CN110129225B - γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 - Google Patents

γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110129225B
CN110129225B CN201910399564.XA CN201910399564A CN110129225B CN 110129225 B CN110129225 B CN 110129225B CN 201910399564 A CN201910399564 A CN 201910399564A CN 110129225 B CN110129225 B CN 110129225B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gamma
polyglutamic acid
strain
fermentation
bacillus licheniformis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910399564.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110129225A (zh
Inventor
朱永真
李艳琪
李同金
赵传海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sinopeptide biomedical Group Co.,Ltd.
Original Assignee
Sinopeptide Biomedical Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sinopeptide Biomedical Group Co ltd filed Critical Sinopeptide Biomedical Group Co ltd
Priority to CN201910399564.XA priority Critical patent/CN110129225B/zh
Publication of CN110129225A publication Critical patent/CN110129225A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110129225B publication Critical patent/CN110129225B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程发酵技术领域，具体涉及γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，登记入册的编号是CGMCC NO.17508，保藏日期是2019年4月1日。以此菌作为生产菌株。本发明的γ～聚谷氨酸的制备方法，包括菌种的筛选，发酵步骤，消毒步骤，微滤除菌，超滤浓缩，沉淀干燥。经过该方法制备的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质，更适宜用于化妆品和医药。

Description

γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程发酵技术领域，具体涉及一种γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ～聚谷氨酸(γ～PGA)是一种不同寻常的阴离子聚酰胺化合物，由d～和1～谷氨酸单位组成，通过氨基和羧酸基之间的酰胺键相连接。根据目前的谷氨酸残留，γ～PGA可分为γ～1～PGA(只有1～谷氨酸残基)、γ～d～PGA(只有d～谷氨酸残基)和γ～ld～PGA(1～和d～谷氨酸残基)。目前，有三种生产γ～PGA的方法：化学合成法、提取法和微生物发酵。与其他方法相比，微生物发酵是最具成本效益的，有许多优点，包括廉价的原材料、最小的环境污染、高天然产品纯度和温和的反应条件。
近年来，日本、韩国主要以发酵法制备γ～PGA，其中日本味之素株式会社和明治制果株式会社均已实现商业化生产γ～PGA。国内对γ～PGA的研究还主要停留在实验室研究阶段，实现工业化生产的并不多。
发明内容：
本发明的一个目的在于提供一种γ～聚谷氨酸产生菌，解决现有γ～聚谷氨酸产生菌产品大多是土壤级的粗品的缺陷，并提供一个γ～聚谷氨酸产生菌培养选育方法。
本发明的另外目的是提供一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法，解决γ～聚谷氨酸的生产工艺的不足及国内γ～聚谷氨酸生产能力不强的问题。经过该方法制备的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质，更适宜用于化妆品和医药。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种γ～聚谷氨酸产生菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL1，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，登记入册的编号是CGMCC NO.17508，保藏日期是2019年4月1日。
基于一种γ～聚谷氨酸产生菌的应用，所述γ～聚谷氨酸产生菌用于生产γ～聚谷氨酸。
本发明的一种γ～聚谷氨酸产生菌菌株的选育方法，包括如下步骤：
(1)菌体培养：取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL(从土壤中筛选得到)接种于盛有种子培养基的三角瓶中，于37±1℃振荡培养16～32h，制得种子液。
种子摇瓶培养基配方：甘油10～20g/L，柠檬酸0.8～3g/L，柠檬酸铁铵0.1～1g/L，L～谷氨酸钠2～7g/L，磷酸二氢钾0.3～0.8g/L，硫酸镁0.3～0.8g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(2)制备菌悬液；取上述制得的种子液，放于无菌离心管中，以2000～5000r/min离心5～30min，弃去上清液，加入无菌水振荡洗涤，离心5～30min，弃去上清液，再加入无菌水，振荡均匀。
(3)诱变：将上述制得的菌悬液盛于无菌培养皿中，在紫外诱变超净台紫外灯下，距离15～25cm，照射0.5～1.5min；将紫外诱变结束的菌悬液于冰箱中静置1～3小时后，加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯的终浓度为1～4％，处理时间为10～30min，处理结束后，加入等体积20～50％硫代硫酸钠溶液终止反应。
(4)培养箱培养取诱变后菌悬液于培养基平板上，置37±1℃隔水式恒温培养箱中培养25～40h，培养基成分为：甘油10～20g/L，柠檬酸0.8～3g/L，柠檬酸铁铵0.1～1g/L，L～谷氨酸钠2～7g/L，磷酸二氢钾0.3～0.8g/L，硫酸镁0.3～0.8g/L，琼脂粉15～20g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(5)观察长出的菌落，选出菌落圆润，用接种针挑起有拉丝的菌体接入斜面保藏，经多次诱变挑选出菌株，进行斜面保存；
(6)菌株筛选：取上述步骤(5)的诱变菌株，分别培养后测其吸光值，选取相对吸光值较大的菌株，培养温度37±1℃，PH值7.0±1，进行摇瓶发酵。
摇瓶培养基配方：甘油50～80g/L，K2HPO4·3H2O 0.30～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3～1g/L，FeCl3·6H2O 30～80mg/L，MnSO4·H2O 0.05～0.25g/L，氯化铵5～10g/L，谷氨酸15～35g/L，其余为水，pH 7.0±1。
本发明还公开了一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
a)活化发酵：
γ～聚谷氨酸产生菌菌株活化后，在37±1℃下好氧发酵60～80h；其中，好氧发酵培养基为完全培养基：碳源50～100g/L，氮源5～20g/L，无机盐0～5g/L，谷氨酸或谷氨酸钠15～35g/L，其余为水，pH 7.0±1。
b)消毒：将发酵好的发酵液泵入到暂存罐中，与已经准备好的无菌水进行混合，同时对后续各设备及连接管道进行高温蒸汽消毒，消毒时间15～45分钟。
c)微滤除菌：进行三级微滤除菌，第一级微滤除菌膜孔径为0.45～0.88υm，第二级微滤除菌膜孔径为0.22～0.45υm，第三级微滤除菌膜孔径为0.18～0.22υm，经过三级微滤，得到澄清透明的溶液。
d)超滤浓缩：对上述微滤除菌的溶液进行两级超滤浓缩，第一级超滤浓缩膜孔径为7～15KD，浓缩分子量大的γ～聚谷氨酸，第二级超滤浓缩膜孔径为2～7KD，浓缩分子量小的γ～聚谷氨酸，两次超滤浓缩后得浓缩液，可使得γ～聚谷氨酸的回收率达99％。
e)沉淀干燥；对上述经过两次超滤浓缩得到的γ～聚谷氨酸浓缩液进行有机溶剂沉淀，将得到的沉淀物进行干燥后进行粉碎包装，得到γ～聚谷氨酸纯品。
优选的，所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法的步骤a)中的碳源为甘油或柠檬酸或葡萄糖的任意一种或几种的组合，氮源为氯化铵、硫酸铵、蛋白胨或酵母粉的任意一种或几种的组合，无机盐为钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、锰盐、磷酸盐和盐酸盐的任意一种或几种的组合。
优选的，所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法的步骤a)的生产方式为：γ～聚谷氨酸产生菌菌株活化后，在37℃下好氧发酵60～80h，装液量为37L发酵液/50L发酵罐，转速350rpm；所述好氧发酵培养基为：甘油80g/L，K2HPO4·3H2O0.80g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 50mg/L，MnSO4·H2O 0.13g/L，氯化铵7g/L，谷氨酸20g/L，其余为水，pH 7.0。
优选的，所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法的步骤e)中的有机溶剂可以为甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮的一种或几种，浓缩液与有机溶剂的混合比例为1∶1.5～4。
优选的，所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法中有机溶剂为乙醇，浓缩液与乙醇的混合比例为1∶2.5。
优选的，所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法中所述好氧发酵培养基：甘油100g/L，柠檬酸20g/L，K2HPO4·3H2O 0.80g/L，MgSO4·7H2O 0.50g/L，FeCl3·6H2O 50mg/L，MnSO4·H2O 0.13g/L，氯化铵7g/L，谷氨酸30g/L，其余为水，pH 7.0。
优选的，所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法的中所述好氧发酵培养基：甘油40g/L，葡萄糖40g/L，柠檬酸20g/L，蛋白胨10g/L，谷氨酸钠30g/L，其余为水，pH 7.0。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有如下优势：
(1)与化学法，多肽合成法，生物转化法相比，能耗低，污染小，使用非化石资源作为原料，无需使用贵重金属作为催化剂，成本低廉，过程易操控，产量高。
(2)与原始菌相比，发酵产物单一，副产物少，产量高。
(3)对传统提纯方式相比，得到的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质，适宜用于化妆品与医药。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
目前，该γ～聚谷氨酸产生菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，登记入册的编号是CGMCC NO.17508，保藏日期是2019年4月1日。以此菌作为生产菌株。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征：
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1是呈单细胞，直杆状菌，属能分泌γ～聚谷氨酸地衣芽孢杆菌属的一种。通常0.2～0.8*0.6～2.0υm，能运动，革兰氏染色呈阳性，生长严格好氧，最适宜温度37±1℃。该地衣芽孢杆菌在实际生产中谷氨酸转化率高，产γ～聚谷氨酸能力强，在营养琼脂培养基上，37℃涂板培养呈快速生长，菌苔圆润，24h为白色略透明，48h后稍呈淡黄色，随培养时间的延长颜色稍增深。表面湿润、光滑，有光泽，挑起有拉丝，有粘度。
2、生理与生化特性：
a.培养温度：37±1℃，最适温度为37℃；
b.在pH 7.0±1范围内生长；
c.色素产生情况：淡黄色色素。
3、营养特征：
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1可在合成培养基上生长，培养基成分明确且价格低廉。该培养基碳源一般为甘油或柠檬酸或葡萄糖，氮源可选用氯化铵，硫酸铵，蛋白胨，酵母粉等，培养基中还包括钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、锰盐、磷酸盐和盐酸盐等常用的无机盐类，根据不同的氮源而定，以氯化按或硫酸铵为唯一氮源时需全添加，在以蛋白胨、酵母膏时可以少量或不加入无机盐。在发酵生产中，必须添加谷氨酸或谷氨酸钠为前体物质。
上述γ～聚谷氨酸产生菌用于生产γ～聚谷氨酸，得到的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质。
关于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的诱变，选育过程为：
实施例1
(1)菌体培养：取地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis)BL(从土壤中筛选)，接种于盛有种子培养基的三角瓶中，于37±1℃振荡培养22h，制得种子液。
种子摇瓶培养基配方：甘油15g/L，柠檬酸2g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，L～谷氨酸钠4g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(2)制备菌悬液：取上述种子液于无菌离心管中，以3000r/min离心10min，弃去上清液，加入无菌水振荡洗涤，离心10min，弃去上清液，再加入无菌水，振荡均匀。
(3)诱变：将菌悬液盛于无菌培养皿中，在紫外诱变超净台254nm紫外灯下，距离20cm，照射1.2min；将紫外诱变结束的菌悬液于冰箱中静置2.2小时后，加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯的终浓度为2％，处理时间为15min，处理结束后，加入等体积5％硫代硫酸钠溶液终止反应。
(4)培养箱培养：取诱变后菌悬液于培养基平板上，置37±1℃隔水式恒温培养箱中培养36h，培养基成分为：甘油15g/L，柠檬酸2g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，L～谷氨酸钠4g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂粉18g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(5)观察长出的菌落，选出菌落圆润，用接种针挑起有拉丝的菌体接入斜面保藏，经多次诱变挑选出菌株，进行斜面保存。
(6)菌株筛选：取上述诱变菌株，分别培养后测其吸光值，选取相对吸光值较大的菌株，培养温度37±1℃，PH值7.0±1，进行摇瓶发酵。
摇瓶培养基配方：甘油60g/L，K2HPO4·3H2O 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 50mg/L，MnSO4·H2O 0.13g/L，氯化铵7g/L，谷氨酸25g/L，其余为水，pH 7.0±1。
发酵结束后，进行γ～聚谷氨酸的提纯，使用此菌种制备的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质，更适宜用于化妆品和医药。
实施例2
(1)菌体培养：取地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis)BL(从土壤中筛选)，接种于盛有种子培养基的三角瓶中，于37±1℃振荡培养16h，制得种子液。
种子摇瓶培养基配方：甘油10g/L，柠檬酸0.8g/L，柠檬酸铁铵0.1g/L，L～谷氨酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(2)制备菌悬液：取上述种子液于无菌离心管中，以2000r/min离心5min，弃去上清液，加入无菌水振荡洗涤，离心5min，弃去上清液，再加入无菌水，振荡均匀。
(3)诱变：将菌悬液盛于无菌培养皿中，在紫外诱变超净台254nm紫外灯下，距离15cm，照射0.5min；将紫外诱变结束的菌悬液于冰箱中静置1小时后，加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯的终浓度为1％，处理时间为10min，处理结束后，加入等体积20％硫代硫酸钠溶液终止反应。
(4)培养箱培养：取诱变后菌悬液于培养基平板上，置37±1℃隔水式恒温培养箱中培养25h，培养基成分为：甘油10g/L，柠檬酸0.8g/L，柠檬酸铁铵0.1g/L，L～谷氨酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，琼脂粉15g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(5)观察长出的菌落，选出菌落圆润，用接种针挑起有拉丝的菌体接入斜面保藏，经多次诱变挑选出菌株，进行斜面保存。
(6)菌株筛选：取上述诱变菌株，分别培养后测其吸光值，选取相对吸光值较大的菌株，培养温度37±1℃，PH值7.0±1，进行摇瓶发酵。
摇瓶培养基配方：甘油50g/L，K2HPO4·3H2O 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeCl3·6H2O 30mg/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，氯化铵5g/L，谷氨酸15g/L，其余为水，pH 7.0±1。
发酵结束后，进行γ～聚谷氨酸的提纯，使用此菌种制备的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质，更适宜用于化妆品和医药。
实施例3
(1)菌体培养：取地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis)BL(从土壤中筛选)，接种于盛有种子培养基的三角瓶中，于37±1℃振荡培养32h，制得种子液。
种子摇瓶培养基配方：甘油20g/L，柠檬酸3g/L，柠檬酸铁铵1g/L，L～谷氨酸钠7g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.8g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(2)制备菌悬液：取上述种子液于无菌离心管中，以5000r/min离心30min，弃去上清液，加入无菌水振荡洗涤，离心30min，弃去上清液，再加入无菌水，振荡均匀。
(3)诱变：将菌悬液盛于无菌培养皿中，在紫外诱变超净台254nm紫外灯下，距离25cm，照射1.5min；将紫外诱变结束的菌悬液于冰箱中静置3小时后，加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯的终浓度为4％，处理时间为30min，处理结束后，加入等体积50％硫代硫酸钠溶液终止反应。
(4)培养箱培养：取诱变后菌悬液于培养基平板上，置37±1℃隔水式恒温培养箱中培养40h，培养基成分为：甘油20g/L，柠檬酸3g/L，柠檬酸铁铵1g/L，L～谷氨酸钠7g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.8g/L，琼脂粉20g/L，余量为水，PH 7.0±1。
(5)观察长出的菌落，选出菌落圆润，用接种针挑起有拉丝的菌体接入斜面保藏，经多次诱变挑选出菌株，进行斜面保存。
(6)菌株筛选：取上述诱变菌株，分别培养后测其吸光值，选取相对吸光值较大的菌株，培养温度37±1℃，PH值7.0±1，进行摇瓶发酵。
摇瓶培养基配方：甘油80g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeCl3·6H2O80mg/L，MnSO4·H2O 0.25g/L，氯化铵10g/L，谷氨酸35g/L，其余为水，pH 7.0±1。
发酵结束后，进行γ～聚谷氨酸的提纯，使用此菌种制备的γ～聚谷氨酸纯度高，无杂质，更适宜用于化妆品和医药。
基于γ～聚谷氨酸产生菌能够用于生产γ～聚谷氨酸的用途，以下为用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1制备γ～聚谷氨酸的方法。
实施例4
用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1制备γ～聚谷氨酸的方法。包括如下步骤：
a)活化发酵：
地衣芽孢杆菌活化所用的斜面培养基组成配比为：甘油4g/L，柠檬酸铁按0.5g/L，谷氨酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1分别于37℃斜面活化菌种，24h后各接入至3L发酵培养基，37℃，200rpm培养18h，然后转接入装液量为37L发酵培养基的50L发酵罐，37℃培养，转速为300rpm，发酵72h后进行提纯。
所用的好氧发酵培养基组成配比为：甘油80g/L，K2HPO4·3H2O 0.80g/L，MgSO4·7H2O 0.50g/L，FeCl3·6H2O 50mg/L，MnSO4·H2O 0.13g/L，氯化铵7g/L，谷氨酸20g/L，其余为水，pH 7.0。50L发酵罐装液量37L，121℃灭菌30分钟。
b)消毒步骤：将发酵好的发酵液泵入到暂存罐中，与已经准备好的无菌水进行混合，同时对后续各设备及连接管道进行高温蒸汽消毒，消毒时间30分钟。
c)微滤除菌：进行三级微滤除菌，第一级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.45um，第二级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.22υm，第三级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.18υm，经过三级微滤，得到澄清透明的溶液。
d)超滤浓缩：对于上述微滤除菌的溶液进行两级超滤浓缩，第一级超滤浓缩膜孔径为10KD，浓缩分子量大的γ～聚谷氨酸，第二级超滤浓缩膜孔径为2KD，浓缩分子量小的γ～聚谷氨酸，两次超滤浓缩后制得浓缩液，可使得γ～聚谷氨酸的回收率达99％。
e)沉淀干燥：对上述经过两次超滤浓缩得到的γ～聚谷氨酸浓缩液进行乙醇沉淀，得到γ～聚谷氨酸，将得到的沉淀物进行干燥(首选冻干干燥方式)后进行粉碎包装，得到γ～聚谷氨酸纯品。
经过检测分析，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的发酵液中γ～聚谷氨酸的含量为30.21g/L，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL的发酵液中γ～聚谷氨酸的含量为2.11g/L，两者要比，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的γ～聚谷氨酸产量比地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL的产量提高了14.38倍。
实施例5
用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1制备γ～聚谷氨酸的方法。包括如下步骤：
a)活化发酵：
地衣芽孢杆菌活化所用的斜面培养基组成配比为：甘油4g/L，柠檬酸铁按0.5g/L，谷氨酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL1分别于37℃斜面活化菌种，24h后各接入至3L发酵培养基，37℃，200rpm培养20h，然后分别转接入装液量为37L发酵培养基的50L发酵罐，37℃培养，转速为250rpm。发酵60h后进行提纯。
所用的好氧发酵培养基：甘油100g/L，柠檬酸20g/L，K2HPO4·3H2O 0.80g/L，MgSO4·7H2O 0.50g/L，FeCl3·6H2O 50mg/L，MnSO4·H2O 0.13g/L，氯化铵7g/L，谷氨酸30g/L，其余为水，pH 7.0。50L发酵罐装液量37L，121℃灭菌30分钟。
b)消毒步骤：将发酵好的发酵液泵入到暂存罐中，与已经准备好的无菌水进行混合，同时对后续各设备及连接管道进行高温蒸汽消毒，消毒时间15分钟。
c)微滤除菌进行三级微滤除菌，第一级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.88υm，第二级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.45υm，第三级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.22υm，经过三级微滤，得到澄清透明的溶液。
d)超滤浓缩对于上述微滤除菌的溶液进行两级超滤浓缩，第一级超滤浓缩膜孔径为7KD，浓缩分子量大的γ～聚谷氨酸，第二级超滤浓缩膜孔径为4KD，浓缩分子量小的γ～聚谷氨酸，两次超滤浓缩后制得浓缩液，可使得γ～聚谷氨酸的回收率达99％。
e)沉淀干燥：对上述经过两次超滤得到的γ～聚谷氨酸进行乙醇沉淀，得到γ～聚谷氨酸，将得到的醇沉物进行干燥(首选冻干干燥方式)后进行粉碎包装，得到γ～聚谷氨酸纯品。
经过检测分析，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的发酵液中γ～聚谷氨酸的含量为38.45g/L，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL的发酵液中γ～聚谷氨酸的含量为2.50g/L，两者要比，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的γ～聚谷氨酸产量比地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL的产量提高了15.38倍。
实施例6
用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1制备γ～聚谷氨酸的方法。
包括如下步骤：
a)活化发酵：
地衣芽孢杆菌活化所用的斜面培养基组成配比为：甘油4g/L，柠檬酸铁按0.5g/L，谷氨酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL1分别于37℃斜面活化菌种，24h后各接入到3L发酵培养基，37℃，200rpm培养22h，然后分别转接入装液量为37L发酵培养基的50L发酵罐，37℃培养，转速为350rpm。发酵80h后进行提纯。
好氧发酵培养基：甘油40g/L，葡萄糖40g/L，柠檬酸20g/L，蛋白胨10g/L，谷氨酸钠30g/L，其余为水，pH 7.0。50L发酵罐装液量37L，121℃灭菌30分钟。
b)消毒步骤：将发酵好的发酵液泵入到暂存罐中，与已经准备好的无菌水进行混合，同时对后续各设备及连接管道进行高温蒸汽消毒，消毒时间45分钟。
c)微滤除菌：进行三级微滤除菌，第一级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.60um，第二级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.35um，第三级微滤除菌陶瓷膜孔径为0.2um，经过三级微滤，得到澄清透明的溶液。
d)超滤浓缩：对于上述微滤除菌的溶液进行两级超滤浓缩，第一级超滤浓缩膜孔径为15KD，浓缩分子量大的γ～聚谷氨酸，第二级超滤浓缩膜孔径为7KD，浓缩分子量小的γ～聚谷氨酸，两次超滤浓缩后制得浓缩液，可使得γ～聚谷氨酸的回收率达99％。
e)沉淀干燥：对上述经过两次超滤得到的γ～聚谷氨酸进行乙醇沉淀，得到γ～聚谷氨酸，将得到的醇沉物进行干燥(首选冻干干燥方式)后进行粉碎包装，得到γ～聚谷氨酸纯品。
经过检测分析，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的发酵液中γ～聚谷氨酸的含量为34.45g/L，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL的发酵液中γ～聚谷氨酸的含量为2.55g/L，两者要比，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1的γ～聚谷氨酸产量比地衣芽孢杆菌(Bacil1us licheniformis)BL的产量提高了13.50倍。

Claims (4)

1.一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
a)活化发酵：
γ～聚谷氨酸产生菌菌株活化后，在37±1℃下好氧发酵60～80h；其中，好氧发酵培养基为完全培养基:碳源50～100g/L，氮源5～20g/L，无机盐0～5g/L，谷氨酸或谷氨酸钠15～35g/L，其余为水，pH 7.0±1；该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL1，已在2019年4月1日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其登记入册的编号是CGMCC NO.17508；
碳源为甘油或柠檬酸或葡萄糖的任意一种或几种的组合，氮源为氯化铵、硫酸铵、蛋白胨或酵母粉的任意一种或几种的组合，无机盐为钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、锰盐、磷酸盐和盐酸盐的任意一种或几种的组合；
b)消毒：将发酵好的发酵液泵入到暂存罐中，与已经准备好的无菌水进行混合，同时对后续各设备及连接管道进行高温蒸汽消毒，消毒时间15～45分钟；
c)微滤除菌：进行三级微滤除菌，第一级微滤除菌膜孔径为0.45～0.88μm，第二级微滤除菌膜孔径为0.22～0.45μm，第三级微滤除菌膜孔径为0.18～0.22μm，经过三级微滤，得到澄清透明的溶液；
d)超滤浓缩：对上述微滤除菌的溶液进行两级超滤浓缩，第一级超滤浓缩膜孔径为7～15KD，浓缩分子量大的γ～聚谷氨酸，第二级超滤浓缩膜孔径为2～7KD，浓缩分子量小的γ～聚谷氨酸，两次超滤浓缩后得浓缩液，可使得γ～聚谷氨酸的回收率达99％；
e)沉淀干燥；对上述经过两次超滤浓缩得到的γ～聚谷氨酸浓缩液进行有机溶剂沉淀，将得到的沉淀物进行干燥后进行粉碎包装，得到γ～聚谷氨酸纯品。
2.根据权利要求1所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤a)的生产方式为:γ～聚谷氨酸产生菌菌株活化后，在37℃下好氧发酵60～80h，装液量为37L发酵液/50L发酵罐，转速350rpm；好氧发酵培养基为：甘油80g/L，K2HPO4•3H2O0.80g/L，MgSO4•7H2O 0.5g/L，FeCl3•6H2O 50mg/L，MnSO4•H2O 0.13g/L，氯化铵7g/L，谷氨酸20g/L，其余为水，pH 7.0。
3.根据权利要求1所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤e)中的有机溶剂为甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮的一种或几种，浓缩液与有机溶剂的混合比例为1:1.5～4。
4.根据权利要求1所述的一种γ～聚谷氨酸产生菌制备γ～聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述好氧发酵培养基为：甘油40g/L，葡萄糖40g/L，柠檬酸20g/L，蛋白胨10g/L，谷氨酸钠30g/L，其余为水，pH 7.0。
CN201910399564.XA 2019-05-14 2019-05-14 γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 Active CN110129225B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910399564.XA CN110129225B (zh) 2019-05-14 2019-05-14 γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910399564.XA CN110129225B (zh) 2019-05-14 2019-05-14 γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110129225A CN110129225A (zh) 2019-08-16
CN110129225B true CN110129225B (zh) 2021-07-23

Family

ID=67573978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910399564.XA Active CN110129225B (zh) 2019-05-14 2019-05-14 γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110129225B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662848B (zh) * 2020-03-25 2022-02-18 济南航晨生物科技有限公司 耐盐地衣芽孢杆菌a-a2-10的培养方法及应用
CN113957033A (zh) * 2021-09-22 2022-01-21 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种提高产聚谷氨酸野生型菌株生产能力的方法
CN116606782B (zh) * 2023-07-17 2023-09-12 山东合成远景生物科技有限公司 一种乳杆菌诱变菌株hcyj-06及应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100327561B1 (ko) * 1999-12-29 2002-03-15 윤덕용 고점도 발효액으로부터 폴리글루탐산의 제조방법
US7364875B2 (en) * 2003-10-30 2008-04-29 Cresent Innovations, Inc. Method for producing medical and commercial grade poly-gamma-glutamic acid of high molecular weight
CN101603015B (zh) * 2008-06-13 2010-11-10 河北维尔康制药有限公司 一种地衣芽孢杆菌菌株及用途和用其生产聚γ-谷氨酸的方法
CN101948785B (zh) * 2010-08-31 2012-06-13 南京医科大学 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法
CN102367431B (zh) * 2011-11-11 2014-07-02 中国科学院过程工程研究所 一种地衣芽孢杆菌及其应用
CN104694437B (zh) * 2015-03-23 2018-04-27 领先生物农业股份有限公司 一株地衣芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的用途
CN109161492A (zh) * 2018-08-06 2019-01-08 南京卉之源生物科技有限公司 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110129225A (zh) 2019-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110129225B (zh) γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法
CN109161492A (zh) 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法
CN102212501B (zh) 一种重组大肠杆菌及应用其以单一碳源生产phbv的方法
CN110373359B (zh) 一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法
CN109609408B (zh) 一株γ-聚谷氨酸高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备γ-聚谷氨酸的方法
CN110669798A (zh) 农用低成本聚谷氨酸的生产方法
CN115725488A (zh) 一株无色素产生的骆驼刺泛菌及其在制备胞外多糖中的应用
CN114015607B (zh) 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN100523209C (zh) 酶转化生产l—鸟氨酸的方法
CN103695325B (zh) 一种热带假丝酵母及一种微生物法制备l-缬氨酸的方法
CN110747240A (zh) 一种聚谷氨酸的发酵工艺
US5071976A (en) Novel heteropolysaccharide
CN110656065B (zh) 一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用
CN109161507B (zh) 一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN103667107B (zh) 一种产l-乳酸的屎肠球菌菌株
CN1087005C (zh) 一种合成微生物聚酯的污水生物絮凝法
CN103468606A (zh) 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用
CN1017350B (zh) 微生物发酵正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法
CN106010992B (zh) 酿酒酵母及酿酒酵母制备琥珀酸的方法
CN105483060B (zh) 一种高产瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产瓜氨酸中的应用
CN114807259B (zh) 一种用于发酵生产谷氨酸的种子培养基和发酵培养基
CN116200297B (zh) 一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用
JPH02138965A (ja) クレブシェラ属の菌株の培養物を用いてラムノース含有量の高い単糖類混合物を生産する方法
CN115058352B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法
CN113969299B (zh) 一种生物转化合成尿苷的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200116

Address after: 1502, scientific research center building, biomedical park, No.1, Lutai Avenue, high tech Zone, Zibo, Shandong Province

Applicant after: Shandong Han peptide biomedical Co., Ltd

Address before: 255086 No. 1 Lutai Avenue, Zibo City, Shandong Province

Applicant before: Shandong Hantai Biotechnology Co., Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210630

Address after: No.287 Weigao Road, Gaoqing Economic Development Zone, Zibo City, Shandong Province, 256300

Applicant after: Sinopeptide biomedical Group Co.,Ltd.

Address before: 255000 1502, scientific research center building, biomedical park, No.1 Lutai Avenue, high tech Zone, Zibo City, Shandong Province

Applicant before: Shandong Han peptide biomedical Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant