测，含量达到88.2％。
实施例4
一种液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，其具体步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃条件下保存的LB培养基上的试管斜面菌种移至室温 条件下活化4h；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用无菌接种环接种3个单菌落于装 有灭菌种子培养基的三角瓶中，培养温度32℃，摇床转速200rpm，培养时间18h；
种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏8g/L，谷氨酸钠15g/L K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4 0.20g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0，灭菌条件121℃，0.15Mpa， 灭菌20min；
(3)发酵、调控过程：将液体种子以5％(v/v)的接种量接到发酵培养基 中，500L发酵罐发酵培养基装液量为200L，罐压0.05Mpa，转速400rpm，32℃ 培养16h，开始流加补料培养基，通过葡萄糖的反馈调节流加培养基的速度，控 制葡萄糖的终浓度为0.2％，总发酵时间72h。
发酵培养基组成：葡萄糖60g/L，谷氨酸钠70g/L，NH4Cl 12g/L，MnSO4·H2O0.032g/L，MgSO4 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 30g/L，加水至1000mL，pH 9.0，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
流加培养基：葡萄糖50g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化铵20 g/L，谷氨酸钠60g/L，加水至1000mL，灭菌条件121℃，0.15Mpa，灭菌20min；
发酵结束以后，发酵液γ-聚谷氨酸含量为45g/L。
(4)发酵液酸化：取4000mL上述发酵的发酵液用硫酸调节pH3.2；
(5)γ-聚谷氨酸除菌浓缩工艺：发酵液酸化后，4000r/min离心10分钟后， 沉淀20h，用0.45um微滤膜处理得到澄清液体；将除菌后的发酵液，用超滤膜 6000浓缩，在浓缩过程中将除菌液用蒸馏水稀释10倍，最终将发酵液浓缩到原 体积的40％，浓缩液最终pH调节6.5。
(6)γ-聚谷氨酸的纯化：γ-聚谷氨酸浓缩液按照1:2.3比例加入乙醇，沉 淀去除上清，加入1000mL水溶，再次按1:2.3比例加入乙醇醇沉，沉淀，冷冻 干燥得到γ-聚谷氨酸纯品158.04g，经HPLC法检测，含量达到87.8％。
<110>黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120>一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法
<160>1
<210>1
<211>1429
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400>1
cttcggcggc tggctcctaa aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60
gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120
attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180
gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240
cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720
agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga acggtacttg 1020
ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260
gaagccacct tttatgtttg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat tagccccggt 1320
ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380
ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactg catgtatag 1429

Claims (4)

1.一株γ-聚谷氨酸高产菌株，其生物保藏编号为CGMCCNo.16159；命名为YJY18-11，属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.利用权利要求1所述γ-聚谷氨酸高产菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将4℃条件下保存在LB培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下活化4h-8h；
（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用无菌接种环接种1-3个单菌落于装有灭菌LB培养基中，培养16h后将其转接到灭菌的种子培养基的三角瓶中，培养温度30-37℃，转速160-200rpm，培养16-24h至对数生长期；
（3）发酵、诱导过程：将步骤（2）中的种子液以v/v 5-10%的接种量接种于发酵罐，500L发酵罐发酵培养基装液量为200-300L，发酵温度为30-37℃，罐压0.01-0.05Mpa，转速300-400rpm，当发酵至15-20h后，开始流加培养基，通过葡萄糖的反馈调节流加培养基的速度，控制葡萄糖的终浓度为0.1%-0.3%，总发酵时间为65-80h。
3.根据权利要求2所述的液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：
每升液体种子培养基组成为：葡萄糖 15-30g/L，酵母膏5-10g/L，谷氨酸钠15-30g/L，K2HPO4·3H2O 1.5-3 g/L，MgSO4 0.25-0.5g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。
4.根据权利要求2所述的液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：
每升液体培养基组成：葡萄糖20-60g/L，谷氨酸钠 30-70 g/L，NH4Cl 5-20 g /L，MnSO4•H2O 0.01-0.1 g/L，MgSO4 0.01-0.2 g/L，K2HPO4•3H2O 10-40 g/L，pH 7.5-9，加水至1000mL；
所述流加培养基每升组成：葡萄糖50-100 g/L，磷酸氢二钾 1-10g/L，硫酸镁0.1 -2g/L，氯化铵10 -50 g/L，谷氨酸钠50-100 g/L，加水至1000mL。
CN201811617317.4A 2018-12-27 2018-12-27 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法 Active CN109609408B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811617317.4A CN109609408B (zh) 2018-12-27 2018-12-27 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811617317.4A CN109609408B (zh) 2018-12-27 2018-12-27 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109609408A CN109609408A (zh) 2019-04-12
CN109609408B true CN109609408B (zh) 2022-04-15

Family

ID=66011792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811617317.4A Active CN109609408B (zh) 2018-12-27 2018-12-27 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609408B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110373346B (zh) * 2019-06-10 2023-05-23 上海市农业科学院 枯草芽孢杆菌Bacillus sp.A-5及其用途
CN110229852B (zh) * 2019-06-20 2021-02-23 东莞理工学院 一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
CN110951798A (zh) * 2020-01-07 2020-04-03 广东丸美生物技术股份有限公司 γ-聚谷氨酸的生物发酵方法及其应用
CN114456980B (zh) * 2022-02-28 2023-08-11 天津北洋百川生物技术有限公司 一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104164376A (zh) * 2013-05-20 2014-11-26 中国中化股份有限公司 大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法
CN109943495A (zh) * 2018-09-05 2019-06-28 浙江惠嘉生物科技股份有限公司 一株高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其发酵方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10262655A (ja) * 1997-03-25 1998-10-06 Hoshino Kagaku Kk 新規な納豆菌およびその取得方法ならびに新規な納豆菌が産生するポリ−γ−グルタミン酸とそれを利用した調味料
WO1999025864A2 (en) * 1997-11-18 1999-05-27 Worcester Polytechnic Institute HIGH MOLECULAR WEIGHT η-POLY(GLUTAMIC ACID)
CN101538593A (zh) * 2009-04-13 2009-09-23 浙江大学 一种微生物发酵和膜分离技术耦合生产γ-聚谷氨酸的方法
CN102702508B (zh) * 2012-05-24 2013-10-16 领先生物农业股份有限公司 一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法
CN102911974B (zh) * 2012-09-28 2014-06-11 广西大学 枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
CN111748502B (zh) * 2020-07-31 2022-06-14 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一株产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104164376A (zh) * 2013-05-20 2014-11-26 中国中化股份有限公司 大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法
CN109943495A (zh) * 2018-09-05 2019-06-28 浙江惠嘉生物科技股份有限公司 一株高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其发酵方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolation and Characterization of Bacillus spp. with High-Level Productivity of Poly-γ-Glutamic Acid Poly-γ-Glutamic Acid고생성Bacillus spp.균주의분리및발효특성;Jeong, Do-Youn等;《Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition》;20171231;第46卷(第9期);1114-1121 *
枯草芽孢杆菌ZJS18发酵生产γ-聚谷氨酸培养条件的优化;于平等;《食品科学》;20180828;第39卷(第22期);87-92 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109609408A (zh) 2019-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109609408B (zh) 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法
CN109161492A (zh) 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法
Huang et al. Effects of CaCl2 on viscosity of culture broth, and on activities of enzymes around the 2-oxoglutarate branch, in Bacillus subtilis CGMCC 2108 producing poly-(γ-glutamic acid)
CN112359002B (zh) 一株小白链霉菌及其在生产ε-聚赖氨酸中的应用
CN105368766B (zh) 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法
CN109468259B (zh) 一种促进芽孢生成的培养基
CN110129216A (zh) 一种适于固体发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌诱变菌株及其培养方法
CN105316257B (zh) 一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及其制备α-酮酸的方法
CN110904012B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用
CN110129225B (zh) γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法
CN102174448B (zh) 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用
CN108299244A (zh) 生物转化制备l-瓜氨酸的分离纯化工艺
CN102994430A (zh) 一株细菌纤维素产生菌株及其应用
CN105176859B (zh) 一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株mqo-153
CN108220352A (zh) 一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
US20230212621A1 (en) Process for synthesis of poly-gamma-glutamic acid
CN110656065B (zh) 一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用
CN105175275B (zh) 一种l‑鸟氨酸的分离纯化方法
CN110951798A (zh) γ-聚谷氨酸的生物发酵方法及其应用
CN109136314B (zh) 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法
CN114456980B (zh) 一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用
CN114015607B (zh) 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN112501218B (zh) 一种利用木质纤维素同步糖化发酵生产l-乳酸的方法
CN103667107A (zh) 一种产l-乳酸的屎肠球菌菌株
CN105002228B (zh) 一种以精氨酸为原料制备l-鸟氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant