CN107190032A - 含几丁质的复合物及含葡萄糖、甘露糖/半乳糖的聚合物 - Google Patents

含几丁质的复合物及含葡萄糖、甘露糖/半乳糖的聚合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在有氧条件下，通过生物反应器中的毕赤酵母高细胞密度发酵，共生产氨基葡萄糖聚合物(几丁质、壳聚糖或其任意衍生物)及含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物的方法，所述方法优选使用来自生物柴油工业的甘油副产物作为碳源。纯甘油、纯甲醇、富含甘油或富含甲醇的混合物也可用作碳源。本发明还涉及为获得高细胞密度和高细胞壁几丁质含量，以及含有葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物所进行的适时优化的毕赤酵母发酵方法。

Description

含几丁质的复合物及含葡萄糖、甘露糖/半乳糖的聚合物
本申请是2009年7月22日提交的名称为“通过毕赤酵母发酵共生产几丁质、其衍生物以及包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物的方法”的发明专利申请200980130292.8的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及采用低成本原材料，以高产量微生物生产几丁质和包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物，及其衍生物的方法。因此，在此描述了采用来自生物柴油生产的甘油副产物作为优选碳源，基于毕赤酵母的高细胞密度生物反应器培养毕赤酵母的生产方法。
所涉及的生物聚合物广泛用于农业食品工业、化妆品、生物医学、纺织品、其他工业、方法及医学应用的污水处理中。
【背景技术】
聚合物是高分子量的分子，由一个或多个称作单体的结构单元聚合而成。由糖单体(单糖)形成的聚合物被称为多糖。小分子(寡糖)可由后者通过化学的或酶的部分水解得到。
几丁质是由D-氨基葡萄糖(GlcN)和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)残基通过β-(1-4)连接键(参见图表，其中(1)和(2)分别表示GlcN和GlcNAc)连接而组成的线性多糖。几丁质分子形成分子内氢键产生三种不同的晶型，不同晶型的产生取决于它们的排列，α-几丁质，最普通和稳定的形式，以链的反平行排列为特征，而β-几丁质则由平行层形成。最少见的形式，g-几丁质，以一反平行链和两个平行链为特征。
[化学式1]
氢键是几丁质在水中和在大多数有机溶剂中溶解度低的原因。酸或碱溶液引起聚合物水解和脱乙酰化，并因此不适于其溶解。氢键也是几丁质材料明显缺少熔点以及几丁质材料聚合物高硬度和低渗透性的原因。
几丁质的物理化学性质也与两个结构单体的比例密切相关。当聚合物中的GlcN摩尔分数(称为脱乙酰度，％DD)高于50％时，聚合物称为壳聚糖，是几丁质的主要衍生物。由于其乙酰基含量低，壳聚糖在弱酸中可溶，具有聚合电解质特征及较高的反应性。壳聚糖通常由几丁质脱乙酰化来获得。
由于这些特征，壳聚糖目前具有比几丁质更多的应用。它的高特异结合能力用来移除油、重金属、蛋白质以及废水中的细颗粒物质(Hennen,1996)。相同的特性使其可用于亲和层析(Synowiecki et al.,2003)以及减少胆固醇的吸收。壳聚糖经过人的消化道，并通过结合低密度胆固醇，限制其吸收进入血流(ICNHP,1995；Hennen,1996)。
在食品工业，壳聚糖作为二氧化碳和病原微生物的屏障，主要用作鸡蛋和水果的涂层(Hennen,1996；Kim et al.,2007)，由此延长了食物产品的寿命。它也用作乳化剂，以及饮料的防腐剂和澄清剂(Kim,2004；Synowiecki et al.,2003)。由于其高稳定性和较低的静电特征，壳聚糖也用在化妆品，也就是在头发产品中(Kim,2004)。
由于其衍生物的生物相容性和生物降解能力，壳聚糖的生物医学应用已越来越有价值，上述能力允许其应用于包括伤口愈合(Hamliyn et al.,2004；Tanabe et al.,2006；Singh et al.,2000)、组织支架(Tangsadthakun et al.,2007)，药物释放系统(Singh etal.,2000)等等。
几丁质主要的应用包括其作为缝合材料(Hamliyn et al.,2004；Okada et al.,2000；Singh et al.,2000)，作为被细菌或真菌感染的动物中的抗原(Singh et al.,2000)或作为被细胞壁中具有几丁质的生物体污染的土壤中的几丁质酶生产增强剂(Okada etal.,1999；Hallman et al.,1999)。它也被用作制造透气织物，例如短袜(ICNHP,1995)。
与合成的聚合物相反，几丁质和壳聚糖是可生物降解的，这使得它们的使用具有环境益处。
除了壳聚糖外，几丁质衍生物包括GlcNAc C6羟基被其它基团，像是例如烷基或羧基取代的多糖。这些新基团的插入增强了聚合物的功能性，因此使得开发新的应用，例如新纤维、凝胶等等成为可能。
几丁质是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的生物聚合物。它主要发现于节肢动物门和甲壳纲动物门生物体体的角质层和外骨骼，以及酵母和真菌的细胞壁中。在这些生物体中，几丁质给细胞提供了硬度和机械强度，并在减数分裂期间扮演了重要角色(Kelleret al.,1970；Momany et al.,1997)。尚未在细菌或粘菌纲真菌中发现几丁质或其任何衍生物的存在。从甲壳动物和节肢动物中提取的几丁质较微生物的几丁质更为坚硬，且具有更高的脱乙酰程度。
大多数商业上可获得的几丁质和几丁质衍生物是从甲壳纲动物的外壳中得到的，例如蟹、虾和龙虾。提取方法通常包括三个步骤：去除矿物质，去除蛋白和脂质，以及脱色。第一步是通过将外壳与酸(通常是HCl)混合来完成，而蛋白和脂质的去除则是在乙醇存在的情况下在碱性介质(NaOH或KOH)中进行的。
天然色素的去除(尤其是类胡萝卜素)是通过采用有机溶剂，例如丙酮、氯仿或乙醇与乙醚的混合物的洗涤来实现的。
然而，由于原料的季节性特征以及外壳成分随物种功能和动物年龄的可变性，使得这一方法相当昂贵且重复性低。物种如龙虾和蟹的外骨骼的硬度也造成了提取的困难，且使其更昂贵。此外，由于从甲壳类外壳中提取的几丁质是动物来源的，其在制药和生物医学上的应用受到了食品与药品管理局(FDA)的高度限制。蛋白以及动物吸收的污染物质的存在也造成了几丁质纯化的困难。由于过敏性反应的可能性，从甲壳类动物提取的聚合物较少适用于生物医学应用。
尽管在节肢动物和甲壳纲动物中几丁质与外壳的蛋白和矿物(主要是钙盐)聚集在一起，而在微生物中它却与其它细胞壁多糖相连。它的还原链终端与β-(1,3)-葡聚糖(葡萄糖聚合物)的非还原末端相连，该非还原末端与β-(1,6)-葡聚糖、半乳-甘露聚糖(由半乳糖和甘露糖残基形成的聚合物)和糖蛋白相连。细胞壁成分取决于菌株，且它在生物体的生长期中也是可变的。改变发酵条件，例如培养基成分和含量(例如，可利用的底物)，温度或溶解氧浓度(Aguilar-Uscanga et al.,2003)，可导致每个细胞壁成分相对比例的变化。
几丁质的微生物生产允许使用廉价的原料，具有几乎不受限制的可用性，并允许方法的连续优化。细胞壁对可用环境条件的适应对方法的优化是有益的。事实上，已经证明了通过添加含特定离子和酶促几丁质合成的前体的培养基，可增强通过发酵进行的几丁质生产(Camargo et al.,1967；Keller et al.,1970)。聚合物的成分和性质也比从甲壳纲动物中由传统提取方法获得的聚合物的成分和性质更为稳定。
目前，除了采用遗传操纵的生物体，没有使用微生物生产几丁质的最优化程序(Hammer et al.,2006)。大多数商业上可获得的微生物几丁质是从啤酒工业中的卡氏酵母或柠檬酸生产中的黑曲霉中提取的(Versali et al.,2003)。对于后者，几丁质的比例可占到微生物细胞壁的42％。然而，浸没的黑曲霉培养物不能达到如一些酵母那么高的细胞密度。另一方面，由卡氏酵母生产的几丁质达不到细胞干重的8％以上。也可以采用一些可食用蘑菇培养产生的废弃物，例如野生bisporusand A.伞菌(Agaricus bisporusandA.campestris)(GB2259709)，但几丁质的含量不高于生物体干重的8％。
毕赤酵母是半子囊菌纲/酵母菌目酵母，通常用来表达异源蛋白。相较其它用于生产几丁质的微生物而言，该物种主要优点是其在各种各样的底物上发酵的过程中在保持细胞壁中几丁质的高百分比的同时可达到高细胞密度，所述底物包括葡萄糖、甲醇或粗甘油。此外，甘油是来自生物柴油工业的低成本副产物，可大量获得且据报导可有效地应用于毕赤酵母的生长(et al.,2008)。因此，在毕赤酵母生产几丁质和壳聚糖中使用来自生物柴油工业的甘油副产物，可成为一种限价方法。此外，由于不需要采用高溶解氧浓度来使培养物生长，所以操作成本降低了。
目前，对于本发明的目标，使用毕赤酵母进行生物聚合物的工业生产尚未有可用的报道。
【发明概述】
本发明描述了毕赤酵母用作细胞壁多糖，例如几丁质、包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物，或其衍生物产品，的生产生物的用途，其中使用了低成本底物，例如来自生物柴油工业的甘油副产物。
用于此目的的生物体可以是为表达异源蛋白，例如表达下游工艺中使用的酶的野生型毕赤酵母菌株，其变体或突变体，或遗传工程菌株，组成型或甲醇利用型(MUT)菌株
这些多糖的生产率与微生物的细胞生长密切相关。因此，该方法被优化来达到高细胞生长率和高细胞密度，以使得用毕赤酵母生产几丁质或壳聚糖在经济上切实可行。
鉴于此，本发明描述了采用来自生物柴油工业的甘油副产物作为优选碳源，通过毕赤酵母的有氧发酵生产含有氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖的细胞壁多糖的方法。可选的碳源包括纯甘油、甲醇和葡萄糖或其混合物。
将低成本的甘油副产物用作主要的碳源是重要的优势，因为它允许生产成本相较其它高纯度和更昂贵底物降低。通过采用以连续模式及优选在氧传输能力提高的压力下进行的发酵方法，体积生产率可最大化，由此获得更高的细胞密度。
在毕赤酵母发酵期间，溶解氧浓度维持在饱和浓度的5％以上。该参数由碳源的添加来控制，所述添加可以连续或半连续的进行的。通过这种方式，可达到高细胞密度，避免了厌氧环境，且实现了代谢活性的最大化。
在发酵期间生产的多糖的提取可通过文献中描述的从真菌或酵母细胞壁中提取聚合物的任何方法来进行(例如Synowiecki et al.,2003)。本发明中使用的化学方法，除了产生富含几丁质的多糖混合物外，它还导致了不同比例的包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的其它多糖的产生，其可在一些农业食品和生物医药中有应用。
化学提取操作有聚合物降解的风险。可选地，用蛋白酶和溶菌酶降解蛋白质材料和细胞壁葡聚糖的酶提取程序可被采用。虽然它们是污染更少的方法，但却具有成本相对高的缺点。
【附图说明】
图1-采用纯甘油(99％)或来自生物柴油工业的甘油副产物(86％)作为碳源的发酵过程中毕赤酵母细胞干重的分布图。
【发明详述】
1.聚合物的生产
1.1微生物-本发明涉及通过野生型毕赤酵母，其变体和突变体发酵生产几丁质和含有葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物，及其衍生物。
1.2发酵培养基-毕赤酵母的发酵是在含有碳源、氮源和无机盐的液体培养基中进行的。
碳源优选是由生物柴油工业产生的富含甘油的混合物。也可使用纯甘油、甲醇、葡萄糖或其混合物。任选地，毕赤酵母能够在其它几种化合物上生长，包括单体、二聚体或低聚体形式的酒精、糖、有机酸、脂肪酸或氨基酸，
所有这些底物可以是纯的化合物或，优选源自农业-工业的废弃物或副产物，例如生物柴油工业。氮源，优选的，是氨，但也可使用铵盐或有机氮化合物(例如酵母提取物、尿素或蛋白胨)。
发酵培养基也包括含有离子(例如Ca2+,K+,Mg2+,SO4 2-,PO4 3-)的盐及微量金属，例如钴、铜、锰和铁。
所描述的培养基仅仅是可用于毕赤酵母生长的众多底物的示例，它们不应认为是限制。
1.3发酵条件
本发明涉及采用毕赤酵母发酵生产细胞壁多糖，例如几丁质、含有葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物，或其衍生物产品的任何程序或方法。更具体地，本发明描述了可促使毕赤酵母生长达到高细胞密度以及在微生物细胞壁中高几丁质/葡聚糖含量的一些方法。
发酵是在液体培养基中以压缩空气通风的条件下进行。温度控制在10～60℃之间，优选在20～40℃之间，且通过自动添加碱(例如NaOH、KOH或NH3)，将pH值控制在1.0～10.0之间，优选在3.0～8.0之间。当使用氨或氢氧化铵时，它们也可作为氮源。
随着细胞生长，发酵液中的溶解氧浓度逐渐降低。这种下降是由菌株的特定生长速率决定的。根据生物反应器的容量和限制，通过控制搅拌速度、空气流通速度、压力、温度和/或限定碳源的补料速度避免了氧气限制。
为了达到高细胞密度，操作模式可为连续式或分批式，且可具有初始分批期。
当该方法在分批模式下启动时，当碳源达到生长限制浓度时开始发酵液补给，然后，优选地保持指数补料速度一直到溶解氧浓度达到之前根据反应器特性界定的临界阈值。补料溶液由碳源和2％(v/v)的盐溶液组成。如果pH值是用除了氨之外的碱来控制，则补料溶液应包括与初始培养基中存在的碳/氮比例(大约3:1)相同的氮源。
细胞壁多糖的生产是生长相关的。因此，当培养物进入静止生长期时，分批补料发酵终止。如果这个程序是以连续模式运行的，那么只要溶解氧浓度不下降到0％，稀释率就保持在接近冲洗阈值。
几丁质和壳聚糖的产量在10～40g/L之间变化，分别可达到10g/L。这些值根据所达到的细胞密度而变化，常常高于150g/L。通过在利于将其生产与细胞生长解偶联的条件下延长发酵，可提高生物质中的几丁质/壳聚糖含量。这样的条件包括在静止生长期提高温度(高达30℃)、pH值(在5～8之间)或离子强度。伴随着几丁质/壳聚糖的生产，本发明的方法也预见了含有葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的细胞壁多糖的共生产，其可占细胞干重的45％。
2.发酵产品的提取和纯化
可用来提取和纯化本发明所述多糖的方法描述如下。
细胞通过过滤、滗析或离心从发酵液中分离，后者目前是最有效的方法。
分离的细胞，优选通过离心分离，用碱溶液(pH值在10.0以上)处理以除去脂质、蛋白及核酸。蛋白和核酸通过与高浓度的强碱(NaOH或KOH)反应被降解，同时脂质通过与有机溶剂(例如乙醇、甲醇、丙酮)或去垢剂反应来去除。这些过程需花费30分钟到3小时，取决于温度(65-90℃)的不同，且可连续或同时进行，这使得该方法花费更少，并提高了产量。
由此获得的不溶性物质主要由无机物质、几丁质及其衍生物和其它不溶性的多糖，例如葡聚糖和甘露聚糖组成。可溶性的多糖，即多支链β-葡聚糖和α-1,3-葡聚糖以及半乳甘露聚糖(由甘露糖和半乳糖残基组成的聚合物)留在了上清中。
在离心和用水及乙醇(或其它有机溶剂，例如甲醇、二乙醚或丙酮)洗涤后，几丁质被从其它不溶性多糖中分离出来。为了上述目的，使用乙酸在75℃以上温度进行部分水解(或其它弱酸)，或使用稀HCl(或其他无机酸)在50℃温度进行部分水解。该过程使得之前未被提取出的一些支链β-1,6-葡聚糖溶解。大多数葡聚糖通过碱抽提被回收，接着通过离心来回收其中包括几丁质的不溶性组分。
不溶性物质悬浮在热的强碱(NaOH)中来溶解碱溶性葡聚糖。温度应在20℃以上，但在75℃以下，以避免几丁质的降解。
不可溶物质通过离心和用水及乙醇(或其它有机溶剂)彻底洗涤来回收。然后，壳聚糖通过溶解在2％(v/v)的乙酸中，并经离心分离来提取。壳聚糖留在上清中，而沉淀则含有几丁质及其它不可溶聚合物。调节pH值到6.0，壳聚糖沉淀出来，并通过离心回收。
含有几丁质和其它不可溶聚合物(几丁质/葡聚糖复合物)的沉淀被溶解在含5％氯化锂的二甲乙酰胺(DMAC)或二甲亚砜(DMSO)溶液中。溶液稳定搅拌至少12小时，以完全溶解聚合物。离心除去不溶的物质后，几丁质/葡聚糖复合物通过加水沉淀下来。DMAC(或DMSO)溶液用水混合数次，直到没有更多沉淀形成。提取的几丁质/葡聚糖复合物用水彻底洗涤以除去所有的溶剂。最后的步骤是在60℃的温度下干燥或冷冻干燥。
任选地，在用强碱处理时可采用苛刻条件，由此获得完全脱乙酰化的几丁质到壳聚糖。这些极端条件包括提高温度到128℃，采用15N的碱浓度或增加反应时间到7小时。
以上描述的提取和纯化过程导致除几丁质/葡聚糖复合物外的其它聚合物的一些组分的产生。这些聚合物主要是由葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖残基组成的多糖。
碱溶性的细胞壁葡聚糖主要由β-(l,3)和β-(1，6)糖苷键组成。它们通过溶解在碱溶液中进行提取，然后通过在不溶混溶剂中沉淀或通过透析来回收，得到约4％的碱溶性葡聚糖。
【实施例】
实施例1：甘油中的毕赤酵母发酵
将750mL的毕赤酵母DSMZ 70877培养物接种到成分如表1所示的14.25L的发酵培养基中。发酵在控制温度和pH值(分别是30℃和5.0)的中试规模生物反应器(LP351,50L,BioEngineering,Switzerland)中进行。在整个运行期间，空气流通速度保持在30L/分钟，压力维持在0.10巴。pH值通过添加氢氧化铵来控制。初始搅拌速度是300rpm。
发酵30小时后，溶解氧浓度(pO2)下降到50％。从这时开始，通过增加搅拌速度到1000rpm，来控制溶解氧浓度为20％。当搅拌速度达到440rpm时，开始往生物反应器中补入溶液，所述溶液含有甘油(990g/L)及表1所示的24g/L的矿物质溶液。补料速度呈指数，且根据预期的细胞生长速率来计算。
表1：发酵培养基成分。
[表1]
[表格]
成分 浓度(g/L)
CaSO4.2H2O 0.93
K2SO4 18.20
MgSO4.7H2O 14.90
KOH 4.13
甘油(99％) 40.00
消泡剂 0.40
H3PO4(85％) 26.70mL
矿物质溶液* 4.35mL
(*矿物质溶液成分：6.0g/L CuSO4.5H2O,0.08g/L NaI,3.0g/L MnSO4.H2O,0.2g/LNa2MoO4.2H2O,0.02g/L H3BO3,0.5g/L CoCl2,20.0g/L ZnCl,65.0g/L FeSO4.7H2O,0.2g/L生物素e 5.0mL/L H2SO4。)
当达到最大搅拌速度(1000rpm)时(大约发酵44小时时)，通过限制底物将pO2控制在20％。不断调整补料溶液的添加速度，以防止pO2下降到20％以下。
在70h发酵内，培养物进入静止生长期，运行终止。细胞通过发酵液的离心(8000rpm，45分钟)来回收，并冷冻干燥。每升发酵液可得237g细胞。
实施例2：通过在来自生物柴油工业的甘油副产物中发酵毕赤酵母发酵生产几丁质/葡聚糖复合物
实施例1中描述的方法用于毕赤酵母DSMZ 70877的生长。用含有86％甘油的、来自生物柴油工业的甘油副产物来替代纯甘油。考虑到新底物的组分，对补料溶液的流动速度进行了调整。图1中给出了在这两种运行情况下细胞干重的变化。
发酵结束时，获得了224g/L生物质。达到静止生长期的时间比用纯甘油发酵提早了6小时。
采用Synowiecki et al.(2003)提出的提取方法，获得了0.352g几丁质/葡聚糖复合物，相当于毕赤酵母生物质的11.7％。考虑到发酵结束时获得的细胞密度，聚合物生产率为每天8.99kg/m3。
采用用于葡聚糖分析的酶试剂盒(K-YBG,Megazyme)，生物质中葡聚糖含量为14％，而提取的几丁质/葡聚糖复合物含有38.2％的葡聚糖。酸水解后通过液相色谱检测，葡萄糖和氨基葡萄糖是唯一的糖单体。因此，提取的几丁质/葡聚糖复合物具有9％的几丁质，1％的湿气，4％的灰末和6％的蛋白。
考虑这些结果得到的结论是实施例2中获得的生物质中的几丁质含量为3％。
参考文献
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本说明书包括如下内容：
1.几丁质以及含有葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物的共生产方法，其特征在于采用由生物柴油工业生产的富含甘油的副产物作为碳源发酵毕赤酵母野生型菌株。
2.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于，使用其他碳源替代生物柴油工业生产的所述富含甘油的副产物，所述碳源可以是含有单体、二聚体或低聚体形式的甘油、酒精、糖、有机酸、多元醇、脂肪酸或氨基酸的混合物。
3.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于所述碳源可以是食品或工业的废物或副产物，其含有项目1中提及的一个或多个化合物，例如：单体、二聚体或低聚体形式的甘油、酒精、糖、有机酸、多元醇、脂肪酸或氨基酸。
4.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于通过添加维生素、阳离子、阴离子或特定用于此目的的任何其它有机化合物或矿物质来提高细胞壁多糖的含量。
5.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于生物体是项目1中提及的物种的变体或突变体，或者是用来表达用于几丁质和/或葡聚糖的提取和/或纯化和/或处理其各自的衍生物或其它重组蛋白的酶的项目1中提及的物种的遗传改良菌株。
6.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于通过自动添加含有碳源的培养基控制溶解氧浓度以使细胞密度及细胞壁多糖的比体积生产率最大化。
7.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于通过操纵下列参数：压力、温度、搅拌速度、通风、氧富集、采用流体或磁性纳米颗粒，或碳源添加速度，使发酵在溶解氧浓度高于1％的情况下进行。
8.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于发酵液的温度控制在10～50℃之间，优选在20～40℃之间。
9.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于发酵液的pH值控制在3.0～10.0之间，优选在pH 5.0～7.0之间。
10.如项目1所述的共生产多糖的方法，其特征在于通过添加碱、氨或铵盐来控制发酵液的pH值。
11.如项目1-10所述的共生产多糖的方法，其特征在于以最优的发酵条件进行发酵，以在分批、补料分批或连续发酵模式下获得高细胞密度。
12.如项目1-11所述的共生产多糖的方法，其特征在于发酵期间获得的生物聚合物通过以下步骤从其他细胞组分中分离并被纯化：
a.通过过滤或滗析从发酵液中分离细胞，目前通过离心分离所述细胞更为有效；
b.通过以1:0～1:3比例添加浓碱溶液(0.5～5.0M KOH、NaOH或其它强碱)及有机溶剂(甲醇、乙醇或其它有机溶剂)除去蛋白、脂质和核酸；
c.通过添加酸(0.1-5.0M HCl)和碱(0.5-5.0M NaOH)依次溶解仅含有中性糖的聚合物，以从其它聚合物中分离几丁质/葡聚糖复合物；
d.采用包括在有机溶剂或弱酸，优选醋酸中沉淀的单元操作，回收和纯化按b)和c)的描述来提取的含有葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物；
e.通过酶或化学方法经选择性水解从几丁质/葡聚糖复合物中纯化几丁质和/或葡聚糖。
本说明书还包括如下内容：
1.几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物的生产方法，包括在包含由生物柴油工业产生的富含甘油的副产物作为优选碳源的培养基中发酵毕赤酵母(Pichia pastoris)，且获得的几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物的含量至少为所生产的总干细胞重量的15％。
2.根据实施方式1的方法，其中所述的由生物柴油工业产生的副产物包含100％的甘油作为碳源。
3.根据实施方式1的方法，其中所述的由生物柴油工业产生的副产物选择性地包含富含甲醇的副产物和/或甘油-甲醇混合物。
4.根据实施方式3的方法，其中所述的由生物柴油工业产生的副产物包含100％的甲醇作为碳源。
5.根据以上任一实施方式的方法，其中所述培养基进一步包含单体、二聚体或低聚体形式的酒精、糖、有机酸、多元醇，脂肪酸和/或氨基酸，和/或包含上面提及的化合物中一个或多个的食品或工业废弃物或副产物。
6.根据以上任一实施方式的方法，其中温度维持在高于37℃和/或pH维持在低于5以在几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物中富集几丁质。
7.根据以上实施方式1-5任一项的方法，其中温度维持在高于45℃和/或pH维持在5-6之间以在几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物中富集壳聚糖。
8.根据以上实施方式1-5任一项的方法，其中温度维持在低于35℃和/或pH维持在高于6以在几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物中富集葡聚糖。
9.根据以上任一实施方式的方法，其中所获得的几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物的含量是所生产的总生物质的至少20％。
10.根据以上任一实施方式的方法，其中几丁质-葡聚糖复合物的体积生产率至少为0.5g/L.h。
11.根据以上任一实施方式的方法，其中酵母细胞密度高于100g/L。
12.根据以上任一实施方式的方法，其中除了几丁质-葡聚糖-复合物和/或衍生物外，在所述发酵期间获得的生物聚合物还包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的水溶性多糖。
13.根据以上实施方式的方法，其中在发酵期间获得的生物聚合物包含至多占细胞干重45％的葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖多糖。

Claims (10)

1.一种生产下列的方法：
(i)包含几丁质和葡聚糖的几丁质-葡聚糖-复合物；和
(ii)包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物，
所述方法包括：
(1)在发酵培养基中发酵野生型毕赤酵母(Pichia pastoris)DSMZ70877，
所述发酵培养基包含氮源，且
所述发酵培养基还包含下列作为碳源：
(a)甘油或葡萄糖；或
(b)包含甘油和/或葡萄糖的食品或工业的废物或副产物；和
(2)通过添加碱、氨或铵盐来在发酵期间将pH值控制在3.0～8.0之间的值。
2.权利要求1的方法，其中在发酵期间将温度控制在20至40℃。
3.权利要求2的方法，其中在发酵期间温度被控制在30℃。
4.权利要求1的方法，其中酵母细胞密度高于150g/L。
5.权利要求1的方法，其中在发酵期间获得的聚合物除所述几丁质-葡聚糖-复合物外还包含为葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的水溶性多糖的聚合物。
6.权利要求1的方法，其中所述碳源还包括纯甘油、甲醇、葡萄糖或它们的混合物。
7.权利要求5的方法，其中所述工业的副产物为富含甘油混合物。
8.权利要求5的方法，其中所述工业的副产物为富含葡萄糖混合物。
9.权利要求1的方法，其中生物质中几丁质-葡聚糖-复合物的含量是至少11.7％.。
10.权利要求1的方法，其中所述包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物占发酵的细胞干重的45％。
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