CN108546651B - 红树植物秋茄内生真菌2cpe-1及其发酵液与应用 - Google Patents

红树植物秋茄内生真菌2cpe-1及其发酵液与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株红树植物秋茄内生真菌2cpe‑1及其发酵液与应用，该红树植物秋茄内生真菌2cpe‑1，保藏编号为CGMCC No.15388；于2018年02月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；旨在提供一种对红树植物秋茄内生真菌2cpe‑1及其发酵液，其对植物病原真菌小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)的菌丝生长具有较为明显的抑制作用的菌种，可作为抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然活性物；属于微生物技术领域。

Description

红树植物秋茄内生真菌2cpe-1及其发酵液与应用
技术领域
本发明公开了一种树植物秋茄内生真菌2cpe-1，本发明还公开了树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
植物病原菌主要以化学防治为主，由于化学农药的长期应用和不当使用，造成了有害生物抗药性增强、新病害不断出现、环境污染日趋严重、农药残留严重超标等现象，严重威胁着人类健康与生存环境，迫切需要开发新的农药。
秋茄(Kandelia candel)为红树科(Rhizophoraceae)秋茄属植物，是一种生长在热带和亚热带沿海潮间带上部至潮下带浅水沼泽地中的盐生植物。民间有较为悠久的药用历史，近年研究显示秋茄果实、枝皮、根和叶等的提取物具有抗菌、抗肿瘤，治疗胃溃疡以及风湿性关节炎等作用。根据植物内生真菌内共生理论推断，秋茄中很有可能存在特殊的内生真菌，其在高盐、高压、低温、低照等特殊的生存环境，能够产生特殊的具有抗菌活性的天然成分,且生长旺盛、繁殖快，可以在实验室大量培养，发酵产物比高等生物所含的物质更易提纯，为新型“绿色”农药提供物质基础和理论依据。目前，国内外对红树植物秋茄内生真菌对植物病原菌抑菌活性的研究报道较少。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种红树植物秋茄内生真菌2cpe-1及其发酵液，其对植物病原真菌小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)的菌丝生长具有较为明显的抑制作用。
为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一株红树植物秋茄内生真菌2cpe-1，保藏编号为CGMCC No.15388；于2018年02月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。分类命名为青霉属(Penicillium sp.)
本发明提供的第二个技术方案为：
一种红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，通过下述步骤依次制得的：
(1)菌种活化
在无菌条件下，用接种环挑取少许的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温培养5天，培养温度28℃±1℃，得到活化菌种；
(2)种子培养
无菌条件下，接种环挑取步骤(1)活化菌种，接种至已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基内，在28℃±1℃恒温摇床培养4-6天，得到摇床种子；
(3)发酵培养
无菌条件下，将摇床种子接种到装有已灭菌的液体培养基中，接种量5％，在温度28℃±1℃恒温培养10天后，培养液过滤除去菌丝体，得到红树林内生真菌2cpe-1发酵液。
进一步的，上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，人工海水1000mL。
进一步的，上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，所述马铃薯葡萄糖液体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，人工海水1000mL。
进一步的，上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，所述液体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，人工海水1000mL，pH 7.0-7.2。
进一步的，上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，所述的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，马铃薯葡萄糖液体培养基，液体培养基的灭菌是在温度121℃、压力0.1MPa下，灭菌30min。
进一步的，上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，所述的摇床转速160转/分。
本发明提供的第三个技术方案是这样的：
上述红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液在抑制小麦赤霉病菌方面的应用。
上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液在抑制大豆疫霉病菌方面的应用。
上述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液在抑制香蕉炭疽病菌方面的应用
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
本发明通过发明人经过大量实验研究，从中国广东省阳江红光村红树林保护区的秋茄叶子中分离得到青霉属真菌Penicillium sp.2cpe-1，并且将该真菌进一步制成为发酵液，通过抗菌实验发现该菌对供试的3种植物病原真菌小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)的菌丝生长具有较为明显的抑制作用。
本发明提供的技术方案以植物内生真菌作为资源，可作为抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然活性物；具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明。
实施例1
本发明提供的一株红树植物秋茄内生真菌2cpe-1，保藏编号为CGMCC No.15388；于2018年02月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。分类命名为青霉属(Penicillium sp.)。
其系从中国广东省阳江红光村红树林保护区的秋茄叶子中分离得到。
具体分离方法如下：
采集的红树林植物秋茄无虫洞、枯萎的叶子样品自来水多次冲洗除去表面泥土后，用无菌水清洗3次，用75％乙醇进行表面消毒，将新鲜叶依次用次氯酸钠(含5％有效氯量)浸泡1min，无菌水清洗3次，75％酒精浸泡3min，无菌水清洗3次，晾干。表面消毒后的样品使用无菌的手术刀将叶片切成0.5cm×0.5cm的小片，接入含120ug/mL硫酸链霉素和150ug/mL青霉素钾的PDA分离培养基上，每个平板放置4块，平行2个平板，然后倒置放入28℃培养箱中培养3～7d。在组织块切口处用接种环挑取长出的新菌丝，及时转接到新鲜的PDA平板上培养，待菌落长出后，根据菌落颜色、形态的不同以及生长时间的差异，分别用接种环挑取各菌落边缘新长出的菌丝转接至PDA纯化培养基平板上再次培养，反复纯化培养数天后，观察并记录菌落形态的变化，获得纯化的菌株2cep-1。将菌株2cep-1进行再次培养，转入PDA固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养5～7d，然后放入4℃冰箱中保存。
红树植物秋茄真菌与Genbank数据库已知序列比对后，通过MEGAS.0软件构建系统发育树该菌为青霉属，故命名为青霉素2cep-1(Penicillium sp.2cpe-1)，菌株ITS基因序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2
本发明提供的一种红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，具体由下述步骤制得的：
(1)菌种活化
在无菌条件下，用接种环挑取少许保藏的红树林内生真菌的菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温培养5天，培养温度28℃±1℃，得到活化菌种；
所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，人工海水1000mL；(人工海水即粗制海盐30g溶解在1000mL水)
(2)种子培养
无菌条件下，利用接种环挑取3环活化菌种，接种于50ml已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基内，恒温摇床培养5天，摇床转速160转/分，温度28℃±1℃，得到摇床种子。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基中各个组分及其含量为：：马铃薯200克，葡萄糖20克，人工海水1000mL；
(3)发酵培养
将摇床种子接种到装有100ml已灭菌的液体培养基中，接种量5％，摇床转速160转/分，温度28℃±1℃，培养10天后，培养液过滤除去菌丝体，得到红树林内生真菌2cpe-1发酵液。
所述液体培养基中各个组分及其含量为：：马铃薯200克，葡萄糖20克，人工海水1000mL，pH 7.0-7.2。
发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量白色的细丝，培养第3天，出现绿色的小菌丝球，培养第5天，绿色菌丝小球继续增多，并且体积变大，发酵液为灰黄色；培养第10天，出现大量绿色的菌丝球，体积也变大，发酵液为灰黄色；红树林内生真菌发酵液为灰黄色。
其中：步骤(1)至步骤(3)所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，马铃薯葡萄糖液体培养基，液体培养基的灭菌是在温度121℃、压力0.1MPa下，灭菌30min。
实施例3
本发明提供的红树植物秋茄内生真菌(Penicillium sp.)2cpe-1发酵液的抗菌试验如下。
1、植物病原真菌：
植物病原真菌小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)
2、病原微生物的培养
用接种环挑取少量病原菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在(28±1)℃恒温箱中培养5天。
3、抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性
在100毫升的无菌三角瓶中配制含有发酵液经树脂吸附后甲醇洗脱物的无菌混合培养基(最终浓度为250mg/L和500mg/L)，及含菌丝体甲醇提取物的无菌混合培养基(最终浓度为250mg/L和500mg/L)。
在100毫升的无菌三角瓶中配制最终浓度为250mg/L和500mg/L红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，具体方法为：红树植物秋茄内生真菌(Penicillium sp.)2cpe-1发酵液经树脂吸附后甲醇洗脱，浓缩干燥后，DMSO溶解，过0.22微米过滤器，配制成0.5mg/mL和0.25mg/mL溶液备用。
在100毫升的无菌三角瓶中配制最终浓度为250mg/L和500mg/L红树植物秋茄内生真菌，具体方法为：红树植物秋茄内生真菌(Penicillium sp.)2cpe-1菌丝体用甲醇提取浓缩干燥后，用DMSO溶解，过0.22微米过滤器，配制成0.5mg/mL和0.25mg/mL溶液备用。
在分别各取15毫升置于直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入1个供试病原菌菌饼(直径为6毫米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养96小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：其结果见表1：
Figure BDA0001639654520000051
表1、本发明所述的菌株2cpe-1发酵产物对三种植物病原真菌的抗菌结果
Figure BDA0001639654520000052
由上表1可见，本发明制备所得到的红树植物秋茄内生青霉菌Penicilliumsp.2cpe-1发酵物对供试植物病原真菌具有较好的抗菌活性。青霉菌2cpe-1发酵原液经树脂吸附后甲醇洗脱物在浓度为250mg/L时对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的菌丝生长抑制率为35.76％，在浓度为500mg/L时对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的菌丝生长抑制率超过60.26％。对大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)的菌丝生长也具有一定的抑制作用。青霉菌2cpe-1菌丝甲醇提取物对供试植物病原真菌也有较强的抑菌活性，在浓度为500mg/L时对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的菌丝生长抑制率超过30.21％，对大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)的菌丝生长也具有一定的抑制作用。因此，本发明制备所得到的红树植物秋茄内生青霉菌2cep-1发酵物对供试植物病原真菌具有明显的抑菌活性，可以将其选作内生真菌资源，通过发酵制备，以求获得抗植物病原真菌病害的新型农用活性的天然成分。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东立威化工有限公司
广东工业大学
<120> 红树植物秋茄内生真菌2cpe-1及其发酵液与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 610
<212> DNA/RNA
<213> Rhizophora mangle
<400> 1
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacagtattc ttttgccagc gcttaactgc 60
gcggcgaaaa accttacaca cagtgtcttt ttgatacaga actcttgctt tggtttggcc 120
tagagatagg ttgggccaga ggtttaacaa aacacaattt aattattttt acagttagtc 180
aaattttgaa ttaatcttca aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga 240
agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatatg aattgcagat tttcgtgaat catcgaatct 300
ttgaacgcac attgcgccct ctggtattcc agagggcatg cctgtttgag cgtcatttct 360
ctctcaaacc cccgggtttg gtattgagtg atactcttag tcggactagg cgtttgcttg 420
aaaagtattg gcatgggtag tactagatag tgctgtcgac ctctcaatgt attaggttta 480
tccaactcgt tgaatggtgt ggcgggatat ttctggtatt gttggcccgg ccttacaaca 540
accaaacaag tttgacctca aatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag catatcaata 600
agcggaggaa 610

Claims (7)

1.一株红树植物秋茄内生真菌（ Penicillium sp. ） 2cpe-1，保藏编号为CGMCCNo.15388；于2018年02月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，其特征在于，通过下述步骤依次制得的：
（1）菌种活化
在无菌条件下，用接种环挑取少许权利要求1所述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温培养5天，培养温度28℃±1℃，得到活化菌种；
（2）种子培养
无菌条件下，接种环挑取步骤（1）活化菌种，接种至已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基内，在28℃±1℃恒温摇床培养4-6天，得到摇床种子；
（3）发酵培养
无菌条件下，将摇床种子接种到装有已灭菌的液体培养基中，接种量5%，在温度28℃±1℃恒温培养10天后，培养液过滤除去菌丝体，得到红树林内生真菌2cpe-1发酵液；
步骤（1）所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，30%人工海水1000mL；
步骤（2）所述马铃薯葡萄糖液体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，30%人工海水1000mL；
步骤（3）所述液体培养基中各个组分及其含量为：马铃薯200克，葡萄糖20克，30%人工海水1000mL，pH7.0-7.2。
3.根据权利要求2所述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，其特征在于，步骤（1）所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，步骤（2）所述的 马铃薯葡萄糖液体培养基，以及步骤（3）所述的液体培养基的灭菌均是在温度121℃、压力0.1MPa下，灭菌30min。
4.根据权利要求2所述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液，其特征在于，所述的摇床转速160转/分。
5.权利要求2所述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液在抑制小麦赤霉病菌方面的应用。
6.权利要求2所述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液在抑制大豆疫霉病菌方面的应用。
7.权利要求2所述的红树植物秋茄内生真菌2cpe-1发酵液在抑制香蕉炭疽病菌方面的应用。
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