CN110042129B - 一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农业用γ‑聚谷氨酸的制备方法，包括微生物发酵、膜过滤和喷雾干燥三个步骤。本发明的农业用γ‑聚谷氨酸的制备方法与传统方法相比，简化了聚谷氨酸的后处理工艺，降低了生产成本，同时还提高了聚谷氨酸的回收率，为聚谷氨酸的工业化生产提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种由D-谷氨酸单体和L-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基之间形成的肽键连接形成的一种中性高分子聚合物，分子量通常介于100KD-1000KD之间。γ-聚谷氨酸具有多种独特的物理、化学及生物学特性，如良好的水溶性、超强的吸附能力及具有生物降解性，并且其降解产物对人体和环境无毒害性等。可作为增稠剂、保水剂、缓释剂、药物载体等应用于工业、农业、食品及医学等领域。
γ-聚谷氨酸多由微生物发酵合成得到，常用的微生物主要为地衣芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌属。微生物发酵法合成条件温和，对环境压力较小，并且成本较小，是目前的主要研究方向。
目前公开的关于γ-聚谷氨酸发酵菌株的专利，有以下相关文献：
专利申请号：201710277707.0，专利名称：一种利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开了利用γ-PGA产生菌地衣芽孢杆菌CICC10099生产聚谷氨酸的工艺：在37℃，200rpm，pH 5-8条件下摇瓶发酵50h，γ-PGA产量可达到40g/L。
专利申请号：200610155277.7，专利名称：一种制备γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开了一种制备γ-聚谷氨酸的方法，该方法采用不同γ-聚谷氨酸生产菌株，在含有碳源、氮源、NaCl和不同谷氨酸发酵中间产物的培养基中培养，得到γ-聚谷氨酸发酵液，通过有机溶剂沉淀、透析、干燥得到γ-聚谷氨酸产品。该发明工艺简单，用谷氨酸发酵生产的中间产物作为γ-聚谷氨酸发酵生产的谷氨酸前体，与谷氨酸前体相比较，减少了谷氨酸的分离纯化过程，降低了生产成本，而且产量高。
专利申请号：201410327118.5，专利名称：一种合成γ-聚谷氨酸的菌株以及利用其高效制备γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开了一种γ-聚谷氨酸的合成菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus subtilis NS-9，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCCNo.M 2014142。该发明还公开了上述的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法。和现有生产γ-聚谷氨酸技术相比，本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株可以高效的发酵生产γ-聚谷氨酸；通过对枯草芽孢杆菌菌株培养条件的优化，特别是在发酵过程中补加碳源、无机盐及能量物质，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达100～200g/L，从而提供一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
专利申请号：201711135486.X，专利名称：一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法。该发明涉及一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法,包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；种子液的制备；将种子液接种于发酵培养基中发酵；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚谷氨酸，干燥，制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。该发明通过实验室对农业级聚谷氨酸的发酵研究中发现钾盐类对农业级聚谷氨酸合成具有较大促进作用，而且在提高产量的同时相比化妆品级别的聚谷氨酸，其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。
专利申请号：201210371783.5，专利名称：枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28，保藏编号为CCTCC No.M 2012347的菌株通过菌种活化、保藏、种子液制备、液体摇瓶发酵、γ-聚谷氨酸提取纯化制备γ-聚谷氨酸。该发明可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，在40-50℃的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸，发酵时间18-25h，产量最高可达20-30g/L，具有高效、低成本的优点。
专利申请号：201611254131.8，专利名称：一种高温喷雾干燥制备γ-聚谷氨酸粉末的方法，本发明公开了一种高温喷雾干燥制备γ-聚谷氨酸粉末的方法。γ-聚谷氨酸提取液经喷雾干燥得到γ-聚谷氨酸粉末；所述的γ-聚谷氨酸提取液，其含γ-聚谷氨酸的浓度为质量分数5-20％，pH为3-8。本发明采用高温喷雾干燥法对γ-聚谷氨酸提取液进行干燥制粉，不仅降低生产成本,提高工业化生产效率，而且具有节能减排、绿色环保的优点。
从目前查到的文献来看，聚谷氨酸的后期制备主要通过微生物发酵、板框过滤除菌、乙醇沉淀、干燥等步骤完成，工艺复杂，回收率低，不利于聚谷氨酸的工业化生产。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为克服上述现有问题，本发明提供一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：转接菌种至发酵罐中，维持发酵温度35-45℃，通气量1.0-2.0vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵PH 6.5-7.0，发酵48-60h，得到发酵液；
(2)膜过滤：将所得发酵液添加2-4倍体积水，混合均匀后过滤，得到浓缩液；
(3)喷雾干燥：将所得浓缩液加热，进行喷雾干燥。
作为优选，所述步骤(1)中菌种为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15718。
作为优选，所述步骤(1)中菌种以5-10％的体积比接种到发酵培养基中。
作为优选，所述步骤(1)中通过添加碱性和酸性物质维持发酵过程的pH值，所述碱性物质为氨水和NaOH，酸性物质为柠檬酸。
作为优选，所述步骤(1)中发酵前期通气量维持在1.0vvm，搅拌速度维持在150rpm。
作为优选，所述步骤(2)中混合均匀后采用中空纤维膜过滤至发酵液1/2-1倍原体积。
作为优选，所述中空纤维膜截留分子量为30kDa-100kDa。
作为优选，过滤过程中过滤压力不超过0.4MPa。
作为优选，所述步骤(3)中将浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃。
作为优选，所述步骤(3)喷雾干燥时浓缩液中聚谷氨酸含量调整为20-40g/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的农业用γ-聚谷氨酸的制备方法通过微生物发酵、膜过滤和喷雾干燥三个步骤就实现农业用γ-聚谷氨酸的制备，与传统方法相比，简化了聚谷氨酸的后处理工艺，降低了生产成本。
(2)本发明的农业用γ-聚谷氨酸的制备方法所得产品分子量为200-800kDa，性状为白色或淡白色粉末，其中聚谷氨酸含量为20-40％，能够满足农业用聚谷氨酸的需求。
(3)本发明的农业用γ-聚谷氨酸的制备方法与传统方法相比，有效提高了聚谷氨酸的回收率，为聚谷氨酸的工业化生产提供了可能。
保藏信息说明
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，保藏编号为CGMCC No.15718，保藏单位为中国微生物菌种保藏中心。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明实施例中菌种为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2；菌种液体培养基为(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨5，KH2PO4 1，K2HPO4 1，MgSO4-7H2O 0.2，初始pH7.0-7.2；发酵培养基(g/L)：蔗糖60，酵母粉20，谷氨酸钠60，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2。
实施例1
一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养16h至对数生长中期；菌种以5％的体积比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中；维持发酵温度35℃，发酵PH 6.4，发酵前期：0-36h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：36-60h，维持通气量调整为1.5vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵至60h停止，得到发酵液，检测聚谷氨酸含量为38.6g/L；
(2)膜过滤：将所得发酵液添加60L水，混合均匀后用中空纤维膜过滤；其中中空纤维膜截留分子量为30kDa，过滤压力0.2Mpa，浓缩至30L，得到浓缩液，检测聚谷氨酸含量为34.8g/L，回收率94.57％；
(3)喷雾干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥，收集干燥所得粉末；其中喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；固体粉末中聚谷氨酸含量为24.1％，回收率85.26％；
经过3个步骤制备得到农业用γ-聚谷氨酸粉末，总回收率80.63％，所得固体粉末中聚谷氨酸含量为24.1％。
实施例2
一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：转接菌种以5％的体积比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中；维持发酵温度35℃，发酵PH 6.5，发酵前期：0-24h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：24-48h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵至48h停止，得到发酵液；检测聚谷氨酸含量为42.2g/L；
(2)膜过滤：将所得发酵液添加90L水，混合均匀后用中空纤维膜过滤；其中中空纤维膜截留分子量为50kDa，过滤压力0.2Mpa，浓缩至30L，得到浓缩液，检测聚谷氨酸含量为37.2g/L，回收率88.15％；
(3)喷雾干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥，收集干燥所得粉末；其中喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；固体粉末中聚谷氨酸含量为35.8％，回收率89.82％；
经过3个步骤制备得到农业用γ-聚谷氨酸粉末，总回收率79.17％，所得固体粉末中聚谷氨酸含量为35.8％。
实施例3
一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：转接菌种以10％的体积比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中；维持发酵温度45℃，发酵PH 7.0，发酵前期：0-24h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：24-48h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为250rpm，发酵至48h停止，得到发酵液，检测聚谷氨酸含量为36.5g/L；
(2)膜过滤：将所得发酵液添加120L水，混合均匀后用中空纤维膜过滤；其中中空纤维膜截留分子量为100kDa，过滤压力0.35Mpa，浓缩至20L，得到浓缩液，检测聚谷氨酸含量为46.8g/L，回收率85.48％；
(3)喷雾干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥，收集干燥所得粉末；其中喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；固体粉末中聚谷氨酸含量为43.6％，回收率90.16％；
经过3个步骤制备得到农业用γ-聚谷氨酸粉末，总回收率77.06％，所得固体粉末中聚谷氨酸含量为43.6％。
实施例4
一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：转接菌种以10％的体积比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中；维持发酵温度35℃，发酵PH 6.5，发酵前期：0-36h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：36-60h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为250rpm，发酵至60h停止，得到发酵液检测聚谷氨酸含量为44.7g/L；
(2)膜过滤：将所得发酵液添加120L水，混合均匀后用中空纤维膜过滤；其中中空纤维膜截留分子量为30kDa，过滤压力0.15Mpa，浓缩至30L，得到浓缩液，检测聚谷氨酸含量为39.4g/L，回收率88.14％；
(3)喷雾干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥，收集干燥所得粉末；其中喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；固体粉末中聚谷氨酸含量为45.2％，回收率89.95％；
经过3个步骤制备得到农业用γ-聚谷氨酸粉末，总回收率79.28％，所得固体粉末中聚谷氨酸含量为45.2％。
表1本发明的制备方法得到聚谷氨酸回收率及含量测定
| 处理 | 聚谷氨酸粉末总回收率(％) | 固体粉末中聚谷氨酸含量(％) |
| 实施例1 | 80.63 | 24.1 |
| 实施例2 | 79.17 | 35.8 |
| 实施例3 | 77.06 | 43.6 |
| 实施例4 | 79.28 | 45.2 |
由表1可以看出，本发明实施例1-4中聚谷氨酸总回收率均大于77％，而且通过微生物发酵、膜过滤和喷雾干燥三个步骤就实现农业用γ-聚谷氨酸的制备，与传统方法相比，简化了聚谷氨酸的后处理工艺，降低了生产成本，为聚谷氨酸的工业化生产提供了可能。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养16h至对数生长中期；转接菌种至发酵罐中发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，发酵过程中维持发酵温度、通气量、搅拌速度和发酵PH值；
(2)离心除菌：将所得发酵液添加水，混合均匀后，离心，收集上清液；
(3)过滤浓缩：将所得上清液用膜过滤浓缩，得到浓缩液；
(4)干燥：将所得浓缩液加热后，干燥；
步骤(1)中所述的菌种液体培养基为(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨5，KH2PO4 1，K2HPO4 1，MgSO4-7H2O 0.2，初始pH 7.0-7.2；
步骤(1)中所述的发酵培养基(g/L)：蔗糖120，酵母粉20，蛋白胨5，谷氨酸钠80，KH2PO41，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2；
所述步骤(1)中菌种为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15718；
所述步骤(1)中菌种以5％的体积比接种到发酵培养基中；
所述步骤(1)中维持发酵温度35-50℃，通气量1.0-2.0vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵pH 6.5-7.0，发酵60-72h后停止发酵；其中发酵前期，通气量和搅拌速度分别控制在1.0vvm和150rpm，发酵后期随着发酵液黏度增加，需要增加通气量和搅拌速度；发酵后期，调整发酵温度为50℃至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过添加氨水或柠檬酸维持发酵过程中的pH值。
3.根据权利要求1所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵液添加10-15倍体积的水，离心速度为12000rpm，离心1h。
4.根据权利要求1所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至原体积的1/2-1倍。
5.根据权利要求4所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述中空纤维膜截留分子量为300-500kDa，过膜压力0.1-0.3Mpa。
6.根据权利要求1所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中浓缩液加温至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃。
7.根据权利要求6所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，喷雾干燥时浓缩液中聚谷氨酸含量调整为20-40g/L；喷雾干燥所得产品为白色或淡黄色粉末，无丝状物出现。
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