CN103992966B - 一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法。来源于味精厂排口土壤中分离、选育的谷氨酸依赖型甲基营养芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)，已于2013年10月9日，经中国典型培养物保藏中心鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)菌株BT1301；已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？M2013462。以此菌株为发酵菌株，通过斜面菌种活化、菌种液体摇瓶活化和液体深层发酵三级培养，发酵液经无机盐稳定处理，制成γ-聚谷氨酸生物型肥料增效剂，制成的生物复合肥对多种蔬菜病害具有较强的拮抗作用，降低病原菌发病率，对蔬菜生长具有促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术和肥料技术领域，具体涉及一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法。
背景技术
γ–PGA的全名是γ-Polyglutamicacid，是一种微生物发酵产生的细胞外阴离子型多聚氨基酸，由D-和L-谷氨酸通过α-氨基酸和γ-羧基酰胺键连接而高分子聚合物，γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在100KD～1000KD，呈直链纤维状，在γ-聚谷氨酸的分子链上具有大量的活性较高的游离羧基。除了其对人体无毒、生物可降解性和其降解产生对环境友好的终产物谷氨酸等优点外，还包括其具有高吸水性及保水性、良好的控制释放能力、螯合金属离子、与铁、钙、镁锌等形成同离子复合体以获得更佳的营养生物可用性，以及良好的抗植物病原活性，刺激作物及其种子生长以及保护其免受植物病原菌影响，整合植物营养、提供土壤中难溶养分有效性、调整土壤pH等独特功能，使γ-聚谷氨酸在农业上的应用具有较好前景。
专利CN102268389，公开了一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。该甲基营养芽孢杆菌培养时不需要谷氨酸，但产率过低，约17g/L。制得的发酵液经离心去除菌体，上清液加入2～4倍体积的无水乙醇、甲醇或丙酮沉淀聚谷氨酸，4℃静置过夜，用有机溶剂洗涤，去离子水透析除去盐，最后冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸。步骤复杂，其中还需使用大量化学溶剂洗涤沉淀，时间和成本都大大增加。专利申请号CN102703356A，公开了一种聚-γ-谷氨酸作为农用芽孢杆菌保护剂的应用，其中γ-聚谷氨酸也需要经过灭菌、纯化和真空干燥步骤，才能使用γ-聚谷氨酸，步骤复杂，使用操作繁琐，增加了处理的时间和成本，不利于工业生产。
综上所述，节约γ-聚谷氨酸工业生产成本，大大提高发酵产率，以及对发酵液进行简单方便和稳定处理，对γ－聚谷氨酸在农业肥料方面应用具有重要意义。
发明内容
为了克服以上所述之技术问题，本发明提供了一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法，使得γ－聚谷氨酸的生物发酵效率得以大大提高，以及解决传统发酵液处理步骤复杂，使用大量化学溶剂洗涤和沉淀的问题，大大节约工业应用的时间和成本，有利于工业化生产以及环境保护。
本发明的技术方案：为了实现上述目的，本发明一种来源于味精厂排口土壤中分离、选育的谷氨酸依赖型甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，已于2013年10月28日，经中国典型培养物保藏中心鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株BT1301；该菌株已保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2013462。
本发明所述依赖谷氨酸发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301，最初来源于味精厂排口土壤样本，样本经液体培养基富集培养和稀释涂布后，进行摇瓶发酵培养，最后对发酵液的γ-聚谷氨酸进行定性定量分析，最终得到生产γ-聚谷氨酸的菌株，并进行菌株的分离与鉴定。图1是BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落显微照片,显微镜下细长杆状，0.5～0.75μm×1.5～2.5μm，不规则形状，有的细胞呈V形排列；图2是BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落呈白色或灰色、不透明，圆形边缘整齐。
申请人委托中国典型培养物保藏中心(CCTCC)经过序列测定，该甲基营养芽孢杆菌BT1301的16SrRNA核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。菌株BT130116SrRNA基因测序BLAST结果说明：与甲基营养芽孢杆菌具有较高的同源性，相似度为99.86％，鉴定该菌株为甲基营养芽孢杆菌。
甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301具有以下性质：
1.形态特征
在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上营养细胞为0.5～0.75μm×1.5～2.5μm大小的杆菌，当培养基中添加谷氨酸时，见图3，BT1301形成无色半透明隆起菌落，像半粒玻璃珠在平板上；菌落表面光滑边缘整齐、湿润粘稠。
2.生理生化特征见表1和表2
表1生理生化特性—碳源利用
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
表2生理生化特性—酶活
| 检测项目 | 检测结果 |
| NO3硝酸盐还原 | +2 --> |
| TRP吲哚 | - |
| GLU酸化葡萄糖 | - |
| ADH精氨酸双水介酶 | - |
| URE脲酶 | - |
| ESC水解七叶灵(β-葡萄糖苷酶) | + |
| GEL水解明胶(蛋白酶) | + |
| PNPGβ-半乳糖苷酶 | - |
| GEL同化葡萄糖 | + |
| ARA同化阿拉伯糖 | + |
| MNE同化甘露糖 | + |
| MAN同化甘露醇 | + |
| NAG同化N-乙酰-葡萄胺 | + |
| MAL同化麦芽糖 | + |
| GNT同化葡萄糖酸盐 | W |
| CAP同化癸酸 | - |
| ADI同化己二酸 | - |
| MLT同化苹果酸 | + |
| CIT同化柠檬酸 | W |
| PAC同化苯乙酸 | - |
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
利用所述甲基营养芽孢杆菌BT1301发酵生产γ-聚谷氨酸及其制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，用甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301CCTCCM2013462做出发菌株，进行斜面菌种活化、菌种液体摇瓶活化和液体深层发酵三级培养：
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8～12g、酵母膏3～8g、氯化钠9～11g、琼脂15～22g、水1L，pH值6.5～8.0，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度33℃～37℃，培养1～4d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨8～12g、酵母膏3～8g、氯化钠9～11g、水1L，pH值6.5～8.0，500～1000mL三角瓶装液1/3，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速180～250r/min，培养温度33℃～37℃，培养12～36h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：淀粉糖化液(淀粉水解糖的质量浓度10～200g/L)100～400mL/L、氯化钙0.3～0.8g/L、蛋白胨3～8g/L、谷氨酸钠30～60g/L、氯化钠9～15g、硫酸镁1～1.5g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、硫酸锰0.005～0.08g/L；液体深层发酵罐为0.5～50立方米自动控制高密度发酵罐，装液量60％～85％，121℃灭菌20～30min；培养条件为：接种量0.5～5％、搅拌转速250～1000r/min、培养温度33℃～37℃，培养1～4d；
所述生物型肥料增效剂是由深层发酵发酵液与二价离子无机盐组成。
优选地，所述淀粉水解糖为利用木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉的一种或一种以上制备得到的。
所述二价离子无机盐是镁、铁或锌的无机盐中的一种以上。
优选地，所述镁的无机盐包括硫酸镁、氯化镁、草酸镁的一种或一种以上；所述锌的无机盐包括硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、磷酸锌的一种或一种以上；铁的无机盐包括硫酸亚铁、氯化亚铁、硝酸亚铁的一种或一种以上。
优选地，所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:镁盐按质量百分比85～95:5～15组成；或由液体深层发酵发酵液:锌盐按质量百分比85～95:5～15组成；或由液体深层发酵发酵液:锌盐:镁盐:二价铁盐按质量百分比85～95:2～15:1～15:2～15组成。
优选地，所述生物型肥料增效剂与硅藻土按1：1～2质量比混合、干燥制成粉剂。
优选地，所述生物型肥料增效剂粉剂、尿素、磷肥、钾肥、粘土按百分质量比1～5：20～87：5～60：5～60：2～20得到含γ-聚谷氨酸复合肥。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明首次报道发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301。
2、本发明首次报道的发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301是一株谷氨酸依赖型新菌株。
3、本发明首次报道的发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301的γ-聚谷氨酸产率可以达到50g/L,显著高于目前用于生产γ-聚谷氨酸的菌株，有利于肥料工业生产和节约成本。
4、本发明的生物型肥料增效剂是由深层发酵发酵液与无机盐组成，用无机镁盐、或无机锌盐、或者无机镁盐、无机锌盐、和无机亚铁盐的混合做为稳定剂，二价镁离子、二价锌离子、二价铁离子可以通过结合生成络合物的方式，稳定深层发酵发酵液中γ-聚谷氨酸，所以不需要经过无机溶剂沉淀、离心分离等提纯步骤，大大节约了处理步骤，节约化学试剂，即做到环保，又能节约时间和成本。而且，镁、锌、铁也是作物必须营养元素，大大提高作物光合能力，提高本品增效功能。
5、本发明的生物型肥料增效剂不仅含γ-聚谷氨酸、还含有微生物活菌，制成的生物有机肥、生物复合肥对多种蔬菜病害具有较强的拮抗作用，降低病原菌发病率，对蔬菜生长具有促进作用。
6、可以直接和与硅藻土混合、干燥制成粉剂，非常方便农业化肥的使用和存储；生物型肥料增效剂粉剂还可以直接和尿素、磷肥、钾肥、粘土混合制成γ-聚谷氨酸复合肥，可以与传统的肥料成分混合，即增强传统肥料的功效，又没有增加生产工艺的复杂性，有利于肥料的生产和效能。
附图说明
图1.甲基营养芽孢杆菌BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落显微照片；
图2.甲基营养芽孢杆菌BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落形态照片；
图3.甲基营养芽孢杆菌BT1301在含谷氨酸分离培养基上菌落形态照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
具体实施例一
甲基营养芽孢杆菌BT1301的分离、纯化和鉴定
(1)配置培养基
分离培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸钠5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.1g/L，CaCl20.2g/L、琼脂20g/L，PH7.0，121℃灭菌20min。
种子斜面培养基：酵母膏5g/L、蛋白栋10g/L、氯化钠10g/L、PH7.0，121℃灭菌20min。
种子摇瓶培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，MgSO40.1g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl5g/L，pH7.0～7.2，
(2)初筛
称取取自味精厂排污口边土壤样品，风干样10g放入90ml无菌水，170转/分钟，振荡20分钟，然后，80℃恒温水溶20分钟，冷却后，稀释至105、106、107、108涂布，37℃恒温培养1～2天，选生长快、表面光滑的单菌落，平板划线纯化，接种子斜面培养基，37℃恒温培养2～4天后，4℃冷藏保存。
(3)复筛
将初筛得到的菌株接种到灭菌后种子摇瓶培养基中(500ml瓶装液50ml，121℃灭菌20min)，转速220r/min于37℃培养24～36h，发酵液用粘度计测量粘度，选择粘度最大的菌株平板划线纯化，接种子斜面培养基，37℃恒温培养2～4天后，4℃冷藏保存作为生产用菌株。
具体实施例二
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、琼脂20g、水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度35℃培养4d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、水1L，pH值7.5，用1000mL三角瓶分装每瓶培养液300mL，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速220r/min，培养温度35℃，培养36h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：木薯淀粉糖化液(糖质量浓度200g/L)300mL/L、氯化钙0.42g/L、蛋白胨5g/L、谷氨酸钠50g/L、氯化钠10g、硫酸镁1.25g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸锰0.08g/L；液体深层发酵罐为20立方米自动控制高密度发酵罐，装液量80％，接种量2％、121℃灭菌30min；培养条件为：搅拌转速250r/min、培养温度35℃，培养4d，获得γ-聚谷氨酸浓度含量为49g/L发酵液。
采用盐酸水解法，用6mol/L的盐酸，110℃水解24h水解，液相色谱仪测定水解前后谷氨酸含量，聚谷氨酸(以钠盐计)含量＝谷氨酸含量×151/147。
所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:硫酸镁按质量百分比90:10组成。
所述生物型肥料增效剂与水，按1：100倍质量比稀释后马铃薯灌根。
具体实施例三
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨12g、酵母膏8g、氯化钠9g、琼脂22g、水1L，pH值7，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度37℃培养2d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨12g、酵母膏8g、氯化钠9g、水1L，pH值7，用1000mL三角瓶分装每瓶培养液300mL，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速250r/min，培养温度37℃，培养24h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：甘薯淀粉糖化液(糖质量浓度150g/L)200mL/L、氯化钙0.3g/L、蛋白胨3g/L、谷氨酸钠30g/L、氯化钠9g、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸锰0.05g/L；液体深层发酵罐为20立方米自动控制高密度发酵罐，装液量60％，接种量0.5％、121℃灭菌20min；培养条件为：搅拌转速500r/min、培养温度37℃，培养1d，获得γ-聚谷氨酸浓度含量为40g/L发酵液。
采用盐酸水解法，用6mol/L的盐酸，110℃水解24h水解，液相色谱仪测定水解前后谷氨酸含量，聚谷氨酸(以钠盐计)含量＝谷氨酸含量×151/147。
所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:硫酸锌按质量百分比90:10。
所述生物型肥料增效剂与水，按1：100倍质量比稀释后番茄灌根。
具体实施例四
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8g、酵母膏3g、氯化钠9g、琼脂18g、水1L，pH值6.5，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度36℃培养3d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨8g、酵母膏3g、氯化钠9g、水1L，pH值7.5，用1000mL三角瓶分装每瓶培养液330mL，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速180r/min，培养温度36℃，培养30h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：、大米淀粉糖化液(糖质量浓度10g/L)400mL/L、氯化钙0.8g/L、蛋白胨8g/L、谷氨酸钠60g/L、氯化钠15g、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锰0.005g/L；液体深层发酵罐为20立方米自动控制高密度发酵罐，装液量85％，接种量2％、121℃灭菌30min；培养条件为：搅拌转速1000r/min、培养温度36℃，培养2d，获得γ-聚谷氨酸浓度含量为45g/L发酵液。
采用盐酸水解法，用6mol/L的盐酸，110℃水解24h水解，液相色谱仪测定水解前后谷氨酸含量，聚谷氨酸(以钠盐计)含量＝谷氨酸含量×151/147。
所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:硫酸锌:硫酸镁:硫酸亚铁按质量百分比85:5:5:5组成。
所述生物型肥料增效剂与水，按1：20倍质量比稀释后番茄灌根。
具体实施例五
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨9g、酵母膏6g、氯化钠11g、琼脂15g、水1L，pH值8.0，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度37℃培养1d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨9g、酵母膏6g、氯化钠11g、水1L，pH值7.5，用1000mL三角瓶分装每瓶培养液350mL，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速200r/min，培养温度37℃，培养36h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：玉米淀粉和小麦淀粉糖化液(糖质量浓度50g/L)100mL/L、氯化钙0.6g/L、蛋白胨7g/L、谷氨酸钠40g/L、氯化钠12g、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸锰0.05g/L；液体深层发酵罐为20立方米自动控制高密度发酵罐，装液量75％，接种量5％、121℃灭菌30min；培养条件为：搅拌转速800r/min、培养温度37℃，培养4d，获得γ-聚谷氨酸浓度含量为51g/L发酵液。
采用盐酸水解法，用6mol/L的盐酸，110℃水解24h水解，液相色谱仪测定水解前后谷氨酸含量，聚谷氨酸(以钠盐计)含量＝谷氨酸含量×151/147。
所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:氯化镁按质量百分比85:15组成。
所述生物型肥料增效剂与硅藻土按1：1～2质量比混合、干燥制成粉剂。
所述生物型肥料增效剂粉剂、尿素、磷肥、钾肥、粘土按百分质量比5：62：15：10：8得到含γ-聚谷氨酸复合肥。
应用效果：甜玉米肥效试验
实验中，玉米的增产率是施用含γ-聚谷氨酸生物型复合肥的玉米与施用常规复合肥的玉米产量进行对比得到的。
具体实施例六
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨9g、酵母膏4g、氯化钠10g、琼脂17g、水1L，pH值8，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度36.5℃培养2d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨9g、酵母膏4g、氯化钠10g、水1L，pH值8，用1000mL三角瓶分装每瓶培养液330mL，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速240r/min，培养温度36.5℃，培养28h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：玉米淀粉糖化液(糖质量浓度20g/L)250mL/L、氯化钙0.75g/L、蛋白胨4g/L、谷氨酸钠35g/L、氯化钠11g、硫酸镁1.35g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、硫酸锰0.02g/L；液体深层发酵罐为20立方米自动控制高密度发酵罐，装液量60％，接种量1％、121℃灭菌25min；培养条件为：搅拌转速750r/min、培养温度33℃，培养4d，获得γ-聚谷氨酸浓度含量为42g/L发酵液。
采用盐酸水解法，用6mol/L的盐酸，110℃水解24h水解，液相色谱仪测定水解前后谷氨酸含量，聚谷氨酸(以钠盐计)含量＝谷氨酸含量×151/147。
所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:硝酸锌按质量百分比95:5组成。
所述生物型肥料增效剂与硅藻土按1：1～2质量比混合、干燥制成粉剂。
所述生物型肥料增效剂粉剂、尿素、磷肥、钾肥、粘土按百分质量比5：28.4：40：8.2：18.4得到含γ-聚谷氨酸复合肥。
应用效果：小麦肥效试验
对照组是指施用常规复合肥的小麦。
减量20％增产率是指在做对照实验的时候，复合肥的使用量减少20％的情况下，施用含γ-聚谷氨酸复合肥的小麦与施用常规复合肥的小麦产量进行对比得到的。
具体实施例七
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(BacillusmethylotrophicusBT1301CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8g、酵母膏8g、氯化钠10g、琼脂21g、水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度36℃培养3d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、水1L，pH值7.5，用1000mL三角瓶分装每瓶培养液350mL，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速250r/min，培养温度36℃，培养26h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：木薯和小麦淀粉糖化液(糖质量浓度100g/L)250mL/L、氯化钙0.3g/L、蛋白胨5g/L、谷氨酸钠45g/L、氯化钠15g、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸锰0.075g/L；液体深层发酵罐为20立方米自动控制高密度发酵罐，装液量85％，接种量5％、121℃灭菌30min；培养条件为：搅拌转速750r/min、培养温度36℃，培养2d，获得γ-聚谷氨酸浓度含量为47g/L发酵液。
采用盐酸水解法，用6mol/L的盐酸，110℃水解24h水解，液相色谱仪测定水解前后谷氨酸含量，聚谷氨酸(以钠盐计)含量＝谷氨酸含量×151/147。
所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:草酸镁：磷酸锌：硝酸亚铁按质量百分比95:2:1:2组成。
所述生物型肥料增效剂与硅藻土按1：1～2质量比混合、干燥制成粉剂。
所述生物型肥料增效剂粉剂、尿素、磷肥、钾肥、粘土按百分质量比5：28.6：18：43.2：5.2得到含γ-聚谷氨酸复合肥。
应用效果：香蕉肥效试验
在实验中，香蕉的增产率是施用含γ-聚谷氨酸复合肥的香蕉与施用常规复合肥的香蕉产量进行对比得到的。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (8)
1.甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株BT1301，于2013年10月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2013462。
2.用权利要求1所述甲基营养芽孢杆菌BT1301制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，用甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BT1301CCTCCM2013462做出发菌株，进行斜面菌种活化、菌种液体摇瓶活化和液体深层发酵三级培养：
斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面菌种划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8～12g、酵母膏3～8g、氯化钠9～11g、琼脂15～22g、水1L，pH值6.5～8.0，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度33℃～37℃，培养1～4d；
菌种液体摇瓶活化：将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下：蛋白胨8～12g、酵母膏3～8g、氯化钠9～11g、水1L，pH值6.5～8.0，500～1000mL三角瓶装液1/3，121℃灭菌20min；培养条件为：摇床转速180～250r/min，培养温度33℃～37℃，培养12～36h；
液体深层发酵：液体深层发酵培养液组成如下：淀粉水解糖的质量浓度为10～200g/L的淀粉糖化液100～400mL/L、氯化钙0.3～0.8g/L、蛋白胨3～8g/L、谷氨酸钠30～60g/L、氯化钠9～15g、硫酸镁1～1.5g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、硫酸锰0.005～0.08g/L；液体深层发酵罐为0.5～50立方米自动控制高密度发酵罐，装液量60％～85％，121℃灭菌20～30min；培养条件为：接种量0.5～5％、搅拌转速250～1000r/min、培养温度33℃～37℃，培养1～4d；得到深层发酵发酵液；
所述生物型肥料增效剂是由深层发酵发酵液与二价离子无机盐组成。
3.根据权利要求2所述的一种甲基营养芽孢杆菌制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述淀粉水解糖为利用木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉的一种或一种以上制备得到的。
4.根据权利要求2所述的一种甲基营养芽孢杆菌制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述二价离子无机盐是镁、铁或锌的无机盐中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的甲基营养芽孢杆菌制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述镁的无机盐包括硫酸镁、氯化镁、草酸镁的一种或一种以上；所述锌的无机盐包括硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、磷酸锌的一种或一种以上；铁的无机盐包括硫酸亚铁、氯化亚铁、硝酸亚铁的一种或一种以上。
6.根据权利要求2所述的一种甲基营养芽孢杆菌制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:镁盐按质量百分比85～95:5～15组成；或由液体深层发酵发酵液:锌盐按质量百分比85～95:5～15组成；或由液体深层发酵发酵液:锌盐:镁盐:二价铁盐按质量百分比85～95:2～15:1～15:2～15组成。
7.利用权利要求2-6之一所述的方法制得的生物型肥料增效剂粉剂，其特征在于，将权利要求2-6之一所述生物型肥料增效剂与硅藻土按1：1～2质量比混合、干燥制成粉剂。
8.利用权利要求7所述的生物型肥料增效剂粉剂制得的生物型肥料增效剂复合肥，其特征在于，将权利要求7所述生物型肥料增效剂粉剂、尿素、磷肥、钾肥和粘土按质量比1～5：20～87：5～60：5～60：2～20混合得到复合肥。
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