BRPI0916850B1

BRPI0916850B1 - processo para a produção de complexo quitina-glucano que compreende quitina/quitosana e glucano; e polímeros contendo glicose, manose, e/ou galactose a partir de subproduto da indústria do biodiesel

Info

Publication number: BRPI0916850B1
Application number: BRPI0916850A
Authority: BR
Inventors: Luísa Braga Da Cruz Ana; Eduardo Pio Barbosa Pereira Da Cunha António; Ferreira Chagas Bárbara; José Vazão Mano Clemente João; D'ascenção Carvalho Fernandes De Miranda Reis Maria; Filomena Andrade De Freitas Maria; Manuel Freitas Oliveira Rui
Original assignee: 73100 Setenta E Tres Mil E Cem Lda
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2019-08-27
Also published as: NZ590760A; CA2732234C; RU2562172C2; US8614070B2; EP2321419A2; EP2321419B1; MX2011001173A; AU2009278045B2; KR20110036821A; JP2011529339A; DK2321419T3; ES2657441T3; AU2009278045A1; ZA201100530B; WO2010013174A4; BRPI0916850A2; HK1243736A1; WO2010013174A3; PL2321419T3; US20140120584A1

Abstract

processo de co-produção de quitina, seus derivados e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, por cultivo da levedura pichia pastoris a presente invenção refere-se a um processo para a coprodução de polímeros de glucosamina (quitina 1 quitosano ou qualquer um dos seus derivados) 1 e de glucose 1 manose e galactose 1 por cultivo da levedura pichia pastoris até elevadas densidades celulares em bio-reator em condições aeróbias 1 usando preferencialmente o subproduto da indústria do biodiesel rico em glicerol como principal fonte de carbono. pode ainda ser utilizado glicerol de elevada pureza ou misturas contendo glicerol. a presente invenção diz ainda respeito a um processo de cultivo da levedura p. pastoris devidamente otimizado para obtenção de elevada densidade celular e elevada percentagem mássica de qui tina na parede celular 1 assim como de polímeros contendo glucose 1 manose e/ou galactose.

Description

[001] A presente invenção diz respeito a um processo para produção, em elevadas quantidades, de quitina e de polímeros de glucose, manose e/ou galactose e seus derivados, por via microbiana usando matérias-primas de baixo custo. Desta forma, é descrito um processo de produção baseado no cultivo,

em bio-reator	de elevada densidade	celular, da levedura	P.
pastoris,	usando preferencialmente	como	fonte de carbono	um
subproduto	da	produção de biodiesel,	rico	em glicerol.
[002	]	Estes compostos têm	uma	vasta aplicação	na

indústria agro-alimentar, na biomedicina, nas indústrias cosmética e dos têxteis, tratamento de efluentes, entre outros.

Estado da Técnica [003] Polímeros são macromoléculas químicas de elevado peso molecular, formados pela polimerização de uma ou mais unidades estruturais, denominadas por monômeros. Quando os monômeros são carboidratos (monossacarídeos), o polímero denomina-se por polissacarídeo. Destes, podem-se obter moléculas menores (oligossacarídeos) por hidrólise química ou enzimática.

[004] A quitina é um polissacarídeo estrutural constituído por resíduos de D-glucosamina (GlcN) e N-acetil-Dglucosamina (GlcNAc) unidos linearmente entre si através de ligações β - (1-4) (ver esquema onde (1) representa GlcN e (2)

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GlcNAc). O seu emparelhamento pode originar três formas cristalinas, dependendo do modo como as diferentes macromoléculas se associam por via de pontes de hidrogênio. A forma a, a mais estável e comum, caracteriza-se por um emparelhamento antiparalelo, enquanto a β-quitina é formada por camadas paralelas. A forma γ, mais rara, é caracterizada por duas cadeias paralelas e uma terceira antiparalela.

[005] formação

A

___n (2) das pontes de hidrogênio é responsável pela baixa solubilidade da quitina tanto em água como na maioria dos solventes orgânicos. O uso de soluções básicas ou ácidas promove a sua desacetilação e hidrólise, pelo que não são indicadas para a solubilização do polímero. A formação de pontes de hidrogênio é também responsável pela aparente ausência de temperatura de fusão, assim como pela elevada rigidez e pouca permeabilidade dos materiais compostos por quitina.

[006] Para além do peso molecular e arranjo espacial, as propriedades físico-químicas da quitina estão intimamente relacionadas com a proporção dos seus dois monômeros estruturais. A fração molar de resíduos de GlcN no polímero é conhecida por percentagem de desacetilação (%DD). Caso a %DD seja superior a 50%, o polímero é denominado por quitosano, o

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3/21 seu derivado mais importante. A menor quantidade de radicais acetil no quitosano permite que este seja solúvel em ácidos fracos, conferindo-lhe assim propriedades de polieletrólito e maior reatividade. Em geral, este polissacarídeo é obtido por desacetilação da quitina.

[007] Estas características fazem com que atualmente o quitosano tenha mais aplicações comerciais que a quitina. A sua elevada capacidade de ligação específica é aproveitada para tratamento de águas residuais uma vez que o polímero se liga a óleos, metais pesados, proteínas e matéria fina, que são usualmente de difícil tratamento nas unidades de tratamento de águas residuais (Hennen, 1996). Esta mesma propriedade do polímero permite a sua aplicação como resina para cromatografia de afinidade (Synowiecki et al., 2003), e na restrição da absorção de colesterol para a corrente sanguínea. Uma vez que o quitosano não é digerível pelo sistema digestivo humano, ao ligar-se ao colesterol de baixa densidade no estômago, o polissacarídeo evita a absorção desta molécula para o organismo (ICNHP, 1995; Hennen, 1996) .

[008] Na indústria alimentar, o quitosano tem como principal aplicação o revestimento de ovos e fruta (Hennen, 1996; Kim et al., 2007), atuando como barreira para o dióxido de carbono e microrganismos patogênicos, aumentando assim o tempo de vida dos alimentos. É também usado como emulsionante, conservante e clarificador de bebidas (Kim, 2004; Synowiecki et al. , 2003) . Na indústria cosmética, e dada a sua maior estabilidade e menor produção de eletricidade estática, o quitosano é usado no fabrico de produtos para o cabelo (Kim,

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2004).

[009] No entanto, é na área biomédica que este polímero tem ganho maior relevância, onde a biocompatibilidade e degradabilidade dos seus derivados permite a sua aplicação para cicatrização de feridas (Hamliyn et al., 2004; Tanabe et al., 2006; Singh et al., 2000), suporte de células (Tangsadthakun et al., 2007), sistema de transporte de fármacos (Singh et al., 2000), entre outros.

[010] As principais aplicações da quitina incluem a sua utilização como material de sutura (Hamliyn et al., 2004; Okada et al. , 2000; Singh et al., 2000), como antígeno em animais infectados por bactérias ou fungos (Singh et al. , 2000), ou como ativador da produção de quitinase em solos contaminados por organismos que contêm quitina na sua parede celular (Okada et al., 1999; Hallman et al., 1999) . É também usado no fabrico de têxteis transpiráveis, tais como meias e forros de peças de vestuário (ICNHP, 1995) .

[011] O fato de tanto a quitina como o quitosano serem biodegradáveis torna a sua utilização num benefício ecológico em comparação com polímeros sintéticos.

[012] A partir da quitina, e para além do quitosano, são também derivados outros polissacarídeos por substituição do grupo hidroxila do C6 da GlcNAct. A inserção destes novos radicais, tais como alquilas, carboxilas, tióis, entre outros, aumenta a funcionalidade do polímero abrindo caminho para novas aplicações, tais como novas fibras, géis, etc.

[013] A quitina é, logo a seguir à celulose, o segundo polímero mais abundante na natureza. Encontra-se

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5/21 principalmente na cutícula e exoesqueleto de organismos pertencentes ao filo Arthropoda e Crustacea, assim como na parede celular de leveduras e fungos. Nestes organismos, a quitina não só confere às células rigidez e resistência mecânica, como desempenha um importante papel na formação do septo primário durante a meiose (Keller et al., 1970; Momany et al., 1997) . Até ao momento não se detectou a presença de quitina ou qualquer um dos seus derivados em bactérias ou fungos pertencentes à classe Myxomycetes. A quitina presente nos crustáceos e artrópodes apresenta uma rigidez e grau de desacetilação superior ao da obtida por microrganismos.

[014] A maior parte da quitina e seus derivados presentes no mercado provêm da extração da casca de crustáceos tais como caranguejo, camarão, lagosta e lavagante. Usualmente o processo desenrola-se em três passos: desmineralização, desproteinização e remoção de lipídios e branqueamento. A primeira é obtida por mistura das cascas com um ácido (geralmente ácido clorídrico, HCl), enquanto a desproteinização e remoção de lipídios processa-se em meio básico (com hidróxido de sódio, NaOH ou hidróxido de potássio, KOH) na presença de etanol.

[015] Para remoção dos pigmentos (principalmente carotenóides) recorre-se à lavagem com solventes orgânicos, tais como acetona, clorofórmio, ou misturas de etanol e éteres.

[016] No entanto, a sazonalidade deste tipo de matéria-prima e a variação da composição das cascas em função da espécie e idade do animal, fazem com que este tipo de processo seja dispendioso e com pouca reprodutibilidade. A

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6/21 elevada rigidez dos exoesqueletos de espécies como lagosta e caranguejo tornam também a sua extração bastante difícil e dispendiosa. Por outro lado, a presença de proteínas ou poluentes absorvidos pelo marisco dificulta a purificação da quitina. Dadas as reações alérgicas que podem daqui advir, os polímeros extraídos de crustáceos não são indicados para aplicações biomédicas.

[017] Enquanto nos artrópodes e crustáceos a quitina se encontra agregada aos minerais e proteínas das cascas (principalmente sais de cálcio), nos microrganismos esta se apresenta associada a outros polissacarídeos da parede celular. As suas extremidades redutoras encontram-se ligadas às extremidades não-redutoras de p-(1,3)-glucanos (polímeros de glucose), os quais, por sua vez, se ligam a p-(1,6)-glucanos, galactomananos (polímeros de galactose e manose) e glicoproteínas. Esta composição da parede celular, para além de depender das estirpes em causa, não é estática ao longo do tempo de vida do organismo. Alterações do meio de cultivo, tais como disponibilidade de substrato (McMurrough et al., 1967), temperatura ou concentração de oxigênio (Aguilar-Uscanga et al. , 2003), podem provocar alterações nas proporções relativas de cada um dos componentes da parede celular.

[018] A produção microbiana de quitina, para além de possibilitar uma otimização contínua do processo, permite o uso de matérias-primas baratas e disponíveis todo o ano. A adaptação da constituição da parede celular às condições do meio são uma mais-valia para possíveis otimizações, tendo já sido demonstrado que também a suplementação com alguns íons e

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7/21 precursores químicos da síntese enzimática da quitina favorecem a sua produção por fermentação (Camargo et al., 1967; Keller et al., 1970). A composição e propriedades dos polímeros são também mais consistentes do que as obtidas pelo método tradicional de extração dos crustáceos.

[019] Atualmente não existe um protocolo otimizado para a produção de quitina por via microbiana, excetuando os casos em que se recorre a organismos geneticamente manipulados para esse fim (Hammer et al., 2006). A maior parte da quitina microbiana presente no mercado é extraída a partir de Saccharomyces carlsbergensis proveniente da indústria da cerveja ou de Aspergillus niger usado na produção de ácido cítrico (Versali et al., 2003) . Neste último caso, a quantidade de quitina pode ascender a 42% do seu peso seco. Contudo, não se conseguem atingir densidades celulares tão elevadas como com leveduras e os custos de operação são mais elevados devido à morfologia do fungo. Em contrapartida, a produção de quitina por espécies de Saccharomyces não parece ir além de 8% do peso seco da célula. Alguns desperdícios da cultura de cogumelos comestíveis, tais como as espécies Agaricus bisporus e A. campestris (GB2259709) podem também ser utilizados. Mas, uma vez mais, a quantidade de quitina extraída não é superior a 8% do peso seco dos cogumelos.

[020] Pichia pastoris é uma levedura da classe Hemiascomycetes/Saccharomycetes, normalmente usada para expressão heteróloga de proteínas. Comparativamente a outros microrganismos usados na produção de quitina, esta espécie apresenta como principal vantagem as elevadas densidades

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8/21 celulares obtidas durante a sua fermentação, podendo para isso ser usados uma grande variedade de substratos, tais como glucose, metanol ou glicerol com baixos níveis de pureza. Dado que este último é um subproduto de baixo custo e abundante da indústria do biodiesel, e que se sabe ser um bom substrato para o crescimento desta levedura (Çelik et al., 2008), a produção específica de quitina e quitosano por Pichia pastoris pode ser uma mais-valia para o reaproveitamento e valorização do subproduto da indústria do biodiesel. Dado que também não são necessárias concentrações muito elevadas de oxigênio no meio para que se dê o seu crescimento, os custos de operação são reduzidos.

[021] Até ao momento não se encontrou na literatura qualquer referência ao uso de Pichia pastoris para produção à escala industrial dos polímeros referidos na presente invenção.

Descrição Geral da Invenção [022] A presente invenção introduz a levedura Pichia pastoris como organismo relevante para a produção de polissacarídeos da parede celular tais como quitina, polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, ou quaisquer outros obtidos a partir destes por reações de derivatização, usando substratos de baixo custo como o subproduto da indústria de biodiesel.

[023] As estirpes de Pichia pastoris utilizadas para este fim poderão ser selvagens, variantes ou mutantes da levedura.

[024] Uma vez que a produtividade obtida destes polissacarídeos está intimamente ligada ao crescimento

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9/21 microbiano, a obtenção de elevadas taxas específicas de crescimento e de elevadas densidades celulares foram otimizadas de forma a tornar economicamente viável a produção de quitina ou quitosano por Pichia pastoris.

[025]

Assim, é descrito na presente invenção, um método para produção de polissacarídeos da parede celular contendo glucosamina, glucose, galactose ou manose, nomeadamente por fermentação aeróbia em meio de cultura líquido, usando como fonte de carbono preferencialmente o subproduto da indústria do biodiesel, rico em glicerol. São ainda referidas outras fontes de carbono passíveis de ser usadas para o mesmo fim, tais como glicerol de elevada pureza, metanol e glucose.

O uso de subproduto da indústria do biodiesel como principal fonte de carbono, rico em glicerol e de baixo custo, mas contendo várias impurezas, é uma mais-valia para redução dos custos de produção dos polímeros da presente invenção, uma vez que permite aumentar a produtividade volumétrica face a outros substratos de pureza e custo mais elevados. No entanto, estes últimos poderão ser usados caso as aplicações finais exijam substratos de composição bem definida, ou caso o processo de extração de polissacarídeos da parede celular de P. pastoris resulte da valorização da biomassa obtida noutros processos industriais (por exemplo, produção de anticorpos).

[027] De forma a serem atingidas elevadas densidades celulares e evitadas condições anaeróbias que prejudiquem a produção de quitina, a concentração de oxigênio dissolvido é

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10/21 mantida acima dos 5% da sua concentração de saturação. Este parâmetro é controlado pela adição da fonte de carbono, podendo a fermentação decorrer em modo contínuo ou semi-contínuo.

[028] Em alternativa ao modo semi-contínuo, a fermentação pode ser realizada em modo contínuo, o que permite maximizar a produtividade volumétrica do processo.

[029] A extração dos polissacarídeos produzidos durante a fermentação pode ser realizada por qualquer método descrito na literatura para extração de polímeros da parede celular de fungos ou leveduras (ver, por exemplo, Synowiecki et al., 2003). Ressalva-se que, com o processamento químico utilizado na presente invenção, para além de uma mistura de polissacarídeos rica em quitina, são paralelamente obtidas várias frações de outros polissacarídeos contendo glucose, manose e/ou galactose, com várias aplicações na indústria alimentar e biomédica.

[030] No entanto, e dado que a extração química acarreta alguns riscos de degradação dos polímeros, a extração enzimática é uma alternativa ao protocolo usado na presente invenção. Para tal recorrem-se, por exemplo, a proteases e lisozimas para a degradação, respectivamente, do material protéico e dos glucanos da parede celular. Apesar de menos poluente, este método tem a grande desvantagem dos custos associados serem bastante mais elevados que os do método químico.

Descrição das Figuras [031] Figura 1 - Evolução do peso seco da levedura

Pichia pastoris ao longo de fermentações contendo glicerol puro

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11/21 (99%) ou subproduto da indústria do biodiesel (86%) como fonte de carbono.

Descrição Detalhada da Invenção

1. Produção dos Polímeros

1.1. Cultura Microbiana [032] A presente invenção refere-se à produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, assim como os seus derivados, por fermentação de estirpes selvagens, variantes ou mutantes da levedura Pichia pastoris.

1.2. Meio de Cultura [033] A fermentação de P. pastoris decorre em meio de cultura líquido, constituído por uma fonte de carbono, uma de azoto e sais inorgânicos.

[034] A fonte de carbono é, preferencialmente, uma mistura rica em glicerol proveniente da indústria do biodiesel. No entanto, poderá ainda ser utilizado glicerol puro, metanol, glucose ou misturas destes compostos. Em alternativa, a levedura P. pastoris consegue ainda metabolizar uma série de outros compostos, incluindo uma série de alcoóis, açúcares, ácidos carboxílicos, polióis, ácidos gordos ou aminoácidos, na sua forma monomérica, oligomérica ou polimérica.

[035] Todos estes substratos poderão ser puros ou, preferencialmente, ter origem em resíduos industriais, tais como subprodutos da indústria do biodiesel ou alimentar.

[036] A fonte de azoto é, preferencialmente, amoníaco, podendo ser também utilizados sais de amônia ou compostos orgânicos azotados como, por exemplo, extrato de levedura, uréia ou peptona.

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12/21 [037] O meio de cultura inclui ainda sais contendo os íons Ca2+, K+, Mg2+, SO42-, PO43-, e quantidades vestigiais de metais, tais como cobalto, cobre, manganês e ferro.

[038] Para além da composição acima descrita, uma variedade de outros substratos podem ser utilizados para crescimento da espécie P. pastoris. Os componentes do meio não estão, por isso, confinados aos referidos nos parágrafos acima.

1.3. Condições de Fermentação [039] A presente invenção cobre qualquer procedimento ou protocolo de produção de quitina ou seus derivados por fermentação de Pichia pastoris. Serão, no entanto, referidas algumas metodologias que favorecem o crescimento da biomassa até elevadas densidades celulares e com elevada percentagem de quitina e glucanos na parede celular.

[040] A fermentação ocorre em meio líquido e arejado com ar comprimido. A temperatura poderá ser controlada entre os 10 °C e os 60 °C, sendo mantida, preferencialmente, entre 20 e 40 °C. O pH poderá estar entre 1.0 e 10.0, sendo mantido, preferencialmente, entre 3.0 e 8.0 pela adição automática de base ao longo da fermentação. Esta pode ser qualquer base inorgânica, como por exemplo NaOH, KOH ou NH3, sendo que, neste último caso, a base adicionada substitui a alimentação da fonte de azoto.

[041] O oxigênio dissolvido no caldo de fermentação decresce de acordo com o crescimento celular, sendo o seu decaimento tanto mais rápido quanto maior for a taxa específica de crescimento da estirpe usada. A limitação por oxigênio é evitada através da manipulação de variáveis, tais como

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13/21 velocidade de agitação do meio, caudal de arejamento, pressão e/ou caudal de alimentação, de acordo com as capacidades e limitações do reator utilizado.

[042] Para se obterem elevadas densidades celulares, o modo de operação poderá ser contínuo ou semi-contínuo.

[043] A alimentação do caldo de fermentação é iniciada quando a fonte de carbono no meio de cultura inicial atinge concentrações limitantes ao crescimento, sendo, preferencialmente, mantido com um caudal exponencial até que se atinja a concentração de oxigênio dissolvido definida como ponto estabelecido. A solução de alimentação é composta pela fonte de carbono e uma solução salina 2% (v/v). Caso o controlo de pH esteja a ser realizado com uma base que não amônia, o caudal de alimentação deverá incluir a fonte de azoto nas mesmas proporções carbono/azoto presentes no meio de cultura inicial (aproximadamente 3:1).

[044] Uma vez que a produção de polímeros de glucosamina se encontra associada a um metabolismo primário, a fermentação é terminada quando o crescimento entra na fase estacionária, atingindo-se uma produção que pode variar entre 10 e 40 gramas de quitina por litro de cultura, e até 10 gramas de quitosano por litro de cultura. Estes valores variam consoante a densidade celular obtida no final da fermentação, sendo que esta é geralmente superior a 150 g/l.

[045]

De forma a aumentar a percentagem de quitina na biomassa, tempo de fermentação pode ser estendido em condições de cultura que favoreçam a síntese de quitina ou quitosano separada do crescimento celular. Tais alterações

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14/21 incluem o aumento da temperatura, do pH ou força iônica durante a fase estacionária.

[046] Associado à produção dos polissacarídeos contendo quitina, o processo permite a co-produção de outros biopolímeros na parede celular contendo glucose, manose e/ou galactose, que podem representar até 45% do peso seco da biomassa.

2. Extração e Purificação dos Produtos de Fermentação [047] Encontram-se em seguida descritos os protocolos que podem ser utilizados para extrair e purificar os polissacarídeos descritos na presente invenção.

[048] A separação inicial das células do caldo de fermentação é feita por filtração ou decantação, ou ainda centrifugação, sendo este último o processo mais eficiente a separação por centrifugação;

[049] Após a separação das células do caldo de fermentação, preferencialmente por centrifugação da suspensão celular, procede-se à extração dos lipídios, proteínas e ácidos nucléicos presentes nas células, tratando as amostras com uma solução de pH suficientemente elevado (superior a 10,0). A degradação das proteínas e ácidos nucléicos é efetuada através da reação com concentrações elevadas de uma base forte (NaOH ou KOH), enquanto os lipídios são extraídos por reação com solventes orgânicos (entre os quais, etanol, metanol, acetona,..) ou detergentes.

[050] Estes passos podem ser feitos consecutivamente ou em simultâneo, o que torna o processo mais barato e aumenta o rendimento. Estes passos demoraram entre 30 minutos a 3

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15/21 horas, consoante a temperatura utilizada (65 a 90 °C).

[051] A matéria insolúvel obtida é constituída essencialmente por matéria inorgânica, quitina e seus derivados, para além de outros polissacarídeos, tais como glucanos e mananos. No sobrenadante encontram-se alguns polissacarídeos solúveis em meio alcalino, nomeadamente βglucanos e a-1,3-glucanos muito ramificados e galactomananos (polímeros de manose e galactose).

[052] Após centrifugação e lavagem com água e etanol ou outros solventes orgânicos (tais como metanol, éter dietílico ou acetona), de modo a separar a matéria insolúvel do sobrenadante, procede-se à separação da quitina dos restantes polissacarídeos contidos na matéria insolúvel.

[053] Para tal, usa-se uma hidrólise parcial com ácido acético ou outro ácido fraco, a temperaturas superiores a 75 °C, ou a temperaturas inferiores a 50 °C com um ácido clorídrico ou outro ácido inorgânico diluído. Neste passo são solubilizados alguns β-l^-glucanos ramificados, não extraídos durante a desproteinização. A matéria insolúvel contém os restantes polímeros já desprendidos entre si, enquanto a maioria dos glucanos são recuperados por extração alcalina, seguida de centrifugação para reaproveitamento do sedimento.

[054] A matéria insolúvel é suspensa numa base forte, a quente, para solubilização de glucanos alcano-solúveis. Utiliza-se NaOH, a temperaturas superiores a 20 °C e nunca superiores a 75 °C, para evitar a degradação da quitina. A extração de glucanos hidrossolúveis é feita com água a temperaturas superiores a 30 °C.

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16/21 [055] Após centrifugação realizam-se várias lavagens com água e etanol ou outro solvente orgânico. Procede-se em seguida à extração do quitosano por dissolução em ácido acético (2% (v/v)). Após nova centrifugação, separa-se o sobrenadante onde está solubilizado o quitosano, do sedimento (quitina e outros biopolímeros) . De modo a precipitar o quitosano, o pH do sobrenadante é ajustado a 6.0, sendo o polissacarídeo recolhido após nova centrifugação e lavagem do sedimento com água desionizada.

[056] O sedimento contendo a quitina é dissolvido numa solução 5% cloreto de lítio em dimetilacetamida (DMAC) ou em dimetilsulfóxido (DMSO), durante períodos superiores a 12 horas, sob agitação constante, para dissolução completa do polímero. Após centrifugação, a quitina é precipitada por adição de água destilada e, de novo, centrifugada para remoção da quitina. Este passo é repetido até que não se observe qualquer formação de precipitado aquando da adição de água. A quitina extraída é lavada abundantemente com água destilada para remoção de quaisquer vestígios de solvente. O passo final consiste numa secagem a temperaturas não superiores a 60 °C ou numa liofilização.

[057] Alternativamente, são utilizadas condições mais severas durante o tratamento com a base forte, de forma a desacetilar a quitina a quitosano. Tais condições incluem o aumento da temperatura até 128 °C, a concentração de base até 15N e o tempo de reação até 7h.

[058] Durante o processo de desproteinização, extração e purificação da quitina e quitosano das células de

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Pichia pastoris, são obtidos como subproduto polímeros contendo glucose, manose, e/ou galactose, assim como os seus derivados.

[059] Os glucanos da parede celular, solúveis em meio alcalino, contêm majoritariamente ligações β-(1,3) e β-(1,6). Estes são extraídos pela solubilização em meio alcalino e posterior recuperação, que é feita através da adição de solventes imiscíveis, por precipitação ou diálise.

[060] Em alternativa é possível fazer a separação e purificação dos polímeros produzidos durante a fermentação através de cromatografia de afinidade, adição de sulfato de amônia, ou adição de um solvente orgânico ou enzimas específicas, sendo o processo mais eficiente por adição de uma base forte e/ou um solvente orgânico.

Exemplos

Exemplo 1: Fermentação de Pichia pastoris em glicerol [061] 14,25 L de meio líquido com a composição indicada na tabela 1 foi inoculado com 750 ml de uma précultura de Pichia pastoris DSMZ 70877. A fermentação decorreu num fermentador de escala piloto (LP351, 50L, BioEngineering, Suiça) a temperatura e pH constantes (respectivamente, 30 °C e 5,0). O arejamento foi mantido a 30 L/min e a pressão a 0,10 bar durante toda a fermentação. O pH foi controlado a 5,0 através da adição de hidróxido de amônia, enquanto a agitação foi inicialmente estabelecida a 300 rpm.

[062] Após 30 h de fermentação, a concentração de oxigênio dissolvido no meio (pO2) atingiu os 50% de saturação, tendo-se por isso iniciado o controlo de pO2 por aumento da agitação até um máximo de 1000 rpm. Quando a agitação atingiu

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18/21 os 440 rpm iniciou-se a adição da solução de alimentação, composta por 990 g/L de glicerol e 24 g/L da solução mineral descrita na tabela 1. O caudal de adição foi exponencial e calculado de acordo com a taxa de crescimento da biomassa pretendida.

Tabela 1: Composição do meio de cultura.

Componente	Concentração (g/L)
CaSO4.2H2O	0, 93
K2SO4	18,20
MgSO4.7H2O	14, 90
KOH	4, 13
Glicerol (99%)	40,00
Anti-espuma	0, 40
H3PO4 (85%)	26,70 mL
Solução mineral*	4,35 mL

(*A solução mineral é composta por: 6,0 g/L CuSO4.5H2O, 0,08 g/L NaI, 3,0 g/L MnSO4.H2O, 0,2 g/L Na2MoO4.2H2O, 0,02 g/L H3BO3, 0,5 g/L CoCl2, 20,0 g/L ZnCl, 65,0 g/L FeSO4.7H2O, 0,2 g/L biotina e 5,0 mL/L H2SO4.) [063] Atingidos os 1000 rpm (por volta das 44h de fermentação), iniciou-se o controlo de pO2 por limitação de substrato. O caudal da alimentação foi continuamente ajustado de forma a restringir o crescimento da biomassa para que pO2 não descesse abaixo dos 20%.

[064] Ao fim de 70 h, verificou-se o fim da fase de crescimento da biomassa, tendo-se por isso terminado a fermentação. A biomassa foi recolhida após centrifugação a 8000 rpm durante 45 min, e em seguida foi liofilizada. Por este

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19/21 processo obtiveram-se 237 g de células por cada litro de caldo de fermentação (peso seco).

Exemplo 2: Produção de quitina e glucanos por fermentação de Pichia pastoris no subproduto da indústria do biodiesel [065] O mesmo protocolo do exemplo 1 foi utilizado para crescimento da estirpe Pichia pastoris DSMZ 70877. No entanto, em vez de glicerol puro, foi utilizada uma mistura proveniente da indústria do biodiesel, contendo 86% de glicerol. Os caudais de alimentação foram corrigidos para ter em conta a nova composição do substrato. A figura 1 mostra a evolução do peso seco ao longo do tempo para as duas condições descritas.

[066] A biomassa final obtida foi de 224 g/L (peso seco) . No entanto, a fase estacionária foi atingida cerca de 6h antes da observada em glicerol puro.

[067] Realizando uma extração semelhante à descrita por Synowiecki et al. (2003), obtiveram-se 0,352 g de polímero, o que equivale a 11,7% da massa de P. pastoris.

[068] Tendo em conta a densidade celular obtida no final da fermentação, a produtividade obtida foi de 8,99 kg/m³.dia de polímero.

[069] Utilizando um conjunto enzimático específico para análise de glucanos (K-YBG, Megazyme) determinou-se que a biomassa obtida continha 14% de glucanos e o polímero extraído 38,2% de glucose. Glucose e glucosamina foram os únicos monômeros detectados por cromatografia líquida, após hidrólise ácida. Assim, o complexo quitina/glucano extraído tinha 9% de quitina, 1% de umidade, 4% de resíduos de combustão e 6% de

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20/21 proteínas .

[070] Tendo em conta estes resultados, concluiu-se que a biomassa obtida no exemplo 2 contém 3% de quitina.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de

- complexo quitina-glucano que compreende quitina/quitosana e glucano; e

- polímeros contendo glicose, manose, e/ou galactose, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

(i) fermentação de Pichia pastoris DSMZ70877 em um meio de cultura que compreende uma fonte de nitrogênio e ainda compreende como fonte de carbono:

- um subproduto rico em glicerol gerado pela indústria do biodiesel, uma mistura contendo glicerol, um álcool, um açúcar, um ácido orgânico, um poliol, um ácido graxo ou aminoácido, em suas formas monoméricas, diméricas ou oligoméricas; ou

- um resíduo ou subproduto alimentício ou industrial contendo um ou mais de glicerol, um álcool, um açúcar, um ácido orgânico, ácido graxo ou aminoácido, em suas formas monoméricas, diméricas ou oligoméricas; e

(ii) controlar o pH durante a fermentação. 2 . Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o subproduto gerado pela indústria do biodiesel é pelo menos 86% glicerol. 3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o subproduto gerado pela indústria do biodiesel é pelo menos 99% glicerol. 4. Processo, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a temperatura durante a fermentação é controlada entre 20°C a

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40°C.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a temperatura durante a fermentação é controlada a 30°C.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH durante a fermentação é controlado através da adição de um álcali, amônia ou um sal de amônio.
7 . Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH durante a fermentação é controlado entre pH 5,0 e pH 7,0.
8. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH durante a fermentação é controlado em pH 5,0.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que os polímeros obtidos durante a fermentação compreendem polissacarídeos de glucose, manose e/ou galactose até 45% do peso seco das células.