CN111887293B - 一种酿酒酵母用于娃娃菜采后病害控制及贮藏保鲜的用途 - Google Patents
一种酿酒酵母用于娃娃菜采后病害控制及贮藏保鲜的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于果蔬采后病害生物防治领域，涉及一种酿酒酵母用于娃娃菜采后病害控制及贮藏保鲜的用途；其中控制采后病害的步骤为：选取娃娃菜的菜叶，消毒晾干后用清水冲洗，再放入无菌的塑料筐内，晾干后在菜叶叶片表面均匀喷洒酵母菌悬液，静置后，再喷洒细极链格孢菌孢子悬浮液，自然晾干、保鲜膜密封，实现对娃娃菜黑斑病的控制；用于贮藏保鲜的用途，步骤为：将娃娃菜置于消毒塑料筐中，表面均匀喷洒酵母菌悬液，自然晾干后，用保鲜膜密封，于20℃下存放，即可实现对采后娃娃菜病害的防治及贮藏保鲜；本发明安全环保，不仅有效控制采后黑斑病，而且在一定程度上减缓娃娃菜品质的下降，代替化学杀菌剂防治娃娃菜采后病害，具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于果蔬采后病害生物防治领域，具体涉及一种酿酒酵母用于娃娃菜采后病害控制及贮藏保鲜的用途。
背景技术
娃娃菜，是一种袖珍型小株白菜，属十字花科芸薹属白菜亚种，为半耐寒性蔬菜。娃娃菜质地脆嫩、营养丰富、物美价廉、可食率高，是一种深受欢迎的蔬菜品种，具有极高的市场价值。娃娃菜富含丰富的B族维生素、维生素C、胡萝卜素、叶酸，以及钙、磷、铁等微量元素，且叶绿素含量较高。娃娃菜有助于胃肠蠕动，促进排便、解渴利尿。娃娃菜可抑制亚硝酸盐的吸收，减少乳腺癌的发生，有防癌抗癌等作用。
采后娃娃菜呼吸代谢旺盛，且在贮运和销售过程中容易受到病原菌侵染而产生黑斑甚至腐烂等现象，导致其品质下降，失去食用价值。在娃娃菜的采后病害中，由链格孢属真菌引起的黑斑病是最常见且发病率最高的真菌性病害之一。病害在田间和贮藏期大量发生，造成严重的经济损失。因此，采取合适的方法防治娃娃菜采后病害是如今亟待解决的问题。
目前，果蔬采后病害的控制方法主要有物理防治、化学防治和生物防治三种方法。物理方法的优点是安全无害，对人体及自然环境无不良影响，但对设备的要求往往较高，控制效果有局限性，如有些致病菌耐低温，低温下仍可生长，造成果蔬腐败，且可能造成冷害。化学杀菌剂因其高效、低价、使用方便的优点，是现今使用仍最为广泛、且最为常见的一种防治方法。但由于长期使用化学杀菌剂会导致病原菌产生抗药性，降低化学药剂的杀菌效果，且在使用过程中会对环境造成污染，并且在果蔬上存在农药残留，处理不当会在食用时还对人类健康造成危害。因而，生物防治法成为目前果蔬采后病害防控研究的热点。
生物防治是采用微生物菌株，通过浸泡或喷洒等方式处理果蔬，以防治和控制果蔬采后病害的保鲜方法。目前，已经研究的可作为果蔬采后病害拮抗菌的微生物包括：细菌、霉菌和酵母菌等。其中的酵母菌因其遗传稳定，抑菌谱广，并且具有较强的抗逆能力，在防治过程能够迅速的适应果蔬表面的环境进行定殖并快速生长繁殖，同病原菌竞争营养和空间，而具有广泛的应用前景。拮抗酵母菌已在苹果、柑橘、番茄、葡萄和草莓等水果上广泛应用，并取得了很好的效果。如海洋拮抗酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman)可抑制梨果实采后的青霉病；美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)S4-1可抑制草莓腐败病；罗伦隐球酵母(Cryptococcus lauentii)可显著增强番茄果实对灰霉病(病原菌为灰葡萄孢Botrytis cinerea)和黑霉病(病原菌为链格孢霉Alternariaalternata)的抗性等。但目前还没有针对娃娃菜采后黑斑病病害防治的酵母菌。
发明内容
针对现有技术的缺陷与不足，本发明提供一种酿酒酵母用于娃娃菜采后病害控制及贮藏保鲜的用途；本发明中的酿酒酵母(CGMCC No.7129)Y-912经急性动物试验证明为一种安全的酵母；研究结果表明，酿酒酵母能显著降低娃娃菜在贮藏过程中黑斑病病情指数，有效控制娃娃菜采后黑斑病和自然腐烂的发生，延缓其生理品质的下降，从而达到娃娃菜贮藏保鲜的目的；减少娃娃菜采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所提供的防治娃娃菜采后病害的酿酒酵母Y-912，已于2012年保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.7129；此外，本发明所利用的菌株申请人已经获批中国发明专利，专利号ZL201310648466.8，发明名称为：酿酒酵母、在水果采后病害防治的应用及使用方法。
1.酿酒酵母Y-912用于娃娃菜采后病害控制的用途，按照下述步骤进行：
首先，本发明的酿酒酵母Y-912用于控制娃娃菜采后黑斑病，具体步骤为：选取新鲜的娃娃菜，去除外层后，选取健康无黑斑、大小、颜色一致的菜叶，消毒后用清水将其冲洗干净，放入无菌的塑料筐内晾干；晾干后的菜叶表面均匀喷洒1.0×108cells/mL的酵母菌悬液，静置1～2h后，再喷洒细极链格孢菌孢子悬浮液(1×106spores/mL)；待娃娃菜自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温培养箱中贮藏；结果表明，酿酒酵母Y-912对娃娃菜黑斑病具有良好的控制效果。
所述消毒是用0.02％的次氯酸钠溶液将整片浸泡1～2min；所述恒温培养箱的温度为20℃，相对湿度为90％。
2.酿酒酵母Y-912用于娃娃菜贮藏保鲜的用途，按照下述步骤进行：
(1)首先将酿酒酵母Y-912接种在NYDA培养基上、28℃培养24h进行活化；然后，转接入NYDB培养基中，在28～30℃培养20～24h；活化后的酵母培养液经离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次后，重新用无菌生理盐水配置成1.0×108cells/mL的菌悬液；
(2)控制娃娃菜自然腐烂：选取新鲜的娃娃菜，不做消毒处理，保持娃娃菜的自然状态；将娃娃菜菜叶置于消毒塑料筐中，将1.0×108cells/mL的酵母菌悬液喷洒于娃娃菜表面，使其均匀覆盖；晾干后进行密封，置于相对湿度为90％、温度为20℃的恒温培养箱中贮藏，即可实现采后娃娃菜的贮藏保鲜。
优选的，所述离心的转速为7000r/min，时间为15min。
优选的，所述的NYDA培养基成分如下：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，115℃湿热灭菌20min。
优选的，所述的NYDB培养基成分如下：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃湿热灭菌20min。
优选的，所述接种在NYDB培养基中的接种量为1～2％。
优选的，所述用无菌生理盐水洗涤数次具体为2～3次。
优选的，所述密封时采用保鲜膜进行密封。
本发明的优点：
(1)本发明所使用的酿酒酵母Y-912经动物急性毒性试验确认其安全无毒，对人体健康无危害。
(2)本发明所使用的酿酒酵母Y-912可以有效控制娃娃菜采后黑斑病和自然腐烂，从而降低娃娃菜采后病害所造成的损失。
(3)本发明所使用的酿酒酵母Y-912对采后娃娃菜主要品质指标：维生素C和有机酸含量无显著不良影响，且可以减缓维生素C含量和失重率的降低以及有机酸含量的增加，从而控制娃娃菜品质下降。
(4)本发明所使用的酿酒酵母Y-912目前尚未有在娃娃菜采后病害防治上应用的报道，具有独创性。
本发明使用酿酒酵母Y-912，既可以代替化学杀菌剂防治娃娃菜采后病害，减少化学杀菌剂对人体及环境的潜在危害，亦可减少使用物理方法贮藏保鲜时所产生的经济和能源负担，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为不同酵母菌对细极链格孢菌的体外抑制作用。注：CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；S.cerevisiae为1×108cells/mL酿酒酵母Y-912菌悬液处理组；S.pararoseus为1×108cells/mL拟粉红锁掷孢酵母菌悬液处理组；所用细极链格孢菌孢子悬浮液浓度均为5×104spores/mL。
图2为酿酒酵母Y-912处理对娃娃菜叶片病情指数的影响。注：CK blade为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y blade为1×108cells/mL酿酒酵母Y-912菌悬液处理组；所用细极链格孢菌孢子悬浮液浓度均为1×106spores/mL；不同字母代表差异显著(P<0.05)。
图3为酿酒酵母Y-912处理对娃娃菜叶柄病斑直径的影响。注：CK petiole为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y petiole为1×108cells/mL酿酒酵母Y-912菌悬液处理组；所用细极链格孢菌孢子悬浮液浓度均为1×106spores/mL；不同字母代表差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
通过借助以下实施实例更加详细的诠释本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
酿酒酵母Y-912培养程序为：(1)斜面保存菌种的活化：将所用酵母菌株接种于NYDB培养基中，在28℃、180rpm摇床中培养24h，进行活化；(2)液体培养：在250mL的三角瓶中装入50mL的NYDB培养基，用移液枪吸取1mL活化好的菌液，在28℃、180rpm条件下培养24h；(3)酵母菌悬浮的制备：将上述酵母培养液在7000r/min条件下，离心15min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次，以去除培养基质，最后用无菌生理盐水重新悬浮，最终调节至所需的酵母细胞浓度。
本发明所用到的病原菌—细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)系从感病娃娃菜上分离筛选得到，将分离纯化的病原菌接种到在PDA培养基上25℃培养8d，刮取孢子于无菌生理盐水中振荡均匀，调至所需浓度。
本发明实验中所使用的S.pararoseus为拟粉红锁掷孢酵母，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.2.5351。
实施例1：
不同酵母对防治娃娃菜采后病害体外的抑制作用；
一、试验方案
1.酵母悬液的制备
250mL三角瓶中装50mL NYDB培养基，用移液枪吸取1mL活化好的酿酒酵母Y-912，在28℃、180rpm条件下培养24h，得到酵母培养液，在7000r/min条件下，离心15min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次，配置成1.0×108cells/mL的酵母悬浮液。
2.霉菌孢子悬液的制备
刮取PDA培养基上的细极链格孢菌孢子于无菌生理盐水中反复吹打，震荡10min，调整浓度至成5.0×104spores/mL的孢子悬浮液。
3.不同酵母菌对细极链格孢菌的体外抑制作用
在无菌的9cm培养皿中倒入30mL的PDA培养基，冷却凝固后，用直径5mm的打孔器在培养基中央打孔；取70μL的1.0×108cells/mL酿酒酵母Y-912悬浮液加入孔中，对照组为70μL的无菌生理盐水。2h后加入浓度为5.0×104spores/mL的细极链格孢悬浮液70μL；静置2h后放入28℃恒温培养箱中培养，3d后用游标卡尺测量霉菌病斑直径的大小。每个处理5个平板，重复3次。
二、试验结果
由图1可知，与酿酒酵母Y-912共培养的细极链格孢菌菌落直径的显著低于拟粉红锁掷孢酵母和CK对照组(p<0.05)。说明，酿酒酵母Y-912对娃娃菜采后黑斑病具有显著的控制作用，用于后续试验。
实施例2：
酿酒酵母Y-912用于娃娃菜采后黑斑病控制的用途；
一、试验方案
首先，本发明的酿酒酵母Y-912用于控制娃娃菜采后黑斑病，具体步骤为：选取新鲜的娃娃菜，去除外层后，选取大小和颜色一致、表面无机械损伤及病虫伤害的菜叶，用0.02％的次氯酸钠溶液将整片浸泡1min，然后用清水将其冲洗干净，放入无菌的塑料筐内晾干。
在菜叶叶片和叶柄处分别进行不同的处理：菜叶的叶片部分均匀喷洒1.0×108cells/mL的酵母菌悬液，2h后，再喷洒细极链格孢菌孢子悬浮液(浓度为1×106spores/mL)；以无菌生理盐水代替酵母菌悬液的处理为对照组。
菜叶叶柄处用无菌打孔器打出4mm×3mm(直径×深度)的孔洞，每孔加入10μL浓度为1.0×108cells/mL的酵母菌悬液，2h后再加入10μL浓度为1×106spores/mL的细极链格孢菌孢子悬液。以无菌生理盐水代替酵母菌悬液的处理为对照组。待娃娃菜自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温培养箱中贮藏，(RH 90％、20℃)，定时取样统计叶片病情指数和叶柄病斑直径。每个处理重复4次，每次重复12片娃娃菜菜叶。
腐烂率计算公式如下：
腐烂率＝腐烂叶片数/总的叶片数×100％
病情分级标准如下：
0：无病；
1：娃娃菜叶片有褐色小点；
3：娃娃菜叶片有2-3mm黄褐斑；
5：娃娃菜叶片有3.10-5mm黄褐斑；
7：娃娃菜叶片有5.10-7mm黄褐斑；
9：娃娃菜叶片有7mm以上黄褐斑，腐烂严重
病情指数的计算公式如下：
腐烂指数＝∑(级别×该级果数)/(总果数×最高级值)×100％
二、试验结果
由图2可知，无论是对照组还是酵母菌处理组娃娃菜叶片的病情指数均随着贮藏时间的延长而增加，但在相同时间点，处理组叶片的病情指数均显著低于对照组(p<0.05)。从图3可以看出，在前6天，对照组和处理组叶柄的病斑直径均随着贮藏时间的延长而增加。贮藏6d后，由于失水较严重，叶柄皱缩，导致病斑直径增加均不明显。但在整个贮藏期间，酵母处理组叶柄病斑直径均显著低于对照组(p<0.05)。因此，1×108cells/mL酿酒酵母菌对娃娃菜采后黑斑病具有显著的控制作用。
实施例3：
酿酒酵母Y-912用于娃娃菜贮藏保鲜的用途，即对采后自然腐烂和品质(Vc、可滴定酸、失重率)的影响；
将大小一致、表面无机械损伤及病虫伤害的娃娃菜菜叶置于消毒塑料筐中，将1.0×108cells/mL的酵母菌悬液喷洒于娃娃菜菜叶表面，使其均匀覆盖；晾干后进行密封，置于恒温培养箱中贮藏(RH 90％、20℃)一定时间后统计娃娃菜腐烂率和病情指数，并测定叶片及叶柄的Vc和可滴定酸含量，以及菜叶失重率。每个处理重复5次，每次重复12个菜叶。
腐烂率计算公式如下：
腐烂率＝腐烂叶片数/总的叶片数×100％
病情指数的计算公式如下：
腐烂指数＝∑(级别×该级果数)/(总果数×最高级值)×100％
具体测定方法如下：
1.Vc含量：2,6-二氯靛酚钠法，分别取5g娃娃菜叶片和叶柄样品置于研钵中，加入5mL2％草酸溶液，在冰浴避光条件下研磨，研磨呈浆状后，转入50mL离心管中，用10mL1％草酸溶液分两次冲洗研钵，倒入套有锡箔纸的离心管中，4℃、12000r/min下离心15min，吸取上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过滤溶液备用(0.45μm滤膜)。取10mL滤液置于25mL的锥形瓶中，用经标定的2,6-二氯靛酚溶液滴定滤液，至出现微红色且30s不褪色。记下用量，同时以10mL 2％的草酸溶液做空白，按照同样的方法进行滴定，重复3
次。根据2,6-二氯靛酚的用量，计算娃娃菜中Vc的含量，以每100g样品(鲜重)中含有的Vc的质量表示，即mg/100g。
Vc含量计算如下：
其中V1是样品滴定消耗的染料体积(mL)，V0是空白滴定消耗的染料体积(mL)，VT是样品提取液总体积(mL)，Vs是滴定时所取样品溶液体积(mL)，A是1mL染料溶液相当于Vc的质量，单位mg/mL，W是样品质量(g)。
2.可滴定酸含量：分别取1g娃娃菜叶片和叶柄样品置于研钵中，加入2mL蒸馏水研磨呈浆状后，转入50mL离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研磨，收集到离心管中，室温放置1h；4℃、12000r/min下离心15min，吸取上清液于100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过滤溶液备用(0.45μm滤膜)。取30mL于试管中，80℃水浴30min；
取上清液于锥形瓶中，加两滴酚酞，用0.01mol/L NaOH滴定至淡红，按照同样的方法进行滴定，重复3次。
可滴定酸含量计算如下：
其中V为样品提取液总体积(mL)，VS是滴定时所取样品溶液体积(mL)，c是NaOH溶液的浓度(mol/L)，V1是滴定滤液消耗NaOH溶液体积(mL)，V0是空白滴定消耗NaOH溶液体积(mL)，m表示所取样品的质量(g)；f表示折算系数(g/mol)，娃娃菜折算系数按照蔬菜中草酸进行计算，即0.067。
3.失重率：随机取20个娃娃菜叶片，称量记录原始重量，分别在10、20、30d再称重，计算失重率。
失重率计算公式如下：
失重率＝(初始重-取样时重)/初始重×100％
二、试验结果
酿酒酵母对娃娃菜叶片和叶柄自然腐烂及其品质的影响结果如表1所示。由表可知，随着贮藏时间的增加，对照组和处理组叶片的腐烂率和腐烂指数均逐渐增加，贮藏至30d时，腐烂率均达到100％。但同一时间，酿酒酵母处理组叶片的腐烂率和病情指数均低于对照组，且20d和30d病情指数具有显著性差异(p<0.05)。而叶柄腐烂率和病情指数变化趋势类似于叶片，但在同一时间叶柄的指标均高于叶片，且对照组叶柄腐烂率在贮藏至20d时即达到100％。同一时间处理组叶柄腐烂率和病情指数均低于对照组，且贮藏20d和30d的病情指数具有显著性差异(p<0.05)。
从表1可以看出，酿酒酵母处理组叶片和叶柄的Vc含量均高于同时间对照组，部分具有显著性差异(p<0.05)。在贮藏过程中，对照组和处理组叶柄可滴定酸含量无显著性差异。但贮藏20d和30d时，处理组叶片可滴定酸含量显著低于对照组。而在整个贮藏过程中，对照组菜叶失重率均显著高于处理组，尤其是贮藏20d和30d时。推测是对照组叶片在贮藏后期严重失水，导致其可滴定酸含量高于处理组；
因此，1×108cells/mL酿酒酵母Y-912对娃娃菜采后自然腐烂具有良好的控制效果，且可以缓解娃娃菜Vc含量的降低和失重率的增加，对可滴定酸含量无显著不良影响(叶片后期失重引起的对照组可滴定酸含量升高除外)。
表1酿酒酵母Y-912对娃娃菜自然腐烂及品质的影响。
注：CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y为浓度1×108cells/mL的酿酒酵母Y-912菌悬液处理组；a表示同一天不同处理的娃娃菜叶片有显著性差异(P<0.05)；*表示同一天不同处理的娃娃菜叶柄有显著性差异(P<0.05)；失重率是对娃娃菜整片叶子的测量，A表示同一天不同处理娃娃菜菜叶失重率有显著性差异(P<0.05)。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (5)
1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y-912用于娃娃菜采后病害的控制及贮藏保鲜的用途，其特征在于，具体步骤如下：
（1）所述酿酒酵母Y-912用于娃娃菜采后病害控制的用途：选取新鲜的娃娃菜，去除外层后，取健康无黑斑、大小、颜色一致的菜叶，消毒后用清水将其冲洗干净，放入无菌的塑料筐内晾干；晾干后在菜叶表面均匀喷洒1.0×108 cells/mL的酿酒酵母Y-912菌悬液，静置1~2 h后，再喷洒浓度为1×106 spores/mL细极链格孢菌孢子悬浮液；待娃娃菜自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温培养箱中贮藏，实现酿酒酵母Y-912对娃娃菜黑斑病的控制；
（2）所述的酿酒酵母Y-912用于娃娃菜贮藏保鲜的用途：
（a）首先将酿酒酵母Y-912进行活化，然后接种在NYDB培养基中、于28℃发酵培养24 h，离心后收集的菌体用无菌生理盐水洗涤数次后，再用无菌生理盐水制备成1×108 cells/mL的菌悬液；
（b）选取新鲜的娃娃菜，不做消毒处理，保持娃娃菜的自然状况；将娃娃菜放入消毒的塑料筐中，将步骤（a）得到的酵母菌悬液均匀喷洒于娃娃菜表面，室温下晾干，用保鲜膜进行密封，置于相对湿度为90%、温度为20℃的恒温培养箱中贮藏，实现对娃娃菜的贮藏保鲜；
所述酿酒酵母Y-912，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCCNo.7129。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（1）中所述消毒是用0.02%的次氯酸钠溶液将整片浸泡1~2 min；所述恒温培养箱的温度为20℃，相对湿度为90%。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中所述离心的转速为7000r/min，时间为15 min。
4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中所述接种在NYDB培养基中的接种量为1~2%；所述的NYDB培养基为：酵母膏5 g，葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，蒸馏水1000 ml，pH自然，115℃灭菌20 min。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中所述用无菌生理盐水洗涤数次具体为2~3次。
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