CN107904181A - 一株用于果蔬采后病害防治的酿酒酵母by21及其制备与使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株用于果蔬采后病害防治的抑菌谱广、效果稳定的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY21及其使用方法。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏菌株编号为CGMCC No.14904。该酿酒酵母的使用方法：将菌株活化，用YPD发酵培养，离心，菌体用无菌水配成1×108细胞/mL的菌悬液；将梨、葡萄、草莓、柑橘或圣女果等果蔬放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，常温贮藏。该酿酒酵母菌株可同时控制梨果实青霉病，葡萄灰霉病、曲霉病、黑斑病、镰孢霉病、炭疽病和红粉病，草莓灰霉病和曲霉病，柑橘青霉病，以及圣女果灰霉病和曲霉病，减少采后病害造成的损失，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及果蔬采后病害生物防治领域，尤其涉及一株用于果蔬采后病害生物防治的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株对苹果、梨、葡萄、草莓、柑桔、圣女果的主要采后病害均具有显著的防治效果。
背景技术
虽然新鲜果蔬品质劣变受诸多因素的影响，但病害是最主要的原因。其中，真菌性病害引起的腐烂变质是果实采后损失中最严重的因素。虽然可以通过农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等很多途径进行防治果蔬采后病害，但目前的主要措施是化学防治(Eckert & Ogawa，1985，1988)。然而，长期使用化学农药不但导致病原菌产生耐药性而降低杀菌效果(Prusky et al.，1985； as et al.，1991；Holmes & Eckert，1999)，而且频繁地使用高浓度的化学药剂也增加了果实上的农药残留量，严重威胁人们的健康，并造成环境污染(Gullion & Kuijipers，1994)。因此，开发安全、高效、无毒、低抗性的果实采后病害控制新技术成为当前世界各国的研究重点(Falik et al.，1995；Tian et al.，2001；Kulakiotuet al.，2004)，其中利用生物拮抗菌防治是目前被证明安全有效的新方法(Wilson & Wisniewski，1989；Janisiewicz & Koersten，2002)。
迄今为止，国内外已经筛选出了许多对水果采后病原真菌具有明显抑菌效果的细菌、酵母菌和小型丝状真菌，其中利用拮抗酵母菌防治果实采后病害是当前已被证明的安全、高效的新技术，这主要由于大多数病原菌通过伤口入侵果实，而酵母菌主要通过与病原菌进行营养和空间竞争来防治病害，而且拮抗酵母菌能够适应低温、低氧、高二氧化碳等果实采后贮藏条件(王友升，2012)。
然而，虽然目前国内外报道的拮抗酵母菌有近百种，但大多数拮抗酵母菌的生防效果仅在少数果实上得到验证。而由于同一酵母菌的不同菌株之间的生防效果有很大差异(Filonowet al.，1996)，因此，大多数拮抗酵母菌的缺乏抑菌谱广、效果稳定的菌株。
发明内容
针对上述技术难题，本发明的目的在于提供一株用于果蔬采后病害生物防治的抑菌谱广、效果稳定的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株BY21及其制备方法和用途。该种用于果蔬采后病害生物防治的酿酒酵母BY21，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏菌株编号为CGMCC No.14904。
该酿酒酵母菌株进行果蔬采后病害防治和贮藏保鲜的方法，按照以下步骤进行：将酿酒酵母活化，用YPD液体培养基发酵培养，离心得到菌体，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108细胞/mL的菌悬液；将梨、葡萄、草莓、柑橘和圣女果等果蔬放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，密封后，放入常温贮藏。
该酿酒酵母BY21的制备方法为，将菌株从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍。所述YPDA培养基是：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。所述的酿酒酵母菌株可同时用于控制梨果实青霉病，葡萄灰霉病、曲霉病、黑斑病、镰孢霉病、炭疽病和红粉病，草莓灰霉病和曲霉病，柑橘青霉病，以及圣女果灰霉病和曲霉病。
本发明所提供的菌株是从自然发酵的酿酒葡萄醪液中筛选分离到的对梨、葡萄、草莓、柑橘、圣女果采后病害具有显著防治效果的酿酒酵母BY21，可广泛用于果蔬采后病害的防治，减少采后病害造成的损失，具有很好的应用前景。
本发明的优点：(1)本发明所提供的酿酒酵母BY21为本实验室从葡萄酒发酵醪液中筛选得到，其对人体无害，安全性高。(2)本发明所使用的酿酒酵母BY21抑菌谱广，可以同时控制梨果实青霉病，葡萄灰霉病、曲霉病、黑斑病、镰孢霉病、炭疽病和红粉病，草莓灰霉病和曲霉病，柑橘青霉病，以及圣女果灰霉病和曲霉病。(3)本发明所提供的酿酒酵母BY21在YPD培养基中生长良好，易于培养，性状稳定，且单独使用一定浓度该菌悬液就能有效防治多种果蔬采后病害，使用成本低，市场前景广阔。(4)本发明所提供的酿酒酵母BY21可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，且不污染环境，社会和生态效益显著。
通过以下实施实例更加详细的说明本发明。以下实施实例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
附图说明
图1为本发明酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY21的26S rDNA D1/D2区核酸序列进化关系图。
图2为酿酒酵母BY21对酿酒酵母对梨果实青霉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；S.c：1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
图3为酿酒酵母BY21对葡萄灰霉病、曲霉病、黑斑病、镰孢霉病、炭疽病和红粉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；S.c：1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
图4为酿酒酵母BY21对草莓灰霉病和曲霉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；S.c：1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
图5为酿酒酵母BY21对柑橘青霉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；S.c：1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
图6为酿酒酵母BY21对圣女果灰霉病和曲霉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；S.c：1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
具体实施方式
实施例1：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY21的生物学特性
1.形态学特征
(1)YPDA培养基(酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，121℃灭菌20min)上26℃培养48h，菌落呈圆形、白色，菌落边缘光滑圆润。细胞形态呈椭球型。
(2)在YPDA液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖。
2.分子生物学鉴定
以通用正向引物NL-1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和反向引物NL-4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)进行PCR扩增酿酒酵母BY21 26S rDNA D1/D2区核酸序列，将PCR产物的测序结果输入网站www.NCBI.nlm.nih.gov进行BLAST，从GenBank数据库中下载同源序列，通过MEGA6软件构建进化树如图1，确定筛选到的菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
本发明的酿酒酵母BY21已保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌株保藏委员会普通微生物中心，保藏时间为2017年11月15日，保藏编号为CGMCC No.14904，建议的分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
实施实例2酿酒酵母BY21对梨果实青霉病的抑制效果
1.实验方案
将酿酒酵母BY21从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。
将青霉病菌(Penicillium expansum)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104细胞/mL的青霉病菌孢子悬浮液。
将健康无损的梨果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打5个孔，表面伤口为2mm(直径)×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL青霉病菌孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价酿酒酵母BY21的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验，统计梨果实的发病率结果如图2所示，对照组梨果实青霉病发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的果实青霉病发病率为26％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制梨果实青霉病病害。
实施实例3酿酒酵母BY21对葡萄采后病害的抑制效果
1.实验方案
将酿酒酵母BY21从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。
将灰霉菌(Botrytis porri)、刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、链格孢菌(Alternaria eichhorniae)、芬芳镰孢菌(Fusarium redolens)、果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)或粉红单端孢(Trichothecium roseum)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104细胞/mL的灰霉菌、刺孢曲霉、链格孢菌、芬芳镰孢菌、果生炭疽菌或粉红单端孢孢子悬浮液。
将健康无损的梨果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打1个孔，表面伤口为2mm(直径)×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL将灰霉菌、刺孢曲霉、链格孢菌、芬芳镰孢菌、果生炭疽菌或粉红单端孢孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价酿酒酵母BY21的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验，统计葡萄果实的发病率结果如下：
(1)酿酒酵母BY21对葡萄果实灰霉病的抑制效果
如图3所示，对照组葡萄果实灰霉病发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的葡萄果实灰霉病发病率为0，因此酿酒酵母BY21能够有效控制葡萄果实灰霉病病害。
(2)酿酒酵母BY21对葡萄果实曲霉病的抑制效果
如图3所示，对照组葡萄果实曲霉病的发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的葡萄果实曲霉病发病率为0％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制葡萄果实曲霉病病害。
(3)酿酒酵母BY21对葡萄果实黑斑病的抑制效果
如图3所示，对照组葡萄果实黑斑病的发病率为100％，经过酿酒酵母BY21的葡萄果实黑斑病发病率为13％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制葡萄果实黑斑病病害。
(4)酿酒酵母BY21对葡萄果实镰孢霉病的抑制效果
如图3所示，对照组葡萄果实镰孢霉病的发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的葡萄果实镰孢霉病发病率为60％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制葡萄果实镰孢霉病病害。
(5)酿酒酵母BY21对葡萄果实炭疽病的抑制效果
如图3所示，对照组葡萄果实炭疽病的发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的葡萄果实炭疽病发病率为53％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制葡萄果实炭疽病害。
(6)酿酒酵母BY21对葡萄果实红粉病的抑制效果
如图3所示，对照组葡萄果实镰孢霉病的发病率为100％，经过酿酒酵母菌株BY21处理的葡萄果实镰孢霉病发病率为20％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制葡萄果实镰孢霉病病害。
实施实例4酿酒酵母BY21对草莓果实灰霉病和曲霉病的抑制效果
1.实验方案
将酿酒酵母BY21从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，
去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。
将灰霉病菌(Botrytis porri)或刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104细胞/mL的灰霉病菌或刺孢曲霉孢子悬浮液。
将健康无损的草莓果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打1个孔，表面伤口为2mm(直径)×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108细胞/mL的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株BY21菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL灰霉病菌或刺孢曲霉孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株BY21的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验，统计草莓果实的发病率结果如下：
(1)酿酒酵母BY21对草莓果实灰霉病的抑制效果
如图4所示，对照组草莓果实灰霉病发病率为90％，经过酿酒酵母BY21处理的草莓果实灰霉病发病率为44％，因此酿酒酵母能够有效控制草莓果实灰霉病病害。
(2)酿酒酵母BY21对草莓果实曲霉病的抑制效果
如图4所示，对照组草莓果实曲霉病的发病率为60％，经过酿酒酵母BY21处理的草莓果实曲霉病发病率为0，因此酿酒酵母能够有效控制草莓果实曲霉病病害。
实施实例5酿酒酵母BY21对柑橘青霉病的抑制效果
1.实验方案
将酿酒酵母BY21从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。
将青霉病菌(Penicillium italicum)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104细胞/mL的青霉病菌孢子悬浮液。
将健康无损的草莓果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打1个孔，表面伤口为2mm(直径)×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL青霉病菌孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价酿酒酵母BY21的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验，统计柑橘果实的发病率结果如图5所示，对照组柑橘果实青霉病发病率为73％，经过酿酒酵母BY21处理的柑橘果实青霉病发病率为24％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制柑橘果实青霉病病害。
实施实例6酿酒酵母BY21对圣女果灰霉病和曲霉病的抑制效果
1.实验方案
将酿酒酵母BY21从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液。
将灰霉病菌(Botrytis porri)或刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104细胞/mL的灰霉病菌或刺孢曲霉孢子悬浮液。
将健康无损的圣女果用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打1个孔，表面伤口为2mm(直径)×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108细胞/mL的酿酒酵母BY21菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL灰霉病菌或刺孢曲霉孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价酿酒酵母BY21的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验，统计圣女果发病率结果如下：
(1)酿酒酵母BY21对圣女果灰霉病的抑制效果
如图6所示，对照组圣女果灰霉病发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的圣女果灰霉病发病率为53％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制圣女果灰霉病病害。
(2)酿酒酵母BY21对圣女果曲霉病的抑制效果
如图6所示，对照组圣女果曲霉病的发病率为100％，经过酿酒酵母BY21处理的圣女果曲霉病发病率为33％，因此酿酒酵母BY21能够有效控制圣女果曲霉病病害。
Claims (6)
1.一种用于果蔬采后病害生物防治的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株BY21，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏菌株编号为CGMCC No.14904。
2.权利要求1所述的酿酒酵母BY21进行果蔬采后病害防治和贮藏保鲜的方法，其特征在于按照以下步骤进行：将酿酒酵母活化，用YPD液体培养基发酵培养，离心得到菌体，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108细胞/mL的菌悬液；将果蔬放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，密封后，放入常温贮藏。
3.根据权利要求2所述的果蔬采后病害防治和贮藏保鲜的方法，其特征在于，其中所述果蔬为梨、葡萄、草莓、柑橘和圣女果。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母BY21的制备方法，其特征在于，将菌株从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母BY21的制备方法，其特征在于所述YPDA培养基是：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。
6.一种如权利要求1所述的酿酒酵母BY21的用途，其特征在于：它用于同时控制梨果实青霉病，葡萄灰霉病、曲霉病、黑斑病、镰孢霉病、炭疽病和红粉病，草莓灰霉病和曲霉病，柑橘青霉病，以及圣女果灰霉病和曲霉病。
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Effective date of registration: 20210301 Address after: 276800 1st floor, building 2, new generation information technology industrial park, high tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee after: Rizhao Yuer Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 100048, Fu Cheng Road, Beijing, Haidian District, No. 33 Patentee before: BEIJING TECHNOLOGY AND BUSINESS University |
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Effective date of registration: 20211116 Address after: 276800 floor 1, building 2, new generation information technology industrial park, Rizhao high tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee after: Shandong Kaipu fite Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 276800 floor 1, building 2, new generation information technology industrial park, high tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee before: Rizhao Yuer Biotechnology Co.,Ltd. |
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Effective date of registration: 20230302 Address after: 100000 307, Block E, Zone B, Youlehui, Wangjing, Chaoyang District, Beijing Patentee after: Beijing Huakang Messenger Technology Co.,Ltd. Address before: 276800 1st floor, building 2, new generation information technology industrial park, Rizhao hi tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee before: Shandong Kaipu fite Biotechnology Co.,Ltd. |