CN113462608B - 一株甲基营养型芽孢杆菌、发酵γ-聚谷氨酸方法及应用 - Google Patents

一株甲基营养型芽孢杆菌、发酵γ-聚谷氨酸方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株甲基营养型芽孢杆菌、发酵γ‑聚谷氨酸方法及应用，所述的甲基营养型芽孢杆菌保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)FEP‑225，于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22792。本发明通过补入含有富氧空气和培养基的微纳米气泡，因其比表面积大、液体中存留时间长，可实现发酵液与富氧空气充分接触，巧妙地避开了因发酵液黏度增高而造成的通气不能打散，从而实现γ‑聚谷氨酸发酵的快速、高效增氧。

Description

一株甲基营养型芽孢杆菌、发酵γ-聚谷氨酸方法及应用
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一株甲基营养型芽孢杆菌、发酵γ-聚谷氨酸方法及应用，具体涉及一株甲基营养型芽孢杆菌、在发酵中使用微纳米曝气技术的增氧方法及应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(英文名称γ-polyglutamic acid,简称γ-聚谷氨酸)是一种由L-谷氨酸或D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而形成的线性高分子化合物，分子量分布在100-2000kDa之间，是一种优良的环保型高分子材料。γ-聚谷氨酸具有水溶性、吸水性、吸附性、无毒性、可生物降解性等优良的特性，在多个领域中具有广泛的应用：农业中被用作肥料增效剂、植物调理剂和土壤改良剂；化妆品行业中被用作保湿剂；食品行业中被用作增稠剂和添加剂；环保行业中用作絮凝剂和吸附剂；医药行业中被用作药物载体等。因此，近年来γ-聚谷氨酸备受关注，需求量逐年增加。
目前，γ-聚谷氨酸主要是通过微生物发酵的方式生产制备，其中使用的反应器绝大部分为通气式机械搅拌发酵罐。然而，γ-聚谷氨酸为高分子聚合物，随着γ-聚谷氨酸的积累发酵液的粘度会迅速升高，此时发酵罐中的挡板和搅拌桨对底部所通气体不能有效打碎、分散，造成气泡变大，气泡在液体中存留时间变短，气体与液体接触面积减少。这将导致气体和液体的混合效果变差，氧气不能有效传质，从而溶氧限制，抑制细胞的生长、代谢，阻碍γ-聚谷氨酸的继续合成。溶氧限制是γ-聚谷氨酸发酵中普遍存在的限制因素，更是阻碍γ-聚谷氨酸高效生产的关键抑制因子。近年来有关γ-聚谷氨酸发酵增氧的装置，通过在反应釜中架设了一系列的传动轴、搅拌轴、活塞杆、螺旋叶片和切割刀叶等，实现富氧空气和发酵液的充分混合接触，从而增加γ-聚谷氨酸发酵叶溶氧，然而此装置机械设计相对复杂、设备费投入大，很难取代现有发酵罐普遍推广；中国专利(授权公布号：CN 103881954A)公布了一株高产γ-聚谷氨酸的基因工程菌，其基因组重组整合了透明颤菌血红蛋白基因(vgb)并成功的高表达了相应蛋白VHb，提高了低溶氧条件下对氧的利用率，实现了γ-聚谷氨酸的高效合成，然而基因工程菌存在操作难度大、遗传不稳定和生物安全风险，这些因素限制了工程菌在生产中的大规模应用。因此，亟需寻找一种适用于现有设备、操作简便、安全无风险、普适性强的γ-聚谷氨酸发酵的增氧方法。
微纳米曝气是一种新型的曝气技术，装置能够将气体和液体混合、切割、破碎，产生大量的直径为0.1-10μm的微纳米气泡。与传统曝气(气泡直径0.5-5mm)相比气泡尺寸减小，比表面积急剧增大，在水中停留时间大幅增长，气泡内的压力明显增加，从而显著提高氧传质的效率。因此，微纳米曝气技术可针对性的解决γ-聚谷氨酸中因发酵液黏度增大、气泡不能打散、气液传质受阻而造成的溶氧限制问题，现阶段该技术已成熟应用于污染处理和鱼虾养殖中的水体快速、高效复氧，然而在γ-聚谷氨酸发酵中的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明提供一株甲基营养型芽孢杆菌、发酵γ-聚谷氨酸方法及应用。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：
一株甲基营养型芽孢杆菌，所述的甲基营养型芽孢杆菌保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)FEP-225，于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22792。
具体的，所述的甲基营养型芽孢杆菌从土壤样品中筛选，经富集、分离和纯化得到。
一种增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，该方法包括将上述的甲基营养型芽孢杆菌接种到斜面活化培养基进行活化，获得活化菌种；将所述的活化的菌种接种到种子培养基中，进行扩大培养，获得种子培养物；将种子培养物接种到发酵罐中的发酵培养基中进行发酵，通过微纳米曝气装置，向发酵罐补入含有发酵培养基的微纳米气泡；发酵结束后，依次进行酒精提纯、透析除盐、冷冻干燥获得γ-聚谷氨酸；
所述的微纳米气泡发生装置中所使用的液体为灭菌后的发酵培养基，所使用的气体为空气或富氧空气，所述富氧空气的氧含量为20％～90％。
具体的，所述种子培养物的接种量为2％～10％；
所述的发酵罐为通气式机械搅拌发酵罐，发酵时的培养温度为30～37℃，搅拌转速为150～500rpm，所通气体为空气或富氧空气，通气量为1.0～2.0vvm，培养48～96h。
具体的，所述的微纳米气泡发生装置的曝气量为0.1～5.0L/min，所述气体/液体的流量比为1/3～1/20；
测定发酵罐内发酵液的溶氧含量，当发酵罐内发酵液中溶氧含量降至30％以下时，所述微纳米气泡发生装置自动补入含有发酵培养基的微纳米气泡，至发酵罐内发酵培养基的溶氧含量为30％～100％时停止。
具体的，所述的斜面活化培养基的成分包括蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0～7.4；将活化的菌种进行扩大培养时的培养条件为30～37℃培养24～48h；
所述的发酵培养基成分包括柠檬酸10～30g/L，谷氨酸20～80g/L，硫酸铵10～30g/L，葡萄糖30～100g/L，K2HPO4 1～3g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g/L，FeCl3·6H2O 0.02～0.06g/L，MnSO4·H2O 0.1～0.3g/L，CaCl2 0.2～0.6g/L，pH7.0～8.0。
具体的，所述的种子培养基成分包括蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0～7.4；
种子培养物包括一级种子培养物或二级种子培养物，所述一级种子培养物的培养条件为：摇瓶中30～37℃、150～200rpm，培养24～48h；
所述二级种子培养物是将一级种子培养物接种于种子罐中，培养条件为：培养温度为30～37℃，搅拌转速为150～200rpm，通气量为1.0～2.0vvm，培养24～48h。
具体的，所述的酒精提纯包括采用稀硫酸调节发酵液pH至3.0，于4800r/min下离心28～32min，向上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，沉淀γ-聚谷氨酸，离心获得粗品。
具体的，所述的透析除盐包括采用去离子水溶解酒精提纯后获得的粗品，调节pH值为3.0～4.0，装入透析袋，在去离子水中进行透析、脱盐。
本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌或本发明所述的γ-聚谷氨酸增氧发酵方法用于生产γ-聚谷氨酸。
与现有技术相比，其优点与积极效果在于：
1)可增加γ-聚谷氨酸发酵中的溶氧含量，通过补入含有富氧空气和培养基的微纳米气泡，因其比表面积大、液体中存留时间长，可实现发酵液与富氧空气充分接触，巧妙地避开了因发酵液黏度增高而造成的通气不能打散，从而实现γ-聚谷氨酸发酵的快速、高效增氧；
2)与原有批次发酵工艺相比γ-聚谷氨酸的产量提高了近114.0％，通过微纳米曝气可以将γ-聚谷氨酸发酵液中的溶氧保持在较高的范围内，保障了细胞的氧供应，解除发酵中后期的溶氧限制，从而有效提高γ-聚谷氨酸的产量；
3)本发明中的微纳米曝气技术，仅是增加了一台微纳米气泡发生装置，不需对原有设备进行大规模的改动或是淘汰，普适性强、操作简单、成本低廉、无二次污染、对菌株无特殊要求、便于大规模应用于生产，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明微纳米曝气增氧技术的设备结构示意图；
图2为10L发酵罐中发酵生产γ-聚谷氨酸结果；
图3为100L发酵罐中发酵生产γ-聚谷氨酸结果；
图4为500L发酵罐中发酵生产γ-聚谷氨酸结果。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。
具体实施方式
下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中所用的实验试剂均为市售所得，并未做进一步处理，检测仪器设备等均为常用的仪器。
接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。
在本发明中，发酵罐内发酵液的溶氧含量通过在线的光学溶氧电极(VISIFERM DOARC120，Hamilton，瑞士)测定，其中测量原理为氧气的荧光相关性，测量范围为空气饱和氧的0.05-300％，检测极限为0.01％。
本发明所用微纳米气泡发生装置为市售的微纳米气泡发生装置，如南京兰江水处理设备有限公司生产，型号为WNM。
在本发明中，微纳米气泡发生装置向发酵罐中所补充的微纳米气泡为气液混合物，具体为空气和发酵培养基发酵液，所述气体/液体的流量比是指空气与发酵液的流量比。
实施例1：
本实施例给出一株甲基营养型芽孢杆菌，所述的甲基营养型芽孢杆菌保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)FEP-225，于2021年06月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.22792。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明所提供的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)FEP-225，是从土壤样品中筛选得到的甲基营养型芽孢杆菌。
所述的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)FEP-225的分离鉴定方法具体如下：
(1)平板初筛
取陕西太白县某地土壤样品10g加入90mL无菌水中，放入恒温振荡培养箱中振荡5min，得10-1样品稀释液，再放入80℃水浴15min进行预处理，后取1mL上清液加入9mL无菌水中，得到10-2稀释液、如此方法依次得到10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释液，每个浓度稀释液取0.1mL涂布于分离平板培养基中，一个浓度梯度三个平行，35℃倒置培养24h，然后观察平板上的菌落形态特征。
(2)菌株的分离纯化
挑取在初筛平板中菌落凸起、表面粘稠、能拉丝、生长迅速的单菌落在平板上进行四区划线进行分离培养，在37℃恒温培养48h，反复进行分离纯化，直至获得较为粘稠的单菌落，将得到的单菌进行编号，并转接到斜面培养基上37℃培养24h，并于4℃冰箱保存。
(3)摇瓶初筛
将分离纯化得到的菌株接种于摇瓶发酵培养基中，35℃，240r/min，培养2d，测定发酵液中γ-PGA的产量，选取产量较高的γ-PGA菌株，进行下一步的复筛。
(4)摇瓶复筛
将摇瓶初筛得到的高产γ-PGA的菌株再次接种于摇瓶发酵培养基中，35℃，240r/min，培养3d，测定发酵液中γ-PGA产量，得到稳定高产γ-PGA的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)FEP-225，γ-PGA摇瓶产量为31.2g/L。
其中分离培养基配方为(g/L)：葡萄糖20，柠檬酸10，谷氨酸钠10，(NH4)2SO4 6，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O 0.02，CaCl2 0.2，MnSO4·H2O 0.05，琼脂20，pH7.2-7.5，115℃灭菌30min。
发酵培养基配方为(g/L)：柠檬酸5，谷氨酸钠50，硫酸铵10，葡萄糖80，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 1，FeCl3·6H2O 0.1，MnSO4·H2O 0.05，CaCl20.1，pH 7.0，补水至1000mL。
菌株FEP-225的菌落形态特征为：菌落呈纯白色、扁平、不透明、近似圆形。部分生理生化性质如下表1所示：
表1.FEP-225部分生理生化特性
Figure GDA0004158626720000081
表1的“+”表示反应为阳性，“—”表示反应为阴性。
分子生物学鉴定：提取菌株全基因组DNA，PCR扩增16S rDNA片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。
实施例2
本实施例给出一种增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，将本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌接种到斜面活化培养基进行活化，获得活化菌种；将所述的活化的菌种接种到种子培养基中，进行扩大培养，获得种子培养物；将种子培养物接种到发酵罐中的发酵培养基中进行发酵，通过微纳米曝气装置，向发酵罐补入含有发酵培养基的微纳米气泡；发酵结束后，进行酒精提纯、透析除盐、冷冻干燥获得γ-聚谷氨酸；
所述的微纳米气泡发生装置中所使用的液体为灭菌后的发酵培养基，所使用的气体为空气或富氧空气，所述富氧空气的氧含量为20％～90％。
所述种子培养物的接种量为2％～10％；
所述的发酵罐为通气式机械搅拌发酵罐，通入的是空气，发酵时的培养温度为30～37℃，搅拌转速为150～500rpm，所通气体为空气或富氧空气，通气量为1.0～2.0vvm，培养48～96h。
所述的微纳米气泡发生装置的曝气量为0.1～5.0L/min，所述气体/液体的流量比为1/3～1/20；测定发酵罐内发酵液的溶氧含量，当发酵罐内发酵液中溶氧含量降至30％以下时，所述微纳米气泡发生装置自动补入含有发酵培养基的微纳米气泡，至发酵罐内发酵培养基的溶氧含量为30％～100％时停止。
作为本实施例一种优选方案，以10L发酵罐中采用甲基营养型芽孢杆菌FEP-225增氧发酵生产γ-聚谷氨酸为例，包括以下步骤：
将甲基营养型芽孢杆菌FEP-225接种到斜面活化培养基37℃培养24h进行活化，获得活化菌种；其中，斜面活化培养基组分：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min，冷却、制作斜面。
将所述的活化的菌种接种到种子培养基中，进行扩大培养，获得种子培养物；其中，种子培养基组分：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min。
具体包括采用接种环挑取2环活化后的甲基营养型芽孢杆菌FEP-225，接种于种子培养基中，37℃、摇床转速150rpm，培养24h，获得种子培养物(本实施例为一级种子培养物)
将种子培养物接种到发酵罐中的发酵培养基中进行发酵，通过微纳米曝气装置，向发酵罐补入微纳米气泡；其中，种子培养物包括一级种子培养物或二级种子培养物，一级种子培养物的培养条件为：摇瓶中30～37℃、150～200rpm，培养24～48h；二级种子培养物是将一级种子培养物接种于种子罐中，培养条件为：培养温度为30～37℃，搅拌转速为150～200rpm，通气量为1.0～2.0vvm，培养24～48h。
其中，发酵培养基组分：柠檬酸10g/L，谷氨酸30g/L，硫酸铵10g/L，葡萄糖60g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L，CaCl2 0.2g/L，pH7.0，121℃灭菌30min，其中葡萄糖和其他成分分开灭菌。
本实施例的优选方案中，具体包括：将上述一级种子培养物接种到10L发酵罐中的发酵培养基中，接种量8％(v/v)，温度37℃，搅拌转速300rpm，通气量1.5vvm，初始发酵体积为4L；当发酵液中溶氧含量降至0％时，微纳米曝气装置向发酵罐补入含有富氧空气和灭菌培养基的微纳米气泡，至溶氧含量升至30％停止。
富氧空气的氧含量为60％，装置曝气量为0.1L/min、气体/液体的流量比为1/5；培养48h后结束发酵，整个过程中发酵液的溶氧含量每小时记录一次，每6h取发酵液10mL检测。
发酵结束后，依次进行酒精提纯、透析除盐、冷冻干燥获得γ-聚谷氨酸；
具体的：酒精提纯包括采用稀硫酸调节发酵液pH至3.0，于4800r/min下离心30min去除发酵液中甲基营养型芽孢杆菌的菌体，防止污染后期提纯的γ-聚谷氨酸，上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，沉淀γ-聚谷氨酸，离心获得粗品；
透析除盐包括采用去离子水溶解酒精提纯后获得的粗品，调节pH值为3.0，装入透析袋，在去离子水中进行透析、脱盐；
冷冻干燥包括将脱盐后的样品进行真空冷冻干燥，获得γ-聚谷氨酸成品。
对获得γ-聚谷氨酸成品进行γ-聚谷氨酸产量检测，操作方法如下：
将冻干样品溶于去离子水中，定容至500mL，使用紫外分光光度计进行检测，其中检测波长为215nm；使用梯度稀释的标准γ-聚谷氨酸样品绘制吸光度的标准曲线，通过标准曲线确定供试样品中γ-聚谷氨酸的含量。
本实施例以现有的发酵工艺最为对照组，方法包括将上述种子培养物接种到10L发酵罐中，接种量8％(v/v)，发酵体积为7L，温度37℃，搅拌转速300rpm，通气量1.5vvm，培养48h后结束发酵；不采用微纳米曝气装置。
本实施例和现有发酵工艺发酵生产γ-聚谷氨酸的结果如图2所示：对照组(现有发酵工艺)发酵液中的溶氧含量在16h降为0％，此后不再增长；本实施例微纳米曝气发酵中，发酵液中溶氧含量也是在16h附近第一次降为0％，此后一直在0％～30％之间波动，直至发酵结束。
所对应的γ-聚谷氨酸浓度结果为：现有发酵工艺中，发酵结束时，发酵液体积变化不大，最终γ-聚谷氨酸浓度为18.4g/L；本实施例的微纳米曝气发酵中，发酵结束时，发酵液体积升至7.2L，最终γ-聚谷氨酸浓度为27.8g/L，与对照组相比，γ-聚谷氨酸的产量提高了51.1％。
实施例3：
本实施例给出100L发酵罐中甲基营养型芽孢杆菌FEP-225用于增氧发酵生产γ-聚谷氨酸的示例。在工业发酵中，发酵罐体积过大，接种量大的种子液需要经过几级的放大，因此，与实施例2不同的是，本实施例进行了二级放大。
在实施例2获得一级种子培养物后，将一级种子培养物接种于10L的种子罐，接种量为8％，发酵温度为37℃、搅拌转速为200r pm、通气量为1vvm，培养24h，获得二级种子培养物。
将上述二级种子培养物接种到100L发酵罐中，接种量8％(v/v)，温度37℃，搅拌转速400rpm，通气量2.0vvm，初始发酵体积为40L；微纳米曝气装置曝气量为1L/min、气体/液体的流量比为1/4；培养48h后结束发酵。
对照组包括将上述二级种子培养物接种到100L发酵罐中，接种量8％(v/v)，发酵体积为70L，温度37℃，搅拌转速400rpm，通气量2.0vvm，培养48h后结束发酵。
γ-聚谷氨酸的产量检测结果如图3所示：对照组(现有发酵工艺)发酵液中的溶氧含量在9h降为0％，此后不再增长；本实施例微纳米曝气发酵中，发酵液中溶氧含量在9h附近第一次降为0％，此后一直在0％～30％之间波动，直至发酵结束。
所对应的γ-聚谷氨酸浓度结果为：现有发酵工艺中，发酵结束时，发酵液体积变化不大，最终γ-聚谷氨酸浓度为25.4g/L；本实施例的微纳米曝气发酵中，发酵结束时，发酵液体积升至81L，最终γ-聚谷氨酸浓度为42.7g/L，与对照组相比，γ-聚谷氨酸的产量提高了68.1％。
实施例4：
本实施例给出500L发酵罐中甲基营养型芽孢杆菌FEP-225增氧发酵生产γ-聚谷氨酸的示例。
与实施例2不同的是，在实施例2获得一级种子培养物后，将一级种子培养物接种于50L的种子罐，接种量为8％，发酵温度为37℃、搅拌转速为200r pm、通气量为1vvm，培养24h，获得二级种子培养物。
将上述二级种子培养物接种到500L发酵罐中，接种量8％(v/v)，温度37℃，搅拌转速400rpm，通气量1.5vvm，初始发酵体积为250L。当发酵液中溶氧降至20％时向发酵罐补入含有富氧空气和灭菌培养基的微纳米气泡，至溶氧升至50％停止，其中富氧空气的氧含量为80％、装置曝气量为3L/min、气体/液体的流量比为1/4；培养48h后结束发酵，整个过程中发酵液的溶氧含量每小时记录一次，每6h取发酵液10mL检测。
对照组包括将上述二级种子培养物接种到500L发酵罐中，接种量8％(v/v)，发酵体积为350L，温度37℃，搅拌转速360rpm，通气量1.5vvm，培养48h后结束发酵。
γ-聚谷氨酸的产量检测结果如图4所示：对照组(现有发酵工艺)发酵液中的溶氧含量在12h降为20％，此后不再增长；本实施例微纳米曝气发酵中，发酵液中溶氧含量在13h附近第一次降为20％，此后一直在20％～50％之间波动，直至发酵结束。
所对应的γ-聚谷氨酸浓度结果为：现有发酵工艺中，发酵结束时，发酵液体积变化不大，最终γ-聚谷氨酸浓度为24.1g/L；本实施例的微纳米曝气发酵中，发酵结束时，发酵液体积升至390L，最终γ-聚谷氨酸浓度为51.6g/L，与对照组相比，γ-聚谷氨酸的产量提高了114.1％。
实施例4相比实施例2和3，γ-聚谷氨酸的产量提高了114.1％原因是：实施例1所使用的发酵罐体积10L，为实验室小试级别，微纳米增氧后产量提高了51.1％；实施例2所使用的发酵罐体积100L，为中试级别，微纳米增氧后产量提高了68.1％；实施例3所使用的发酵罐体积为500L，为生产级别，微纳米增氧后产量提高了114.1％。
综上所述，随着发酵规模的增加，使用微纳米增氧后聚谷氨酸产量提升的幅度越大。这可能是因为反应器规模越大，气液混合、传质的难度越大，聚谷氨酸发酵在大规模反应器中的溶氧限制便越严重，因而在大规模的聚谷氨酸发酵中使用微纳米气泡增氧会效果会更加明显，从而更大幅度的提高生产效率。
此外，微纳米曝气时，向发酵罐中所补充的富氧空气微纳米气泡为气液混合物，每补充一次气泡便同时补充了一定比例的液体培养基，因此初始发酵体积在发酵罐体积的50％以下，否则以本实施例的500L的发酵罐为例，若是初始发酵体积达到450L的话，补充不了几次，发酵罐容积将被发酵液充满，至溢出，发酵不可继续进行，对发酵γ-聚谷氨酸的产量有不利影响。
对比例1
本对比例与实施例3不同的是：当发酵液中溶氧降至20％时向发酵罐补入含有富氧空气和灭菌培养基的微纳米气泡，至溶氧升至100％停止，其余条件均不变化；对照组的发酵条件设置也同实施例3。
所对应的γ-聚谷氨酸发酵结果为：对照组的现有发酵工艺中，发酵结束时，发酵液体积变化不大，最终γ-聚谷氨酸浓度为23.7g/L，菌体浓度为2.1g/L；本对比例的微纳米曝气发酵中，发酵结束时，发酵液体积升至420L，最终γ-聚谷氨酸浓度为24.2g/L，菌体浓度为6.4g/L。
与对照组相比，γ-聚谷氨酸的产量仅提高了2.1％，而菌体浓度提高了204.8％。因此，过高的溶氧对γ-聚谷氨酸产量提高帮助不大，但是会造成发酵菌株的过度生长，使原料的产物转化率降低，造成了原料的浪费，发酵液中菌体密度过大还会给下游的γ-聚谷氨酸提取、纯化带来巨大的困难。
实施例5
本实施例与实施例4不同的是：种子培养物的接种量为2％；富氧空气的氧含量为90％，微纳米气泡发生装置的曝气量为0.1L/min，所述气体/液体的流量比为1/3，培养96h后结束发酵。
实施例6
本实施例与实施例3不同的是：种子培养条件为：摇瓶中32℃、180rpm，培养42h；种子培养物的接种量为5％；富氧空气的氧含量为40％，微纳米气泡发生装置的曝气量为2.5L/min，所述气体/液体的流量比为1/20，培养48h后结束发酵。
实施例7
本实施例与实施例2不同的是：种子培养物的接种量为10％；富氧空气的氧含量为60％，微纳米气泡发生装置的曝气量为0.1L/min，所述气体/液体的流量比为1/3，培养72h后结束发酵。

Claims (9)

1.一种增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，该方法包括将甲基营养型芽孢杆菌接种到斜面活化培养基进行活化，获得活化的菌种；将所述的活化的菌种接种到种子培养基中，进行扩大培养，获得种子培养物；将种子培养物接种到发酵罐中的发酵培养基中进行发酵，通过微纳米气泡发生装置，向发酵罐补入含有发酵培养基的微纳米气泡；发酵结束后，依次进行酒精提纯、透析除盐、冷冻干燥获得γ-聚谷氨酸；
所述的甲基营养型芽孢杆菌保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) FEP-225，于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22792；
所述的微纳米气泡发生装置中所使用的液体为灭菌后的发酵培养基，所使用的气体为空气或富氧空气，所述富氧空气的氧含量为20%～90%；
测定发酵罐内发酵液的溶氧含量，当发酵罐内发酵液中溶氧含量降至30%以下时，所述微纳米气泡发生装置自动补入含有发酵培养基的微纳米气泡，至溶氧含量升至30%时停止，在整个发酵过程中，溶氧含量维持在0%～30%；或当发酵罐内发酵液中溶氧含量降至20%时，所述微纳米气泡发生装置自动补入含有发酵培养基的微纳米气泡，至溶氧含量升至50%时停止，在整个发酵过程中，溶氧含量维持在20%～50%。
2.如权利要求1所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌从土壤样品中筛选，经富集、分离和纯化得到。
3.如权利要求1或2任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述种子培养物的接种量为2％～10％；
所述的发酵罐为通气式机械搅拌发酵罐，发酵时的培养温度为30～37℃，搅拌转速为150～500rpm，所通气体为空气或富氧空气，通气量为1.0～2.0vvm，培养48～96h。
4.如权利要求1或2任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述的微纳米气泡发生装置的曝气量为0.1～5.0L/min，气体/液体的流量比为1/3～1/20。
5.如权利要求1或2任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述的斜面活化培养基的成分包括蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0～7.4；将活化的菌种进行扩大培养时的培养条件为30～37℃培养24～48h；
所述的发酵培养基成分包括柠檬酸10～30g/L，谷氨酸20～80g/L，硫酸铵10～30g/L，葡萄糖30～100g/L，K2HPO4 1～3g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g/L，FeCl3·6H2O 0.02～0.06g/L，MnSO4·H2O 0.1～0.3g/L，CaCl2 0.2～0.6g/L，pH7.0～8.0。
6.如权利要求1或2任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，种子培养基成分包括蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0～7.4；
种子培养物包括一级种子培养物或二级种子培养物，所述一级种子培养物的培养条件为：摇瓶中30～37℃、150～200rpm，培养24～48h；
所述二级种子培养物是将一级种子培养物接种于种子罐中，培养条件为：培养温度为30～37℃，搅拌转速为150～200rpm，通气量为1.0～2.0vvm，培养24～48h。
7.如权利要求1或2任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述的酒精提纯包括采用稀硫酸调节发酵液pH至3.0，于4800r/min下离心28～32min，向上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，沉淀γ-聚谷氨酸，离心获得粗品。
8.如权利要求1或2任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述的透析除盐包括采用去离子水溶解酒精提纯后获得的粗品，调节pH值为3.0～4.0，装入透析袋，在去离子水中进行透析、脱盐。
9.权利要求1～8任一所述的增氧发酵γ-聚谷氨酸的方法用于生产γ-聚谷氨酸。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103992966A (zh) * 2014-04-14 2014-08-20 深圳市芭田生态工程股份有限公司 一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法
WO2020239936A1 (en) * 2019-05-29 2020-12-03 Chr. Hansen A/S Composition comprising biofilm forming bacillus
CN114058549A (zh) * 2021-11-29 2022-02-18 中国农业科学院农产品加工研究所 贝莱斯芽孢杆菌Shui-6、生产方法及用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI556837B (zh) * 2014-07-18 2016-11-11 國立清華大學 用於藥物傳遞之奈/微米氣泡
CN110042129B (zh) * 2019-04-16 2022-09-13 广西多得乐生物科技有限公司 一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法
CN110016446B (zh) * 2019-04-16 2022-10-04 广西多得乐生物科技有限公司 一株贝莱斯芽孢杆菌及其生产聚谷氨酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103992966A (zh) * 2014-04-14 2014-08-20 深圳市芭田生态工程股份有限公司 一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法
WO2020239936A1 (en) * 2019-05-29 2020-12-03 Chr. Hansen A/S Composition comprising biofilm forming bacillus
CN114058549A (zh) * 2021-11-29 2022-02-18 中国农业科学院农产品加工研究所 贝莱斯芽孢杆菌Shui-6、生产方法及用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Yingyun Peng 等."High-level production of poly(γ-glutamic acid) by a newly isolated glutamate-independent strain, Bacillus methylotrophicus".《Process Biochemistry》.2015,第50卷(第3期),第1-38页. *
黄斌良 等."贝莱斯芽孢杆菌 PG1-2 生产γ-聚谷氨酸的发酵培养基和培养条件优化".《基因组学与应用生物学》.2021,第40卷(第7-8期),第2635-2642页. *

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