CN113729075A - 一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法 - Google Patents
一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法；步骤为：将酵母活化培养后，得到培养液，离心得到菌体，用无菌水稀释为酵母菌悬液；在樱桃番茄表面打孔后注入菌悬液，2h后注入等体积的链格孢菌孢子悬浮液，实现对链格孢的有效控制；或者直接将未经消毒的樱桃番茄浸入酵母菌悬液1‑3min，自然晾干，即可实现对樱桃番茄采后病害的防治和贮藏保鲜；本发明可以有效控制樱桃番茄采后由链格孢菌引起的病害和自然腐烂，同时对樱桃番茄采后主要品质指标无显著不良影响，且能缓解樱桃番茄果实品质的下降；操作方便且安全环保，具有显著的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于果蔬采后病害生物防治领域，具体涉及一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法。
背景技术
樱桃番茄，学名Lycopersivon esculentum Mill，又名袖珍番茄、迷你番茄，小西红柿等，茄科番茄属，属于果蔬兼用型蔬菜。樱桃番茄不仅色泽鲜艳、形态优美，而且味道酸甜可口，营养丰富。它富含维生素A、C和PP、微量元素、谷胱甘肽和番茄红素等，被联合国粮农组织列为优先推广的“四大水果”之一。樱桃番茄还具有防癌抗癌、抗氧化、降胆固醇、预防高血压等特殊功效，是具有多种功能的广受消费者青睐的水果之一。
樱桃番茄是典型的呼吸跃变型果实，在呼吸高峰之后其果实更容易变软、衰老、腐烂。在樱桃番茄采后病害中，由链格孢(Alternaria alternata)引起的黑斑病是樱桃番茄常见且发病率较高的真菌性病害之一，其发病速度快，传播范围广，造成严重的经济损失。因此，采取合适、有效的方法控制樱桃番茄采后病害是十分必要且亟待解决的。
果蔬采后病害的传统控制方法主要包括物理方法和化学方法。物理方法包括热处理、冷藏、气调贮藏、电离辐射、紫外辐射等。物理方法具有无药物和化学试剂残留，不污染环境，对人无害等优点。但往往存在着对设备及成本的要求较高、控制效果有局限性、易导致果蔬感官品质下降等问题。
通过化学药物控制果蔬采后病害、延缓果实衰老进程一直是研究和实际应用的热点。化学杀菌剂因其高效、成本较低、使用方便等优点，是目前使用最为广泛、且最为常见的一种防治方法。然而，这些化学杀菌剂易残留在果蔬上，对消费者健康造成危害，且容易对环境造成破坏以及引起病原菌抗病性。因此，寻找安全有效的方式对果蔬采后病害进行防治成为亟待解决的难题。
生物防治是指利用病原菌的拮抗微生物来防治植物的病害。相对于物理和化学控制，生物控制法较为绿色环保，具有安全无毒、对环境无污染、不引起病原菌产生抗药性等优点。目前发现的拮抗微生物包括拮抗细菌、拮抗霉菌和拮抗酵母菌等。其中酵母菌具有繁殖速度快、抗逆性强、安全系数高和遗传稳定等优点，具有广阔的应用前景。相关文献报道，王笑笑等人筛选到一株膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)，对番茄由灰葡萄孢菌引起的灰霉病有良好的控制效果。Zhang等人发现异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)能够有效控制梨果采后青霉病，使其发病率从99％降至17.6％。吴锋等人研究发现膜醭毕赤酵母(P.membranaefaciens)能够有效控制桃果采后软腐病，使桃果的自然腐烂率降低了19.44％。然而，目前利用拮抗酵母对樱桃番茄采后病害进行控制的报道较少，尤其是对其采后黑斑病的控制，控制效果也有待提高。因此，筛选能够对樱桃番茄黑斑病和自然腐烂具有良好控制效果的拮抗酵母，延长果实的贮藏期和货架期具有重要的实际应用价值。
发明内容
针对现有技术的缺陷与不足，本发明提供一株拮抗酵母——卡利比克毕赤酵母(P.caribbica)，该酵母能够有效控制樱桃番茄采后黑斑病和自然腐烂的发生，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所提供的防治樱桃番茄采后病害的卡利比克毕赤酵母系本实验室分离、纯化，已经获批中国发明专利(专利号：ZL201010198119.6：专利名称为：卡利比克毕赤酵母、在水果贮藏保鲜中的应用及使用方法)。目前保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株保藏编号为CGMCC No.3616。
本发明的卡利比克毕赤酵母用于控制樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，具体步骤为：
(1)首先将卡利比克毕赤酵母接种在NYDB培养基中进行第一次活化培养，得到活化液；然后，吸取活化液转接入新的NYDB培养基中，进行第二次活化，得到酵母培养液经离心后得到菌泥，用无菌生理盐水洗涤后，配制成卡利比克毕赤酵母菌悬液，浓度为1×107～1×109cells/mL，待用；
(2)选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小均匀的樱桃番茄，进行消毒处理，然后用流动清水冲洗，清洗后的樱桃番茄放入已消毒的塑料筐中晾干；在晾干后的樱桃番茄赤道部位形成统一大小和深度的伤口，每个伤口处等量加入步骤(1)制备的卡利比克毕赤酵母菌悬液，静置一段时间后接种链格孢孢子悬浮液，自然晾干后用保鲜膜将其密封，并放置于恒温恒湿培养箱中培养，验证了卡利比克毕赤酵母对樱桃番茄采后黑斑病具有良好的控制效果；
或者选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小相近的樱桃番茄，不经任何消毒处理，保持樱桃番茄的自然状况，直接将樱桃番茄浸泡于步骤(1)中的卡利比克毕赤酵母菌悬液中，浸泡一段时间后取出，置于消毒后的塑料筐中，待樱桃番茄自然晾干后用保鲜膜密封塑料筐，置于恒温恒湿培养箱中贮藏，即可实现樱桃番茄采后病害防治及贮藏保鲜的用途。
优选的，所述步骤(1)中第一次活化培养和第二次活化培养的培养条件均为：28℃培养20～24h；所述离心的条件为：4℃，8000rpm，时间10～15min。
优选的，所述步骤(1)中吸取活化液转接入新的NYDB培养基中，具体是以体积比为1-2％的接种量进行转接。
优选的，所述步骤(2)中消毒处理的操作为：将樱桃番茄浸入含有0.3％次氯酸钠溶液的自来水中消毒1～3min。
优选的，所述步骤(2)中打孔的孔径为3mm，深度3mm；所述静置一段时间为2h。
优选的，所述步骤(2)中每个伤口处加入的酵母菌悬浮液与链格孢孢子悬浮液的体积比为1:1；所述链格孢孢子悬浮液的浓度为1×105spores/mL。
优选的，所述步骤(2)中恒温恒湿培养箱中培养的温度为20℃，湿度为90％。
优选的，所述的NYDB培养基(以1L计)为：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。
优选的，步骤(2)中所述塑料筐消毒为清洗干净晾干后，再用体积分数为75％的酒精喷洒消毒。
与现有的技术相比，本发明的优点如下：
(1)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母为从土壤里上分离、筛选到的酵母菌，急性毒性试验验证其为实际无毒类酵母，对人体健康无危害。
(2)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母可以有效控制樱桃番茄采后黑斑病和自然腐烂，从而降低樱桃番茄采后病害所造成的损失；本发明选择1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母用于防治樱桃番茄采后黑斑病，该浓度酵母处理的樱桃番茄黑斑病腐烂率仅为18.10％，腐烂直径为7.36mm，腐烂率、腐烂直径分别比对照组降低了79.19％，35.89％；该浓度酵母处理的樱桃番茄自然腐烂率仅为29.76％，比对照组降低了50.95％。
(3)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母对采后樱桃番茄主要品质指标：可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物和维生素C含量无显著不良影响，且能够缓减樱桃番茄在贮藏过程中的品质劣变。
(4)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母目前尚未有在樱桃番茄采后病害防治中应用的报道，具有独创性；使用卡利比克毕赤酵母(P.caribbica)，能够代替化学杀菌剂防治樱桃番茄采后病害，且能够缓减樱桃番茄在贮藏过程中的品质劣变，减少化学杀菌剂的使用，对环境友好，且对食用者健康无危害，亦可减少通过物理方法贮藏保鲜时所产生的经济和能源负担，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为不同浓度卡利比克毕赤酵母对樱桃番茄黑斑病的控制作用；图A为腐烂率，图B为腐烂直径；其中：CK为对照组，以无菌生理盐水处理的樱桃番茄；106、107、108和109分别表示以浓度为1.0×106、1.0×107、1.0×108和1.0×109cells/mL的拮抗酵母处理的樱桃番茄；所使用病原菌孢子浓度均为1.0×105spores/mL；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
图2为卡利比克毕赤酵母对樱桃番茄自然腐烂的控制作用；注：CK为对照组，无菌生理盐水处理的樱桃番茄；Y为1.0×108cells/mL卡利比克毕赤酵母菌悬液处理的樱桃番茄；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
通过借助以下实施实例更加详细的诠释本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
卡利比克毕赤酵母培养程序为：(1)第一次活化：挑取2环卡利比克毕赤酵母菌株接种于50mL的NYDB培养基中，在28℃，180rpm条件下培养24h，进行第一次活化，得到活化液；(2)液体二次活化：用灭菌枪头吸入1mL活化液于另一瓶50mL的NYDB培养基中，在28℃，180rpm条件下培养24h，得到酵母培养液；(3)离心分离再悬浮：将上述(2)中酵母培养液在4℃，8000rpm条件下，离心10min，并用无菌生理盐水洗涤2次，以去除培养基质，得到菌泥，最后用无菌生理盐水重新再悬浮，最终调节至所需的酵母浓度。
本发明所用到的病原菌—链格孢(Alternaria alternata)是从感病樱桃番茄上分离筛选。将霉菌接种到PDA培养基上在25℃避光培养7天，刮取菌丝于无菌生理盐水中，再经过灭菌纱布过滤得到霉菌孢子悬浮液，调至最终浓度为1×105spores/mL。
实施例1：
卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后黑斑病的控制
一、试验方案
选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小相等的樱桃番茄，用清水将其表面杂质冲洗干净，再用0.2％的次氯酸钠浸泡3分钟。捞出后用流动清水冲洗樱桃番茄表面以便去除残留的次氯酸钠。洗净的樱桃番茄放入已消毒的塑料筐中晾干。将晾干后的樱桃番茄用无菌打孔器在果实赤道处制造出3mm×3mm(直径×深度)的伤口，分别注入10μL浓度为1×106、1×107、1×108和1×109cells/mL的卡利比克毕赤酵母菌悬液；静置2h后，在樱桃番茄伤口处再接种10μL浓度为1×105spores/mL的链格孢菌孢子悬浮液。以无菌生理盐水代替酵母悬浮液处理的樱桃番茄作为对照组。处理的樱桃番茄自然晾干后，用保鲜膜密封，置于20℃恒温恒湿培养箱(相对湿度90％)中贮藏5d后统计樱桃番茄的腐烂率和腐烂直径。每个处理重复三次，每次重复15个果实。整个试验重复2次。
腐烂率＝腐烂的果实数/总的果实数×100％
二、试验结果
由图1可知，在整个贮藏期间，1×107、1×108和1×109cells/mL酵母菌悬液处理的樱桃番茄腐烂率(A)分别为(57.88％，18.10％，9.23％)，均显著低于对照组(86.97％)(p<0.05)。其中，1×108和1×109cells/mL两个浓度的酵母处理的樱桃番茄腐烂率显著低于其它浓度，但二者之间没有显著性差异。从图1(B)可以看出，所有不同浓度酵母菌悬液处理的樱桃番茄的腐烂直径均显著低于对照组(11.48mm)(p<0.05)。其中，浓度为1×109cells/mL的酵母处理的樱桃番茄腐烂直径最小(6.42mm)，但与1×108cells/mL的酵母处理的樱桃番茄腐烂直径(7.36mm)差异不显著。综合考虑控制效力和生产成本，选择1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母用于防治樱桃番茄采后黑斑病，该浓度酵母处理的樱桃番茄黑斑病腐烂率仅为18.10％，腐烂直径为7.36mm，分别比对照组降低了79.19％，35.89％。说明本申请专利中卡利比克毕赤酵母用于防治樱桃番茄采后黑斑病具有非常显著的效果。
实施例2：
卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄贮藏保鲜的用途
一、实验方案
选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小相近的樱桃番茄，不经任何消毒处理，保持樱桃番茄的自然状况，直接将樱桃番茄浸泡于1.0×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母菌悬液中。樱桃番茄浸泡3分钟后捞出，置于消毒后的塑料筐中，待樱桃番茄自然晾干后用保鲜膜密封塑料筐，置于20℃恒温恒湿培养箱(相对湿度90％)中贮藏30d后，统计樱桃番茄发病率，取样测定樱桃番茄可溶性糖、可滴定酸、维生素C和可溶性固形物的含量。以浸泡无菌生理盐水的樱桃番茄做空白对照。每个处理重复三次，每次重复15个果实。整个试验重复2次。
腐烂率＝腐烂的果实数/总的果实数×100％
品质指标具体测定方法如下：
1、可溶性糖：采用蒽酮试剂法进行测定。称取约0.5g样品，加16mL蒸馏水研磨成匀浆。转移至刻度试管中。加塞煮沸30min。冷水冲洗进行降温。转移至50mL离心管中。在4℃，8000rpm的条件下离心5min。取其上清，并定容至100mL。吸取合适浓度样液0.5mL，加入1.5mL蒸馏水，0.5mL蒽酮-乙酸乙酯，充分震荡后加入5mL浓硫酸。充分震荡后，逐个精确沸水浴保温1min。冰水冷却，测定其在630nm处的吸光度值。以蒸馏水作为空白对照，结果以质量分数(％)表示，计算公式：
可溶性糖含量(％)＝(m’×V×N)/(Vs×m×106)×100％
其中m'是从标准曲线查得的蔗糖的质量(μg)，V是提取液的总体积(mL)，N是稀释倍数，Vs是测定时吸取样液体积(mL)，M是样品质量(g)。
2、可滴定酸：采用氢氧化钠滴定法进行测定。称取约1g样品，加入适量蒸馏水低温条件下研磨成匀浆，转至50mL离心管冰上静置1h，每10min震荡一次。4℃，8000rpm条件下离心5min，吸取上清液于25mL容量瓶并定容至刻度线。放入80℃水浴锅中保温30min。吸取5mL样液转入50mL三角瓶中，加入3滴1％酚酞。用0.01mol/L的NaOH进行滴定，以溶液呈淡粉色且30s内不褪色时为滴定终点。蒸馏水作为空白对照，结果以质量分数(％)表示。
可滴定酸含量(％)＝(V×c×(V1-V0)×0.067)/(Vs×m)×100％
其中V是样品提取液的总体积(mL)，c为NaOH浓度(mol/L)，V1滴定样液消耗的氢氧化钠溶液体积(mL)，V0是滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠溶液体积(mL)，Vs是滴定时所取样液体积(mL)，m是样品质量(g)，0.067为苹果酸折算系数(g/mmol)。
3、可溶性固形物：取适量果实样品低温条件下研磨成匀浆，经过4℃，8000rpm条件下离心5min，吸取上清液。采用手持式折光仪测定樱桃番茄可溶性固形物的含量。
4、维生素C：采用2，6-二氯酚靛酚滴定法进行测定。称取1g樱桃番茄组织样品置于研钵中，加入适量1％草酸溶液，在冰浴避光条件下研磨成匀浆，转入50mL离心管中，用1％草酸溶液冲洗研钵，倒入离心管中。4℃，8000rpm条件下离心10min，吸取上清液于25mL棕色容量瓶并定容至刻度，摇匀。取5mL样液于25mL的三角瓶中，用经标定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定样液，至出现微红色且30s不褪色为滴定终点，同时以5mL1％的草酸溶液做空白对照。根据2，6-二氯酚靛酚的用量，计算樱桃番茄中抗坏血酸的含量，以每100g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。
滴定度T＝(c×V)/(V1-V0)
其中c是抗坏血酸标准溶液的质量浓度(mg/mL)，V是吸取抗坏血酸标准溶液体积(mL)，V1是滴定标准液体时消耗的2，6-二氯酚靛酚溶液体积(mL)，V0是滴定空白(1％草酸)时消耗的2，6-二氯酚靛酚溶液体积(mL)。
抗坏血酸含量(mg/100g)＝(V×(V1-V0)×T)/(Vs×m)×100
其中V是样品提取溶液总体积(mL)，V1是样品滴定消耗的染料的体积(mL)，V0是滴定空白时消耗的染料的体积(mL)，Vs是滴定时所取样品溶液的体积(mL)，m是样品质量(g)。
二、试验结果
由图2可以看出，1×108cells/mL卡利比克毕赤酵母处理的樱桃番茄20℃贮藏30d后，其发病率仅为29.76％，比对照组(60.67％)降低了50.95％。可见卡利比克毕赤酵母对采后樱桃番茄的自然腐烂具有显著的控制作用。因此，本申请专利的卡利比克毕赤酵母对樱桃番茄采后自然腐烂具有显著的防治效力。
按照上述步骤测定的樱桃番茄的品质指标如表1所示。
表1 卡利比克毕赤酵母对樱桃番茄贮藏品质的影响
从表中可以看出，卡利比克毕赤酵母处理的樱桃番茄果实在贮藏过程中，其可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物、维生素C含量均高于对照组，但二者之间无显著性差异。因此，卡利比克毕赤酵母处理对樱桃番茄品质无显著不良影响，且在一定在程度上可以缓解果实品质劣变。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (9)
1.一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)首先将卡利比克毕赤酵母接种在NYDB培养基中进行第一次活化培养，得到活化液；然后，吸取活化液转接入新的NYDB培养基中，进行第二次活化培养，得到酵母培养液，经离心后得到菌泥，用无菌生理盐水洗涤后，配制成卡利比克毕赤酵母菌悬液，浓度为1×107～1×109cells/mL，待用；
(2)选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小均匀的樱桃番茄，进行消毒处理，然后用流动清水冲洗，清洗后的樱桃番茄放入已消毒的塑料筐中晾干；在晾干后的樱桃番茄赤道部位形成统一大小和深度的伤口，每个伤口处等量加入步骤(1)制备的卡利比克毕赤酵母菌悬液，静置一段时间后接种链格孢孢子悬浮液，自然晾干后用保鲜膜将其密封，并放置于恒温恒湿培养箱中培养，验证了卡利比克毕赤酵母对樱桃番茄采后黑斑病具有显著的控制效果；
或者选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小相近的樱桃番茄，不经任何消毒处理，保持樱桃番茄的自然状况，直接将樱桃番茄浸泡于步骤(1)中的卡利比克毕赤酵母菌悬液中，浸泡一段时间后取出，置于消毒后的塑料筐中，待樱桃番茄自然晾干后用保鲜膜密封塑料筐，置于恒温恒湿培养箱中贮藏，即可实现樱桃番茄采后病害防治及贮藏保鲜的用途；
所述的卡利比克毕赤酵母，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.3616。
2.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，所述步骤(1)中第一次活化培养和第二次活化培养的培养条件均为：28℃培养20～24h；所述离心的条件为：4℃，8000rpm，时间10～15min。
3.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，所述步骤(1)中吸取活化液转接入新的NYDB培养基中，具体是以体积比为1-2％的接种量进行转接。
4.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，所述步骤(2)中樱桃番茄消毒处理的操作为：将樱桃番茄浸入含有0.3％次氯酸钠溶液的水溶液中消毒1～3min。
5.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，所述步骤(2)中打孔的孔径为3mm，深度3mm；所述静置一段时间为2h。
6.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，所述步骤(2)中每个伤口处加入的酵母菌悬浮液与链格孢孢子悬浮液的体积比为1:1；所述链格孢孢子悬浮液的浓度为1×105spores/mL。
7.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，所述步骤(2)中恒温恒湿培养箱中培养的温度为20℃，相对湿度为90％。
8.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中所述塑料筐消毒为清洗干净晾干后，再用体积分数75％的酒精喷洒消毒。
9.根据权利要求1所述一种卡利比克毕赤酵母用于樱桃番茄采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，所述的NYDB培养基的组分为，以1000mL计：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。
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2021
- 2021-08-26 CN CN202110986420.1A patent/CN113729075B/zh active Active
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