CN105385611A - 一种梅奇酵母菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于微生物新资源及微生物应用技术领域的一种梅奇酵母菌及其应用。所述梅奇酵母菌菌株为QHL-12-3，分类命名为Metschnikowia？sp.，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC？No.10463。所述梅奇酵母菌株从果实表面分离筛选得到，是一株新的梅奇酵母菌菌株，该梅奇酵母菌株及其代谢物对桃采后褐腐病及其病原菌均有抑制作用。在所选择的植物病原真菌中，所述梅奇酵母菌对桃褐腐病菌的抑菌圈直径达到10mm以上，说明所述梅奇酵母菌具有稳定、高效的抗菌性能，可应用于防治上述病菌或病害。

Description

一种梅奇酵母菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物新资源及微生物应用技术领域，特别涉及一种梅奇酵母菌及其应用。

背景技术

我国桃园面积超过900万亩，是世界上桃有效种植面积第一大国；年产桃超过40万吨，是世界上桃产量第一大国。北京桃产量位居国内前8名，仅北京平谷一地，桃种植面积就达22万亩(1.47万公顷)之多；桃产业已成为平谷县的经济支柱产业，一些桃子及相关加工产品已经出口到欧盟、日本等国家。2000年以来北京桃褐腐病大面积增加，且逐年加重；其中2005年发病较重的桃园，桃果受害，大量脱落，采摘时未见显症的果实，在采摘2-3天后，50％以上的果实因褐腐病侵染而腐烂，给果农造成了严重的经济损失。2012年北京市植保站桃褐腐病调查结果显示，北京各郊区县桃产区均有桃褐腐病发生，而且桃子在采后的运输和贮藏期间发病率都在30％以上；这大大降低了果实的食用价值和市场价值，严重影响了北京桃产业的发展。

应用杀菌剂防治采后病害是降低果品损失的重要手段，目前国内应用于果实采后病害防治的化学药剂主要为SO₂和噻苯咪唑(Thiabendazole)。SO₂的广泛使用常常会带来环境污染，而且在常距离运输和长期的果实贮藏中，其杀菌效果会随时间而迅速丧失；噻苯咪唑虽然对果实采后真菌病害有较好的防治效果，但对病原细菌没有效果，而且其使用后残效期较长，不易降解，会影响高端果品的对外出口；更重要的是，噻苯咪唑的大范围应用容易使得一些病原菌产生抗药性。生物杀菌剂相对于化学农药而言有天然优势,避免了农药残留、环境污染、抗药性等问题，而且低毒、环保、持效，自然界生态兼容性较好，是化学农药试剂应用最有前景的替代手段之一。

梅奇酵母菌属酵母菌在自然环境中普遍存在，主要存在于含糖量较为丰富的果实表面和花上，是植物微生态系统中的优势微生物种群之一。该菌生长速度快，营养简单，生长力强。在作为生防菌应用方面，它拥有自己独特的优势：1)对环境的污染较少，不产生毒素；2)不产生抗生素，对人类相对比较安全；3)相对于其他真菌而言，不产生致敏孢子；4)所需营养比较简单；5)适合商业化大规模生产。因此，它具有很好的应用前景。

本发明成功获得了一株抑制桃采后褐腐病菌及桃采后褐腐病的梅奇酵母菌，经试验验证，该酵母菌对桃褐腐病菌的抑菌圈直径为10mm以上，说明所述梅奇酵母菌具有稳定、高效的抗菌性能。

发明内容

本发明的目的在于提供一新种梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)。

本发明的目的也在于提供一种病原菌抑制剂，其活性成分为上述梅奇酵母菌和/或其的代谢物。

本发明的目的也在于提供一种病害抑制剂，其活性成分为上述梅奇酵母菌和/或其的代谢物。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)，菌株号为QHL-12-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.10463。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的5.8SrDNA、ITS1/ITS2基因序列，26SrDNA基因序列分别如SEQIDNo.1和No.2所示。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的26SrDNA基因序列进化树分析如图1所示。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3，从果实表面分离得到。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的形态学特征为：菌体营养细胞呈球形，卵形或近球形，单边或多边出芽生殖；20℃下，在YPD培养基和PDA培养基上生长48小时后，菌落为奶油状、乳白色不透明，扁平或圆形，边缘整齐，菌落无褶皱，如图2和图3所示。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的生理生化特征：可进行葡萄糖、麦芽糖弱发酵，不可进行棉子糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和海藻糖发酵；碳源同化方面：葡萄糖、山梨糖、蔗糖、麦芽糖、蜜二糖、海藻糖、纤维二糖、木糖、核糖、松三糖、乙醇、葡萄糖醇、丙三醇、甘露醇、核糖醇、水杨酸、氨基葡萄糖、十六烷和可溶性淀粉为阳性，菌粉、乳酸、甲醇、肌醇、乳糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醇、赤藓糖醇、柠檬酸为阴性。所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3在含有5％(质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10％(质量含量)氯化钠的培养基中可生长；于pH4.0-5.5的培养基中均可正常生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在40℃以上不可生长；最佳适宜生长温度为16-20℃；在不含维生素的培养基上不能生长。所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3产生有机酸,这是生防菌的关键性生防指标。

本发明的目的还在于提供上述梅奇酵母菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂，抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。

上述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的应用中，所述病原菌为桃采后褐腐病菌；所述病害为桃采后褐腐病。

其中，所述桃采后褐腐病菌为Moniliniafructicola、Monilinialaxa或Moniliniafructigena。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的代谢物可从梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的发酵液中获得。

所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的代谢物的制备方法为：将保藏的梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)从PDA固体斜面接种2环至200ml的YPD液体培养基中，于20℃-25℃，150-200rpm条件下，恒温振荡培养24h-48h，得到梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的发酵液；将培养好的发酵液，分装于50ml的离心管中，在4℃和5000rpm条件下，离心5-10min，上清液即梅奇酵母菌代谢物；

PDA固体培养基的主要成分：马铃薯：20％，葡萄糖：2％，琼脂：2％，蒸馏水；

YPD液体培养基的主要成分为：酵母提取物：1％，葡萄糖：2％，胰蛋白胨：2％，蒸馏水。

本发明的有益效果为：获得的梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3是一株新的梅奇酵母菌菌株，它对桃采后褐腐病菌和桃采后褐腐病均具有抑制作用。在所选择的植物病原真菌中，对桃褐腐病菌的抑菌圈直径达到10mm以上，说明所述梅奇酵母菌具有稳定、高效的抗菌性能。所述的梅奇酵母菌及其代谢物可以在抑制桃褐腐病菌、制备桃褐腐病菌制剂；抑制桃褐腐病害，制备桃褐腐病害制剂中应用。

生物材料保藏说明

分类命名：梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)；菌株编号：QHL-12-3

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年01月30日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10463.

附图说明

图1.基于26SrDNA基因序列构建的进化树，进化树分析结果表明梅奇酵母菌QHL-12-3代表的种为一独立分支，梅奇酵母菌QHL-12-3为一新种。

图2.梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3在YPD培养基上生长3天后的显微照片。

图3.梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3在PDA培养基上生长3天后的显微照片。

图4.梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3在PDA培养基上对桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)的抑制效果。

图5.梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3在桃果实上对桃褐腐病斑的抑制效果。

图6.所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3代谢物对桃果实上桃褐腐病斑的抑制效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的病原菌，公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验：

桃褐腐病菌——链核盘菌(Moniliniafructicola(wint.)Rehm)(王菲等.桃褐腐病的发生与防治.果树花卉.2012年第5期p58)。

实施例1、梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的分离与菌株鉴定

1、样品采集

从中国青海省，采集野果。

2、菌株的分离筛选及拮抗筛选

从有机水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用PDA(含硫酸链霉素)和YPD琼脂(含硫酸链霉素)2种培养基分别在25℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的菌株，在YPD琼脂培养基上纯化保存，并以桃褐腐病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的类酵母菌菌株，命名其为QHL-12-3。

3、菌株的鉴定

对菌株QHL-12-3进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《TheYeasts,aTaxonomicStudy》(Kurtzman,C.P.(1998a).WilliopsisZender.InTheYeasts,aTaxonomicStudy,4thedn,pp.529-920.EditedbyC.P.Kurtzman&J.W.Fell.Amsterdam:Elsevier.)中描述方法进行生理生化测定和分子生物学鉴定。

结果表明，QHL-12-3的形态学特征：菌体营养细胞呈卵形，或近球形，多为单边出芽生殖或少为多边出芽生殖；在PDA和YPD琼脂培养基上，20℃下生长48小时，菌落为奶油状、乳白色不透明，扁平或圆形，边缘整齐，菌落无褶皱，如图2和图3所示。QHL-12-3的生理生化特征：可进行葡萄糖、麦芽糖弱发酵，不可进行棉子糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和海藻糖发酵；碳源同化方面：葡萄糖、山梨糖、蔗糖、麦芽糖、蜜二糖、海藻糖、纤维二糖、木糖、核糖、松三糖、乙醇、葡萄糖醇、丙三醇、甘露醇、核糖醇、水杨酸、氨基葡萄糖、十六烷和可溶性淀粉为阳性，菌粉、乳酸、甲醇、肌醇、乳糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醇、赤藓糖醇、柠檬酸为阴性。所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3于含有5％(质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10％(质量含量)氯化钠的培养基中可生长，于pH4.0-5.5的培养基中均可正常生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在40℃以上不可生长；最佳适宜生长温度为16-20℃，在不含维生素的培养基上不能生长。菌株QHL-12-3的5.8SrDNA、ITS1/ITS2基因序列以及26SrDNAD1/D2基因序列如SEQIDNo.1和No.2所示。通过与现有的梅奇酵母菌属的不同种的模式菌株进行基因比对及进化树分析，结果表明QHL-12-3的26SrDNAD1/D2序列与已知梅奇酵母菌种的26SrDNAD1/D2序列最高相似性为90％。根据酵母菌分类标准，当新发现的酵母菌菌株的26SrDNAD1/D2序列与已知的酵母菌种的26SrDNAD1/D2序列比对，最高相似性低于97％便可定为一个新种。进化树分析结果也表明QHL-12-3被放入单独一分支(见图1)。因此，菌株QHL-12-3为一新种。

实施例2、发明梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3对桃褐腐病菌的抑制效果测定

供试病原菌：

桃褐腐病菌——链核盘菌(Moniliniafructicola(wint.)Rehm)；

选择桃采后褐腐病病菌为指示真菌，采用平板对峙培养法。

具体操作如下：梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3菌株在PDA培养基上28℃恒温培养48h。植物病原真菌在PDA平板上25℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.7cm无菌不锈钢打孔器打制带菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三次重复，25℃恒温培养5-7天，测量病原真菌边缘与梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。

梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3对桃褐腐病菌抑菌圈直径为10mm以上，如图4所示。说明所述梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3具有稳定、高效的抗菌性能。

实施例3梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3对供试的桃褐腐病菌引起的腐烂病的抑制

桃子采摘后，经QHL-12-3菌液(菌液浓度分别为10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml、10⁹cfu/ml)浸泡处理30-60秒，然后室温条件下，风干，最后置于温度为1℃，相对湿度为95％条件下，黑暗贮藏。贮藏21天后，与对照组相比，当菌液浓度为10⁷cfu/ml，其防效为40％，当菌液浓度达到10⁸cfu/ml时，其防效为60％，当菌液浓度达到10⁹cfu/ml时，其防效达65％。

实施例4梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)QHL-12-3的代谢物对供试的桃褐腐病菌引起的腐烂病的抑制

桃子采摘后，经QHL-12-3代谢物浸泡处理30-60秒，然后室温条件下，风干，最后置于温度为1℃，相对湿度为95％条件下，黑暗贮藏。贮藏21天后，与对照组相比，其防效达20％。

Claims (10)

1.一种梅奇酵母菌，其特征在于，所述梅奇酵母菌菌株为QHL-12-3，分类命名为Metschnikowiasp.，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.10463。

2.根据权利要求1所述的梅奇酵母菌，其特征在于，所述梅奇酵母菌的5.8SrDNA、ITS1/ITS2基因序列，26SrDNA基因序列分别为：

5.8SrDNA、ITS1/ITS2基因序列如下：

TGGGTTTAAATTATACATCACTTCTAGGATTAACACTAAATCTAAATCTCAATAACTAATGAAAAAAAAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATAAAAAACGCAGCGAATTGCGATACGTAATATGACTTGCAAACGTGAATCATTGAATTTTTGAACGCACATTGCGCCTTAAGGTATTCCTCAAGGCATGCGTGAATGAGCGATTTTTTCTCTCAAACCTTAGGGTTTGGTCTTGGCCTTTTGCCAAAATATCAACTGATTTTAAAATAAGTTTTAATCTCATCCCCCTTACTTCCTCATTTTCGTAAAACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGAAAA；

26SrDNA基因序列如下：

CGCGCATCCTTGAGATTCGCAGGCCTCGGGATGAGATGGAAGTGGTAGGACAAAGACGGTAAAGCTCCCGAGGGAGTTATATTTCTTGACTTTTTTACTTCCCCTCGCCCCGATGCTGGCCCAACACGAGGTTGTGTCTGCTTGCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAAAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGGAAAACAAAGGGATAAAATGGATTGGGGTTCTTTACGGGGCTATCACCCTCTATGGCGTCATTTTCCAATGAACTTAAAAAGAATCCTTCAAACTCTGTTAACCTTCAAATTACAATTCCCTGAGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGCAAATA。

3.一种病原菌抑制剂，其活性成分为权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物。

4.根据权利要求3所述的病原菌抑制剂，其特征在于，所述病原菌抑制剂对桃采后褐腐病菌有抑制作用。

5.一种病害抑制剂，其活性成分为权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物。

6.根据权利要求5所述的病害抑制剂，其特征在于，所述病害抑制剂对桃采后褐腐病有抑制作用。

7.根据权利要求3所述的病原菌抑制剂或权利要求5所述的病害抑制剂，其特征在于，所述代谢物从梅奇酵母菌QHL-12-3发酵液中获得，具体制备方法为：

将保藏的梅奇酵母菌QHL-12-3从PDA固体斜面接种2-3环至200-250mL的YPD液体培养基中，于20℃-25℃，150-200rpm条件下，恒温振荡培养24h-48h，得到梅奇酵母菌QHL-12-3的发酵液；将培养好的发酵液，分装于离心管中，离心5-10min，上清液即梅奇酵母菌的代谢物。

8.权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物的下述任一应用：

1)权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物在抑制病原菌中的应用；

2)权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物在抑制病害中的应用；

3)权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物在制备抑制病原菌制剂中的应用；

4)权利要求1所述梅奇酵母菌和/或权利要求1所述梅奇酵母菌的代谢物在制备抑制病害制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病原菌为桃采后褐腐病菌，所述病害为桃采后褐腐病；

抑制桃采后褐腐病菌的具体步骤为：桃子采摘后，经QHL-12-3菌液或QHL-12-3的代谢物浸泡处理30-60秒，于室温条件下风干，置于温度为1-4℃，相对湿度为95％条件下，黑暗贮藏。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述桃采后褐腐病菌为Moniliniafructicola、Monilinialaxa或Moniliniafructigena。