CN110669798A

CN110669798A - 农用低成本聚谷氨酸的生产方法

Info

Publication number: CN110669798A
Application number: CN201911051389.1A
Authority: CN
Inventors: 程文焕; 程贵强; 刘路; 杜鹏; 位凤宇; 高雷; 王文强
Original assignee: Inner Mongolia Wofeng Agricultural Development Co Ltd; INNER MONGLIA FUFENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Wofeng Agricultural Development Co Ltd; INNER MONGLIA FUFENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2020-01-10

Abstract

本发明属于氨基酸生产领域，公开了农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：1）将枯草芽孢杆菌种子液按照5‑10％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵30小时，然后添加产酸培养基，继续培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；2）聚谷氨酸发酵液于4000‑6000rpm的条件下离心5‑15min，取上清液，加入2‑4倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀10‑20h，再以6000‑8000rpm离心10‑20min，收集沉淀，真空干燥得到农用聚谷氨酸。本发明生产的聚谷氨酸产量高，成本低，纯度为90%左右，完全能够满足农用需求。

Description

农用低成本聚谷氨酸的生产方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产领域，具体涉及农用低成本聚谷氨酸的生产方法。

背景技术

γ–PGA全名γ-Polyglutamic acid，是以左、右旋光性的谷氨酸为单元体，以γ-位上的醯胺键聚合而成同质多肽(Homo-polypeptide)，聚合度约在1,000-15，000之间。γ-(D,L)-PGA, γ-(D)-PGA, 和γ-(L)-PGA等统称为γ-PGA 。γ–PGA在国际化妆品药典上的命名为纳豆胶（NATTO GUM），在欧盟、日本也称为plant collagen, collagene vegetale,phyto collage。在中国则称为纳豆胶或多聚谷氨酸、聚谷氨酸。

聚谷氨酸（聚-γ-谷氨酸，英文 poly-γ-glutamic acid，简称PGA）是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物。分子量分布在100kDa到10000kDa之间。聚-γ-谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。

从聚谷氨酸的发现至今仅有几十年的历史，聚谷氨酸的研究主要还是处于实验室阶段，主要包括对它性质研究，产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和性质的研究。近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了聚谷氨酸产业化研究和探索的进程。进入本世纪，个别国际知名公司开始进行聚谷氨酸的生产和应用的研究，国内部分大学和研究所也积极开展了相关的研究，国内更有数家企业开始计划聚谷氨酸的大规模生产。由于这些产业化研究的跟进，使得聚谷氨酸成为现阶段最受人关注的生物制品之一。

γ-聚谷氨酸γ-PGA可以做为植物增产营养素应用于农业领域。主要包括以下几个方面：1、γ-聚谷氨酸γ-PGA Hydrogel及γ-PGA超强亲水性与保水能力，漫淹于土壤中时，会在植株根毛表层形成一层薄膜，不但具有保护根毛的功能，更是土壤中养份、水份与根毛亲密接触的最佳输送平台，能很有效率的提高肥料的溶解、存储、输送与吸收。阻止硫酸根、磷酸根、草酸根与金属元素产生沉淀作用,使作物能更有效的吸收土壤中磷、钙、镁及微量元素。促进作物根系的发育，加强抗病性。2、γ-聚谷氨酸γ-PGA Hydrogel及γ-PGA平衡土壤酸碱值对酸、碱具有绝佳缓冲能力，可有效平衡土壤酸碱值，避免长期使用化学肥料所造成的酸性土质。3、γ-聚谷氨可结合沉淀有毒重金属，对Pb+2、Cu+2、Cd+2、Cr+3、Al+3、As+4等有毒重金属有极佳的螯合效果。4、γ-聚谷氨酸可增强植物抗病及抗逆境能力，整合植物营养、土壤中的水活成份，可增强抵抗由土壤传播的植物病原所引起的症状。5、促进增产，可使茶叶、瓜果、蔬菜等农产品快速增产，增产量可达10-20%。

申请人之前的专利技术对聚谷氨酸发酵进行了大量的研究，例如“一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺”通过水解废弃菌体蛋白和利用结晶母液，开辟了聚谷氨酸生产廉价氮源提高的新策略，并结合玉米秸秆水解液等农业废弃物的联合应用，开创了一条利用非粮和废弃生物量水解的碳氮源生产聚氨基酸的创新技术，大大降低了成本，提高了企业利润。例如“一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法”通过两种菌株混合发酵，通过水解谷氨酸发酵废弃菌体将其开发为蛋白质水解液，发酵产聚谷氨酸效率大大提高，成本也显著降低。但是上述技术存在培养基组分较为复杂，可能带来不能预期的风险，而且菌株混合发酵可控性较差。在上述成果的基础上，申请人继续对聚谷氨酸发酵工艺进行研究。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了农用低成本聚谷氨酸的生产方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：

1）将枯草芽孢杆菌种子液按照5-10％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵30小时，然后添加产酸培养基，继续培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30-34℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速200-400rpm，通气量为1.0-1.2vvm，通过流加葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

2）聚谷氨酸发酵液于4000-6000rpm的条件下离心5-15min，取上清液，加入2-4倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀10-20h，再以6000-8000rpm离心10-20min，收集沉淀，真空干燥得到农用聚谷氨酸。

进一步地，所述生产方法包括如下步骤：

1）将枯草芽孢杆菌种子液按照5-10％的接种量接入含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵30小时，然后添加10L产酸培养基，继续培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速300rpm，通气量为1.2vvm，通过流加200g/L的葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

2）聚谷氨酸发酵液于5000rpm的条件下离心10min，取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀12h，再以8000rpm离心15min，收集沉淀，真空干燥得到农用聚谷氨酸。

优选地，在发酵至20h时，于每升发酵液中以2-4ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束。

优选地，所述发酵培养基组分为：葡萄糖30-40g/L、柠檬酸钠5-10g/L、玉米浆10-30g/L、氯化铵10-20g/L、谷氨酸钠20-30g/L、氯化钙3-8g/L、磷酸氢二钾0.1-0.2g/L、磷酸二氢钾0.1-0.2g/L、七水硫酸镁0.1-0.2g/L、七水硫酸亚铁0.1-0.2mg/L。

优选地，所述产酸培养基组分为：壳聚糖40-80mg/L、氯化钠10-30g/L、琥珀酸3-7g/L。

更优选地，所述发酵培养基组分为：葡萄糖35g/L、柠檬酸钠10g/L、玉米浆20g/L、氯化铵15g/L、谷氨酸钠25g/L、氯化钙5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1mg/L。

更优选地，所述产酸培养基组分为：壳聚糖50mg/L、氯化钠20g/L、琥珀酸5g/L。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明培养基采用两部分组成，发酵培养基侧重于菌株的增殖，产酸培养基有利于聚谷氨酸的合成和分泌；

本发明通过优化碳氮源种类等培养条件，结合代谢流改造以及分泌机制，多方面对发酵工艺进行优化，降低了成本，提高了聚谷氨酸的发酵效率；

发酵中后期，菌株增殖速度放缓，以产酸为主，壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合金属阳离子,从而改变细胞壁的通透性，促进聚谷氨酸分泌到胞外。氯化钠能够产生一定的渗透压，菌株对高渗环境产生应激反应，通过自我反馈机制来促进聚谷氨酸的积累。

乙醛酸循环消耗大量的ATP及造成碳源的浪费，通过流加琥珀酸对异柠檬酸裂解酶具有抑制作用，从而对减少进入乙醛酸循环代谢流量；ATP激活谷氨酸，然后由ATP脱去ppi形成的AMP，与谷氨酸结合，通过一系列酶的作用，不断形成聚谷氨酸片段的延长；在发酵中后期添加琥珀酸，对乙醛酸循环途径具有抑制作用，从而导致中间代谢物更多地流向三羧酸循环途径，进而促进谷氨酸产量的增加，而且还能够减少ATP的消耗，提高聚谷氨酸的产量。

本发明采用在发酵中后期，通过流加双氧水，通气供氧相结合，提高了氧气的传质速率，一定的添加浓度和添加方式可以提高发酵体系的细胞密度和代谢效率。

本发明生产的聚谷氨酸产量高，成本低，纯度为90%左右，完全能够满足农用需求。

附图说明

图1：壳聚糖对聚谷氨酸产量的影响；

图2：氯化钠对聚谷氨酸产量的影响；

图3：琥珀酸对聚谷氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：

培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108获得种子液（密度为5×10⁹cfu/ml），然后按照8％（体积比）的接种量接入含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵30小时，然后添加10L产酸培养基，继续培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速300rpm，通气量为1.2vvm，通过流加200g/L的葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

在发酵至20h左右，于每升发酵液中以3ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；

发酵培养基组分为：葡萄糖35g/L、柠檬酸钠10g/L、玉米浆20g/L、氯化铵15g/L、谷氨酸钠25g/L、氯化钙5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1mg/L；

产酸培养基组分为：壳聚糖50mg/L、氯化钠20g/L、琥珀酸5g/L；

发酵液于5000rpm的条件下离心10min，取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀12h，再以8000rpm离心15min，收集沉淀，真空干燥得到农用聚谷氨酸；经检测聚谷氨酸的纯度为87.4%，收率为90.6%。

实施例2

农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：

培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108获得种子液，然后按照8％（体积比）的接种量接入含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵25小时，然后添加10L产酸培养基，继续培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速200rpm，通气量为1.2vvm，通过流加300g/L的葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

在发酵至20h，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；

产酸培养基组分为：壳聚糖40mg/L、氯化钠25g/L、琥珀酸6g/L；

发酵液于6000rpm的条件下离心8min，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀16h，再以8000rpm离心10min，收集沉淀，真空干燥得到农用聚谷氨酸；经检测聚谷氨酸的纯度为85.5%，收率为91.3%。

对比例1

农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：

培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108获得种子液（密度为5×10⁹cfu/ml），然后按照8％（体积比）的接种量接入含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵45h，得到聚谷氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速300rpm，通气量为1.2vvm，通过流加200g/L的葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

发酵液于5000rpm的条件下离心10min，取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀12h，再以8000rpm离心15min，收集沉淀，真空干燥得到农用聚谷氨酸。

对比例2

农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：

产酸培养基组分为：壳聚糖50mg/L、氯化钠20g/L、琥珀酸5g/L；

实施例3

不同发酵方式对聚谷氨酸的影响。

对比例1；对比例2；对比例3：在对比例1的基础上，不流加双氧水。检测发酵液中聚谷氨酸的含量。

聚谷氨酸含量的检测方法：往样品中添加5M的盐酸溶液，95℃水解12h，然后蒸发去除盐酸，高效液相法检测L-谷氨酸的含量。采用水解前后的谷氨酸的含量差来确定聚谷氨酸的含量。具体见表1。

表1

组别	实施例1	对比例1	对比例2	对比例3
					含量g/L	37.2	32.1	34.9	30.4

通过比较发现，发酵中后期添加部分产酸培养基以及流加双氧水能够显著提高聚谷氨酸的产量，较对比例3（不添加产酸培养基以及流加双氧水），提升了22.37%。

实施例4

产酸培养基组分对聚谷氨酸产量的影响。

1、在对比例1的基础上，添加产酸培养基，产酸培养基的组分为壳聚糖，设置壳聚糖的浓度分别为0,10,20,30,40,50,60,70（mg/L），如图1所示，随着壳聚糖浓度的增加，聚谷氨酸的产量逐渐提高，当壳聚糖的浓度为50mg/L时，聚谷氨酸产量达到峰值，继续加大壳聚糖的浓度，聚谷氨酸的产量反而有所下降；发酵后期，通过添加一定量的壳聚糖，壳聚糖上的氨基与菌株细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合金属阳离子,进而改变细胞壁的通透性，促进聚谷氨酸分泌到胞外，但是浓度过高会对菌株造成一定的损伤，不利于菌株正常生长。

2、产酸培养基中选择壳聚糖的添加量为50mg/L，在此基础上，继续添加氯化钠，添加量分别为5,10,15,20,25,30（g/L），如图2所示，当氯化钠含量为20-25g/L时，聚谷氨酸的产量最大，达到36.1g/L左右，氯化钠浓度继续增大时，反而出现下降现象。可能原因是，氯化钠产生一定的渗透压，菌株对高渗环境产生应激反应，从而促进聚谷氨酸的积累。

3、产酸培养基中选择壳聚糖的添加量为50mg/L，氯化钠添加量为20g/L，在此基础上，继续添加琥珀酸，添加量分别为1,3,5,7,9,11（g/L），随着琥珀酸添加量的增大，对乙醛酸循环途径的抑制作用增加，减少进入乙醛酸循环ATP和代谢流量，而从而导致中间代谢物更多地流向三羧酸循环途径，进而促进谷氨酸产量的增加；而且ATP还激活谷氨酸，然后由ATP脱去ppi形成的AMP，与谷氨酸结合，通过一系列酶的作用，不断形成聚谷氨酸片段的延长；可见，琥珀酸可通过多个途径提高聚谷氨酸的产量，如图3所示，琥珀酸选择5g/L的添加量时，聚谷氨酸含量接近峰值，继续增大琥珀酸的量，聚谷氨酸增加幅度较小，综合成本考虑，选择5g/L的浓度最为合适；发明人还发现，选择在发酵初期添加琥珀酸，对聚谷氨酸的影响并不大，可能是因为发酵初期，菌株以增殖为主，聚谷氨酸合成途径并未完全启动，无需对合成途径进行过多干预。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.农用低成本聚谷氨酸的生产方法，其包括如下步骤：

1）将枯草芽孢杆菌种子液按照5-10％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养30小时，然后添加产酸培养基，继续发酵培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；整个发酵培养过程中的温度控制在30-34℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速200-400rpm，通气量为1.0-1.2vvm，通过流加葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：

1）将枯草芽孢杆菌种子液按照5-10％的接种量接入含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵培养30小时，然后添加10L产酸培养基，继续发酵培养15h，得到聚谷氨酸发酵液；整个发酵培养过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.9-7.0，搅拌转速300rpm，通气量为1.2vvm，通过流加200g/L的葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度不低于10g/L，流加消泡剂消泡；

3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，在发酵至20h时，于每升发酵液中以2-4ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束。

4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖30-40g/L、柠檬酸钠5-10g/L、玉米浆10-30g/L、氯化铵10-20g/L、谷氨酸钠20-30g/L、氯化钙3-8g/L、磷酸氢二钾0.1-0.2g/L、磷酸二氢钾0.1-0.2g/L、七水硫酸镁0.1-0.2g/L、七水硫酸亚铁0.1-0.2mg/L。

5.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述产酸培养基组分为：壳聚糖40-80mg/L、氯化钠10-30g/L、琥珀酸3-7g/L。

6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖35g/L、柠檬酸钠10g/L、玉米浆20g/L、氯化铵15g/L、谷氨酸钠25g/L、氯化钙5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1mg/L。

7.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述产酸培养基组分为：壳聚糖50mg/L、氯化钠20g/L、琥珀酸5g/L。

8.按照权利要求1-7生产方法得到的农用聚谷氨酸。