CN109645108A - 基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制方法 - Google Patents

基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂：每升制剂中含有1～6g拮抗酵母细胞壁几丁质，余量为水。本发明还提出一种利用上述制剂进行果实病害控制方法，在果实装箱贮藏前，按照如下任意一种方式进行处理：将制剂接种于果实的伤口处，使其完全覆盖果实伤口，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中于密封状态下保存23～25h。将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内密封状态下放置23～25h。拮抗酵母细胞壁几丁质对环境和人健康无任何毒害作用，对食品安全，环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。

Description

基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制方法
技术领域
本发明涉及果实采后病害防治技术领域，尤其是一种通过拮抗酵母细胞壁几丁质诱导果实抗性的生物防腐保鲜技术。
背景技术
水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源，是人们维持身体健康，增进营养必不可少的主要食品，是世界上仅次于粮食的农产品。但是水果采后病害造成的损失巨大，根据一般保守的估计，我国水果采后损失为20％～25％左右，严重的影响了其市场供应和农民的经济收益。导致水果采后损失的因素很多，由于病原菌侵染造成的腐烂是造成水果采后损失的主要原因，其中霉菌是水果采后主要病原菌。引起水果贮藏期间腐烂的霉菌种类很多,但每种水果占优势的致病菌一般有一种。例如，苹果采后腐烂主要为扩展青霉(Penicillium expansum)引起的青霉病及由灰葡萄(Botrytiscinerea)引起的灰霉病；柑桔采后腐烂主要为意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病；草莓采后腐烂主要为匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)引起的根霉病及灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的灰霉病等。这些病原菌主要依赖果实伤口或气孔、皮孔等天然开口而侵染。而且，病原真菌对采后水果的危害不仅在于其将导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如曲霉菌产生的黄曲霉毒素，扩展青霉产生的棒曲霉素，灰葡萄孢产生的葡双醛霉素等。
梨果实含有丰富的营养成分，素有“百果之宗”的美誉，包含人体所需的维生素、有机酸、矿物质和抗氧化成分等多种营养物质，具有极高的经济、营养保健价值和鲜食、加工等多种用途。我国是梨属植物中心发源地之一，每年产量巨大。据统计，梨果实在我国栽种面积达100多万公顷，主要分布在中西部，西部以及华北地区。但由于其水分含量高，皮薄肉脆，在储藏和运输过程中易受到病原菌侵染，尤其是一些真菌的侵染，如扩展青霉(Penicillium expansum)引发的青霉病能造成大量的梨果实腐烂，严重的影响了其市场供应和农民的经济收益。这些病原菌主要依赖果实伤口或气孔、皮孔等天然开口而侵染。而且，许多病原真菌分泌产生有毒的次生代谢产物，如曲霉菌产生的黄曲霉毒素，扩展青霉产生的棒曲霉素，灰葡萄孢产生的葡双醛霉素等，将会引起严重的食品安全问题。
目前控制果实采后病害的主要方法有低温储藏和使用化学杀菌剂。低温储藏技术虽能在一定程度上延长果蔬货架期，但低温贮藏需要制冷设备，在广大的发展中国家，已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果的需要。另外，有些致病霉菌比较耐低温,在冷藏情况下仍能够在水果上生长,并造成水果腐烂。有些水果,特别是热带亚热带水果不能在低温下贮藏低温下贮藏冷害严重，只能在亚低温下贮藏，此时致病霉菌繁殖仍然比较快,水果在贮藏期的腐烂比较严重。长期以来，国内外对采后病害的控制主要依赖于化学杀菌剂。化学杀菌剂具有作用机理明确、效价高且效果稳定，并能控制采前潜伏感染等优点，所以直到现在仍然是控制采后病害的主要方法。但是，化学杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康。另一方面，长期使用单一的化学杀菌剂，病原菌可能进化形成抗药性，直接导致目前允许使用的一些杀菌剂对病害的防治效果越来越差，如thiabendazole和imazalil类杀菌剂。因此，寻找毒性低，防效高，低残留和环保的杀菌剂的替代品非常迫切。
植物在与病原菌长期共同进化的过程中，形成了一套复杂而又行之有效的防御机制，当遇到有害生物侵袭时,这种防御机制能够被诱导，进而启动一系列精细复杂的防卫反应，减轻或消除危害的发生,表现为抗性。植物抗病性不仅能够被生物因子诱导，而且能够被一些化学因子和物理因子所诱导。其中，化学激发子生产、运输、储藏方便，成本低，诱导操作简单，效果稳定，应用较为广泛。中国发明专利《一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用》申请号：201310535851.1，提供了一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用，该化合物可以明显的迅速提高植物抵抗病原菌侵染的能力。中国发明专利《一种激发水稻诱导抗虫性的方法》，申请公布号：CN 105145572A，公开了一种通过氟苯氧乙酸提高水稻对稻飞風的抗性从而减轻稻飞風对水稻的危害的方法。中国发明专利《一种用于诱导烟草产生对白粉病抗性的植物提取物》，申请号：201610544509.1，公开了一种用于诱导烟草产生对白粉病抗性的植物提取物(生姜提取物、无患子提取物、海椰子提取物、地枇杷提取物)的制备方法。
几丁质又名甲壳质、甲壳素，其分子式为(C8H13O5N)n，是由N-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖(GlcNac)通过β-1,4糖苷键连接而成的长链高分子多糖。几丁质是一种丰富的天然高分子多糖资源，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物的外壳，软体动物的器官，昆虫的外骨和内角质层，以及真菌的细胞壁等。几丁质具有良好的生物学特性，如生物相容性、生物降解能力、无毒性等，已被美国环境保护署(Environmental ProtectionAgency，EPA)和美国食品药品管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准作为生物农药和食品添加剂使用，因此几丁质的开发利用深受国内外的关注。目前，几丁质及其衍生物已应用与植物以及果蔬生物防治领域。Lu(2014)等研究表明，几丁质提高了红冬孢酵母对苹果青霉病的生防效力。Yu(2008)等也报道了几丁质作为一种激发子，具有提高拮抗酵母对梨果实青霉病的控制效力。Fu(2016)等人研究表明，来源于蟹壳的胶体几丁质能够诱导梨果实对青霉病的抗性。此外，Yu(2007)等报道了拮抗酵母C.laurentii与壳聚糖复合处理能对苹果青霉病产生协同增效的控制效应。
参考文献具体如下：
1、Lu,H.P.,Lu,L.F.,Zeng,L.Z.,Fu,D.,Xiang,H.L.,Yu,T.,&Zheng,X.D.(2014).Effect ofchitin on the antagonistic activity ofRhodosporidiumpaludigenumagainstPenicillium expansum in apple fruit.Postharvest Biology andTechnology,92,9-15.
2、Yu,T.,Wang,L.P.,Yin,Y.,Wang,Y.,&Zheng,X.D.(2008).Effect of chitinon the antagonistic activity of Cryptococcus laurentii against Penicilliumexpansumin pear fruit.International Journal ofFood Microbiology,122(1-2),44-48.
3、Fu,D.,Xiang,H.L.,Yu,C.,Zheng,X.D.,&Yu,T.(2016).Colloidal chitinreduces disease incidence of wounded pear fruit inoculated by Penicilliumexpansum.Postharvest Biology and Technology,111,1-5.
4、Yu,T.,Li,H.Y.,&Zheng,X.D.(2007).Synergistic effect of chitosan andCryptococcus laurentii on inhibition of Penicillium expansuminfections.International Journal of Food Microbiology,114(3),261-266.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种不使用化学杀菌剂的条件下，采用化学激发子抑制果实采后病害的保鲜技术。
为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂：
每升制剂中含有1～6g拮抗酵母细胞壁几丁质，余量为水。
注：本发明的制剂为悬浮液。
所述拮抗酵母细胞壁几丁质的制备方法如下：
S1、制备拮抗酵母细胞壁：将拮抗酵母细胞进行机械破碎，得拮抗酵母细胞壁；
S2、制备拮抗酵母细胞壁几丁质，包括以下步骤：
2.1、将步骤S1所得拮抗酵母细胞壁酵母细胞壁按照1g:48～52mL的比例加入浓度为6％(g/mL)的NaOH溶液，于70～80℃处理30～90min后，于0～5℃，经7500～8000g条件下离心40～50min，弃上清；重复进行上述步骤2～3次，获得沉淀物Ⅰ；
2.2、清洗步骤2.1所得沉淀物Ⅰ；按照1g:48～52mL的料液比将清洗后的沉淀物Ⅰ加入1mol/L的CH3COOH溶液中，于70～80℃的水浴中处理2～4h后，于0～5℃，经7500～8000g条件下离心40～50min，弃上清；重复进行上述步骤2～3次，获得沉淀物Ⅱ；
2.3、清洗步骤2.2所得沉淀物Ⅱ；按照1g:48～52mL的料液比向将清洗后的沉淀物Ⅱ中加入浓度为3％(g/mL)的NaOH溶液，于70～80℃下处理90～150min，离心取沉淀物Ⅲ；
按照1g:3～6mL的料液比向沉淀物Ⅲ中加入10mol/L HCl溶液，调节所得混合液pH6.8～7.0，之后进行流水透析(截留分子量3500)48±2h，减压浓缩(60℃，0.1MPa)至原来体积的1/2～1/4，冷冻干燥(真空度0.2Pa，温度-40℃，时间36h)后获得拮抗酵母细胞壁几丁质粉末。
作为本发明基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂的改进：
所述步骤S2制备拮抗酵母细胞壁几丁质，包括以下步骤：
2.1、将步骤S1所得拮抗酵母细胞壁酵母细胞壁按照1g:50mL的比例加入浓度为6％(g/mL)的NaOH溶液，于75℃处理60min后，于4℃，经7800g条件下离心45min，弃上清；重复进行上述步骤2次，获得沉淀物Ⅰ；
注：将离心、弃上清所得沉淀代替上述拮抗酵母细胞壁酵母细胞壁，按照步骤2.1重复进行2次，即，将离心、弃上清所得沉淀再次加入对应体积等浓度的NaOH溶液，按照步骤
2.1中步骤及参数进行重复操作。
2.2、用蒸馏水清洗2次步骤2.1所得沉淀物Ⅰ；按照1g:50mL的料液比将清洗后的沉淀物Ⅰ加入1mol/L的CH3COOH溶液中，于75℃的水浴中处理3h，于4℃，经7800g条件下离心45min，弃上清；重复进行上述步骤2次，获得沉淀物Ⅱ；
注：将离心、弃上清所得沉淀代替上述步骤2.1所得沉淀物Ⅰ，按照步骤2.2重复进行2次，即，将离心、弃上清所得沉淀再次加入对应体积等浓度的CH3COOH溶液，按照步骤2.2中步骤及参数进行重复操作。
2.3、用蒸馏水清洗2次步骤2.2所得沉淀物Ⅱ；按照1g:50mL的料液比向清洗后的沉淀物Ⅱ中加入浓度为3％(g/mL)的NaOH溶液，于75℃下处理120min，离心取沉淀物Ⅲ；
按照1g:5mL的料液比向沉淀物Ⅲ中加入10mol/LHCl溶液，调节所得混合液pH 6.8～7.0，之后进行流水透析(截留分子量3500)48h，减压浓缩(60℃，0.1MPa)至原来体积的1/3，冷冻干燥(真空度0.2Pa，温度-40℃，时间36h)后获得拮抗酵母细胞壁几丁质粉末。
注：上述调节混合液pH的方法为：采用NaOH溶液中和pH至6.8～7.0；
作为本发明基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂的进一步改进：
所述拮抗酵母为红冬孢酵母或酿酒酵母。
注：该红冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum&Fell Tallman)购置于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心(International MycologicalInstitute，CABI Genetic Resource Collection)，保藏编号：IMI394084，该菌株已经在申请号为200610155209.0的专利中被公开。
酿酒酵母保藏号为CGMCC No.2.3854，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
为了解决上述技术问题，本发明利用上述制剂，提出一种基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制方法：
在果实装箱贮藏前，按照如下任意一种方式进行处理：
一、将制剂接种于果实的伤口处，使其完全覆盖果实伤口，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中于密封状态下保存23～25h。
注：一般病原菌侵染果实是从果实伤口的边缘处开始，故上述接种的原则是制剂可完全覆盖果实伤口处，即，当果实伤口直径为5mm，深度2mm时接种量为30μL。当果实伤口直径为3mm，深度2mm时接种量为20μL。
上述将该果实于密封保存状态下就是对其进行诱导抗性响应，本发明具体实施方式中于25℃，相对湿度90％下诱导24h，是为了说明本发明在24h时具有最佳的诱导时间。
二、将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内密封状态下放置23～25h。
将上述处理后的果实取出后装箱。
作为本发明基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制方法的改进：
所述方式一中，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中利用保鲜膜密封后，于室温(15～35℃)下保存24h。
注：红冬孢酵母细胞壁和酿酒酵母细胞壁的制备方法相同，且均为现有技术，以红冬孢酵母细胞为例，本发明例如可按以下步骤配置获得：
1)、活化：
①、固体活化：红冬孢酵母在NYDA活化培养基中25℃培养48h，然后在相同条件下重复传代培养2次；
其中NYDA培养基为：牛肉浸膏8g、酵母浸粉5g、葡萄糖10g，琼脂20g，加水定容至1000mL，高压(0.1MPa，121℃，20min)灭菌。
②、液体培养菌种活化：将上述重复传代培养2次所得的红冬孢酵母用接种环接入一环到NYDB种子培养基中，于200rpm、28℃的条件下培养24h；然后在上述相同条件下重复培养1次，获得活化后的红冬孢酵母。
其中NYDB培养基为：牛肉浸膏8g、酵母浸粉5g、葡萄糖10g，加水定容至1000mL，高压(0.1MPa，121℃，20min)灭菌。
③、液体培养(扩大培养)：将上述培养所得的活化后的红冬孢酵母以体积计1/5的接种量接到NYDB种子培养基中，于200rpm、28℃的条件下培养24h，获得培养液。
2)离心分离：
将步骤1)液体培养后的所得物(培养液)在3000g(离心力)离心10min，将所得物用灭菌蒸馏水洗三次以去除培养介质，获得红冬孢酵母细胞。
3)、酵母细胞悬浮和确定浓度：用0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)悬浮红冬孢酵母细胞，用血球计数板确定酵母细胞的浓度，并用磷酸缓冲液调整到1×108cell/mL的浓度。
4)、红冬孢酵母细胞壁制备：对步骤3)所得红冬孢酵母细胞进行机械破碎制备红冬孢酵母细胞壁，具体步骤如下：
红冬孢酵母细胞悬浮液中加入酸洗玻璃珠(Sigma公司，粒径425-600μm)，于自动样品研磨机上(频率为70Hz)研磨破碎细胞，离心(4000rpm离心10min)收集沉淀，无菌水洗涤，冷冻干燥后获得红冬孢酵母细胞壁。
本发明与现有技术相比，具有如下技术优势：
(1)、诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性；
(2)、本发明中的红冬孢酵母是从海洋分离得到的天然、安全酵母菌株，存在于大自然中，来源广泛，易于获取，且该菌株遗传稳定，抑菌谱广，不产生抗生素，无化学污染，安全性高；
(3)、本发明所用的红冬孢酵母细胞壁几丁质具有成本低、安全无毒、效果好等优点，对于环境及人体健康没有任何危害作用。
(4)本发明中的酿酒酵母细胞壁几丁质成本低廉，容易生产、运输，而且防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，其可以广泛用于柑橘、梨、苹果、水蜜桃等多种水果种类与品种，可以减少果实的腐烂，延长水果保鲜期，减少资源浪费和经济损失；
(5)、红冬孢酵母细胞壁几丁质和酿酒酵母细胞壁几丁质对环境和人健康无任何毒害作用，大幅度降低化学杀菌剂的使用，有利于转变长期依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对食品安全，环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为实验1中不同浓度红冬孢酵母细胞壁几丁质对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响；结果为接入病原菌后第4天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
图2为对比实验1-1中不同浓度虾壳几丁质对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响；结果为接入病原菌后第4天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
图3为对比实验1-2中不同浓度毕赤酵母细胞壁几丁质对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响；结果为接入病原菌后第4天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
图4为实验2-1中酿酒酵母细胞壁几丁质不同诱导浓度对番茄果实灰霉病抗性的影响；结果为接入病原菌后第4天检测而得。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
图5为实验2-2中酿酒酵母细胞壁几丁质不同诱导时间对番茄果实灰霉病抗性的影响。结果为接入病原菌后第4天检测而得。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
图6为对比实验2-1中酿酒酵母几丁质提取物不同诱导浓度对番茄果实灰霉病抗性的影响。结果为接入病原菌后第4天检测而得。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
图7为对比实验2-2中酿酒酵母细胞壁不同诱导浓度对番茄果实灰霉病抗性的影响。结果为接入病原菌后第4天检测而得。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂(下文中简称为制剂)，制备方法如下：
1)、红冬孢酵母细胞制备(此为现有技术)：
保藏号为IMI394084的红冬孢酵母在低温(4℃)下保存在NYDA培养基中(牛肉浸膏8g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，0.1MPa下121℃灭菌20min)，活化时取出；
将该红冬孢酵母在NYDA培养基中培养48h(25℃)，然后在相同条件下重复传代培养2次后，用接种环将活化好的红冬孢酵母接种一环到NYDB种子培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24h；然后在上述相同条件下重复培养1次，完成对红冬孢酵母的活化；
将上述活化后的红冬孢酵母以体积计1/5的接种量接到NYDB种子培养基中，于200rpm、28℃的条件下培养24h，获得培养液。
将所得培养液于3000g(离心力)离心10min收集红冬孢酵母菌体，并用无菌蒸馏水清洗三次红冬孢酵母菌体以除去残留的培养介质，获得红冬孢酵母细胞。
2)、制备红冬孢酵母细胞壁：
对步骤1)所得红冬孢酵母细胞进行机械破碎制备红冬孢酵母细胞壁，具体步骤如下：
红冬孢酵母重悬于0.2mol/L的磷酸缓冲液中(PBS，pH 8.0)配制成1×108cell/mL的菌悬液。向0.5mL的菌悬液中加入0.5g酸洗玻璃珠(Sigma公司，粒径425-600μm)，于自动样品研磨机上研磨(频率为70Hz)破碎细胞，3min/循环，处理5个循环，破碎后在冷冻离心机(4℃)中4000rpm离心10min，收集沉淀，用无菌水洗涤8次，并于121℃灭菌20min，冷冻干燥(真空度0.2Pa，温度-40℃，时间为36h)后即得红冬孢酵母细胞壁。
3)、制备红冬孢酵母细胞壁几丁质：
3.1、将步骤2)所得红冬孢酵母细胞壁按照1g:50mL的比例加入浓度为6％(g/mL)的NaOH溶液，于75℃处理60min后，于4℃，经7800g条件下离心45min，弃上清；重复进行上述步骤2次，获得沉淀物Ⅰ。
注：重复进行上述步骤2次指：将弃上清获取的沉淀代替上述红冬孢酵母细胞壁重复进行两次操作，即，向沉淀中加入对应体积相同浓度的NaOH溶液，按照步骤3.1的步骤及参数进行重复操作。
3.2、用蒸馏水清洗2次步骤3.1所得沉淀物Ⅰ；按照1g:50mL的料液比将清洗后的沉淀物Ⅰ加入1mol/L的CH3COOH溶液中，于75℃的水浴中处理3h后，于4℃，经7800g条件下离心45min，弃上清；重复进行上述步骤2次，获得沉淀物Ⅱ；
注：重复进行上述步骤2次指：将弃上清所得沉淀代替上述步骤2.1所得沉淀物Ⅰ重复进行2次操作，即，将弃上清所得沉淀再次加入对应体积等浓度的CH3COOH溶液，按照步骤2.2中步骤及参数进行重复操作。
3.3、用蒸馏水清洗2次步骤2.2所得沉淀物Ⅱ；按照1g:50mL的料液比向步骤2.2所得物中加入浓度为3％(g/mL)的NaOH溶液，于75℃下处理120min，离心取沉淀物Ⅲ；
按照1g:5mL的料液比向沉淀物Ⅲ中加入10mol/LHCl溶液，采用NaOH溶液调节所得混合液的pH 6.8～7.0，之后进行流水透析(截留分子量3500)48h，减压浓缩(60℃，0.1MPa)原来体积的1/3，冷冻干燥(真空度0.2Pa，温度-40℃，时间36h)后获得红冬孢酵母细胞壁几丁质粉末。
4)、利用步骤3.3所得几丁质粉末与水配制获得制剂，即配置对应浓度的几丁质的菌悬液作为制剂。
注：本实施例中水均为无菌蒸馏水。
本实施例中取2g几丁质粉末，加无菌蒸馏水进行稀释至1L，配制成浓度为0.2％的几丁质悬浮液。
实验1、红冬孢酵母细胞壁几丁质不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响：
1、实验材料：
果实为梨，品种为皇冠梨。
病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，25℃活化7天备用。
2、处理：
(1)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。
(2)用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小(5mm)和尽可能相同的深度(2mm)的伤口6个。每个伤口处分别加入等量(30μL)水(对照)，以及浓度为0.01％、0.10％、0.20％、0.50％、1.00％的红冬孢酵母细胞壁几丁质悬浮液，在室温放置2h，使水分蒸发后，于25℃恒温、恒湿(相对湿度90％)条件下诱导24h。
本实验中以水作为对照组的制剂，分别以0.01％、0.1％、0.2％、0.5％、1％浓度的红冬孢酵母细胞壁几丁质悬浮液作为各浓度处理组的制剂。
上述0.2％浓度的几丁质悬浮液为实施例1制备所得的几丁质悬浮液，即，表示每升几丁质悬浮液中含有2g几丁质，余量为水。其余处理组依次类推。
(3)在伤口处接入1×104spores/mL扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μL，处理完毕后在常温下(25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度红冬孢酵母细胞壁几丁质的效力进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果实为一组重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。
红冬孢酵母细胞壁几丁质不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响如图1所示。
3、结果：
如图1所示，与对照组相比，红冬孢酵母细胞壁几丁质显著地诱导了梨果实对青霉病的抗性；红冬孢酵母细胞壁几丁质的浓度为0.1％时，发病率为48.14％，与对照组相比，发病率降低了48.14％，病斑直径降低了7.96mm；红冬孢酵母细胞壁几丁质的浓度为0.1％时，发病率为44.44％，与对照组相比，发病率降低了51.85％，病斑直径降低了8.18mm。
随着红冬孢酵母细胞壁几丁质浓度的增加，其发病率成上升趋势。因此，本发明0.1～0.2％的红冬孢酵母细胞壁几丁质是诱导梨果实抗性的最适处理浓度。
对比实验1-1、将实验1中的红冬孢酵母细胞壁几丁质改为虾壳几丁质(购置于上海阿拉丁科技股份有限公司，CAS号1398-61-4)，按照实验1的步骤进行检测。
结果如图2所示。
图2显示，在虾壳几丁质浓度0～0.1％时，梨果实的发病率没有得到抑制。当浓度增加至0.5％时，虾壳几丁质显著性地降低了果实的发病率和病斑直径。虾壳几丁质浓度1.0％时，与对照组相比，发病率和病斑直径分别降低44.45％和8.11mm。
注：来源于虾、蟹、龟等甲壳类动物外壳的几丁质中含有原肌球蛋白、肌球蛋白等易引起人过敏反应，而来源于酵母细胞壁的几丁质不含有这些蛋白。
由此以上实验可以说明，梨果实对红冬孢酵母细胞壁几丁质更敏感，其生物防治效果优于虾壳几丁质。
对比实验1-2、将实验1中的红冬孢酵母细胞壁几丁质改为毕赤酵母细胞壁几丁质，提取方法如同实施例1，按照实验1的步骤进行检测。
结果如图3所示。
图3显示，在毕赤酵母几丁质浓度0～0.1％时，梨果实的发病率没有得到抑制。当浓度增加至0.5％时，虾壳几丁质显著性地降低了果实的发病率和病斑直径。虾壳几丁质浓度1.0％时，发病率和病斑直径分别降低33.33％和7.64mm。
综上所述，来源于虾壳的几丁质和毕赤酵母细胞壁几丁质，其对梨果实青霉病的防治效果均不如红冬孢酵母细胞壁几丁质。
实施例2、将实施例1中“红冬孢酵母”更改为“酿酒酵母”，且每升制剂中酿酒酵母细胞壁几丁质粉末含量为5g，其余等同于实施例1。
酿酒酵母保藏号为CGMCC No.2.3854，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实验2-1酿酒酵母细胞壁几丁质不同诱导浓度对番茄果实灰霉病抗性的影响：
1、实验材料：
果实为番茄，品种为千喜。
病原菌：灰霉(Botrytis cinerea)，25℃活化7天备用。
2、处理：
(1)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2min，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。
(3)番茄果实分别在浓度为0.1％、0.5％、1％的酿酒酵母细胞壁几丁质溶液中浸泡15min自然晾干，并设置无菌水(即，浓度为0)作为对照，在25℃恒温、恒湿(相对湿度为90％)条件下诱导24h后，用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。在伤口处接入1×103spores/mLBotrytis cinerea孢子悬液20μL，处理完毕后在常温下(25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度酿酒酵母细胞壁几丁质的效力进行比较，结果以平均发病率(％)表示。选取20个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。
上述处理所对应的酿酒酵母细胞壁几丁质不同诱导浓度对番茄果实灰霉病抗性的影响如图4所示。
3、结果：
如图4所示，各浓度处理组与对照组相比果实灰霉病的发病率均有所降低，其中以酿酒酵母细胞壁几丁质浓度为0.5％和1％的处理组效果最为明显。酿酒酵母细胞壁几丁质0.5％相比对照处理，发病率降低了22.7％，与1％无明显差异。
实验2-2、酿酒酵母细胞壁几丁质不同诱导时间对番茄果实灰霉病抗性的影响：
1、实验材料：
果实为番茄，品种为千喜。
病原菌：灰霉(Botrytis cinerea)，25℃活化7天备用。
2、处理：
(1)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2min，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。
(2)番茄果实在浓度为0.5％的酿酒酵母细胞壁几丁质溶液中浸泡15min后自然晾干，在25℃恒温、恒湿条件下诱导0、12、24、36h，并设置无菌水(即，浓度为0)作为对照。诱导结束后，用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。在伤口处接入1×103spores/mL Botrytis cinerea孢子悬液20μL，处理完毕后在常温下(25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度酿酒酵母细胞壁几丁质的效力进行比较，结果以平均发病率(％)表示。选取20个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。酿酒酵母细胞壁几丁质不同诱导时间对番茄果实灰霉病抗性的影响如图5所示。
3、结果：
如图5所示，浓度为0.5％的酿酒酵母细胞壁几丁质诱导抗性随诱导时间的增加而增加。当诱导12h，由于作用时间较短，没有明显的抑制效果，但从12h开始发病率显著下降。诱导24、36h，发病率仅为60.0％和58.3％，与对照处理比较，分别下降了12.8％和14.5％，由于诱导24h与36h之间差异不大。因此说明，选取24h作为诱导果实抗性最佳时间在本发明中是最为合理的。
对比实验2-1：将实验2-1中“酿酒酵母细胞壁几丁质”更改为“酿酒酵母细胞几丁质”，其他如同实验2-1进行检测。
注：将实施例2中“将酵母细胞壁按照1:50(g/mL)的比例加入6％的NaOH溶液”更改为“酿酒酵母细胞溶于1mol/L的NaOH(W∶V＝1g∶2ml)”，其余等同于实施例2，制备获得酿酒酵母细胞几丁质。
结果如图6所示。
图6显示，从酿酒细胞中提取的几丁质提取物在较低或高浓度时均不能抑制番茄果实的灰霉病，当几丁质提取物浓度为0.5％时，发病率显著性降低，与对照组相比，降低15.55％。
对比实验2-2：将实验2-1中酿酒酵母细胞壁几丁质溶液更改为申请公开号CN106070576A的《通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法以及所用的制剂》中所提供的制剂，即，将实验1中的“酿酒酵母细胞壁几丁质溶液”改为“酿酒酵母细胞壁溶液”，其他如同实验2-1进行检测。
结果如图7所示。
图7显示，当酿酒细胞壁浓度为0～0.5％范围内时，对番茄果实的灰霉病腐烂没有抑制作用，当浓度增加至1.0％时，灰霉病得到一定程度的降低，与对照组相比，发病率降低11.11％。由此说明，酿酒酵母细胞壁仅能使番茄果实的青霉病腐烂轻微降低，其效果不及酿酒酵母细胞壁几丁质。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂，其特征在于：
每升制剂中含有1～6g拮抗酵母细胞壁几丁质，余量为水；
所述拮抗酵母细胞壁几丁质的制备方法如下：
S1、制备拮抗酵母细胞壁：将拮抗酵母细胞进行机械破碎，得拮抗酵母细胞壁；
S2、制备拮抗酵母细胞壁几丁质，包括以下步骤：
2.1、将步骤S1所得拮抗酵母细胞壁按照1g:48～52mL的比例加入浓度为6％的NaOH溶液，于70～80℃处理30～90min，于0～5℃，经7500～8000g条件下离心40～50min后，弃上清；重复进行上述步骤2～3次，获得沉淀物Ⅰ；
2.2、清洗步骤2.1所得沉淀物Ⅰ；按照1g:48～52mL的料液比将清洗后的沉淀物Ⅰ加入1mol/L的CH3COOH溶液中，于70～80℃的水浴中处理2～4h后，于0～5℃，经7500～8000g条件下离心40～50min，弃上清；重复进行上述步骤2～3次，获得沉淀物Ⅱ；
2.3、清洗步骤2.2所得沉淀物Ⅱ；按照1g:48～52mL的料液比向将清洗后的沉淀物Ⅱ中加入浓度为3％的NaOH溶液，于70～80℃下处理90～150min，离心取沉淀物Ⅲ；
按照1g:3～6mL的料液比向沉淀物Ⅲ中加入10mol/L HCl溶液，调节所得混合液pH6.8～7.0，之后进行流水透析48±2h，减压浓缩至原来体积的1/2～1/4，冷冻干燥后获得拮抗酵母细胞壁几丁质粉末。
2.根据权利要求1所述的基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂，其特征在于：
所述步骤S2制备拮抗酵母细胞壁几丁质，包括以下步骤：
2.1、将步骤S1所得拮抗酵母细胞壁按照1g:50mL的比例加入浓度为6％的NaOH溶液，于75℃处理60min后，于4℃，经7800g条件下离心45min，弃上清；重复进行上述步骤2次，获得沉淀物Ⅰ；
2.2、用蒸馏水清洗2次步骤2.1所得沉淀物Ⅰ；按照1g:50mL的料液比将清洗后的沉淀物Ⅰ中加入1mol/L的CH3COOH溶液中，于75℃的水浴中处理3h，于4℃，经7800g条件下离心45min，弃上清；重复进行上述步骤2次，获得沉淀物Ⅱ；
2.3、用蒸馏水清洗2次步骤2.2所得沉淀物Ⅱ；按照1g:50mL的料液比向清洗后的沉淀物Ⅱ中加入浓度为3％的NaOH溶液，于75℃下处理120min，离心取沉淀物Ⅲ；
按照1g:5mL的料液比向沉淀物Ⅲ中加入10mol/LHCl溶液，调节所得混合液pH 6.8～7.0，之后进行流水透析48h，减压浓缩至原来体积的1/3，冷冻干燥后获得拮抗酵母细胞壁几丁质粉末。
3.根据权利要求1或2所述的基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂，其特征在于：
所述拮抗酵母为红冬孢酵母或酿酒酵母。
4.根据权利要求3所述的基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂，其特征在于：
每升制剂中含有2g红冬孢酵母细胞壁几丁质，余量为水。
5.根据权利要求3所述的基于拮抗酵母细胞壁几丁质诱抗活性的果实病害控制制剂，其特征在于：
每升制剂中含有5g酿酒酵母细胞壁几丁质，余量为水。
6.利用如权利要求1～5任一所述的制剂进行果实病害控制方法，其特征在于：
在果实装箱贮藏前，按照如下任意一种方式进行处理：
一、将制剂接种于果实的伤口处，使其完全覆盖果实伤口，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中于密封状态下保存23～25h；
二、将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内密封状态下放置23～25h；
将上述处理后的果实取出后装箱。
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