CN113278542B - 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌pjb25及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物病害生物防治技术领域，涉及一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)PJB25及其应用。本发明从健康花生中分离筛选获得一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25，安全无毒性，该菌株于2020年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61053。该菌株对进境检疫性有害生物花生黑腐病菌抑菌作用强，能够显著减轻花生黑腐病的发生；同时对包括花生根腐病、花生纹枯病、花生茎腐病、花生炭疽病等威胁花生等作物生产的重要真菌病害均具有抑制作用，抑菌谱广，为植物真菌病害的生物防治提供了新的选择。本申请的内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25可用于具有良好开发应用前景的广谱性微生物菌剂/菌肥，对植物病害的绿色防控具有重要意义。

Description

一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25及其应用。

背景技术

植物受到生物或非生物因子的影响，发生形态、生理生化等方面的病理变化，造成植物病害，从而阻碍其正常生长、发育，进而影响经济效益。常见的植物病害防治方法包括化学防治、物理防治、生物防治、抗病育种等。随着国内对可持续农业及环保的重视，生物防治手段越来越多的被用于植物病虫害防控中。植物病害的生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治，其中利用生防菌对植物病害进行生物防治是当前研究的热点。

花生是重要的油料作物和经济作物，中国是世界上最大的花生生产国和消费国，花生种植业的健康发展对保障我国食用油供应、食品安全等具有重要意义。花生病害的逐年加重严重制约我国花生产业的健康发展。其中花生黑腐病、花生纹枯病、花生炭疽病等真菌性病害对花生及多种作物均造成严重的威胁。

花生黑腐病为典型的种传病害和土传病害，防治十分困难。目前，生产中以化学药剂防控为主，但杀菌剂利用带来残留引发环境的不安全，及可能增加病原菌抗药性风险的产生。花生黑腐病菌(Calonectria ilicicola)已列为我国禁止进境植物检疫性病原菌和广东省农业植物检疫性有害生物，被评估为高风险性有害生物(潘汝谦,徐大高,邓铭光,纪春艳.外来入侵花生黑腐病菌在中国的风险性评估[J].中国农业科学,2012,45(15):3068-3074.)，已经严重威胁到我国花生、大豆等作物的健康生产和品质。有益微生物的研究和利用已愈发受到重视，研发低毒、环境友好的生物源菌肥/菌剂对花生产业的健康发展及病害防控尤显重要。目前，有关花生黑腐病生物防治的相关研究尚未见报道。

植物内生菌(Endophyte)指在健康植物组织和器官内部微环境中生活并不引起明显病害症状的微生物。内生菌在寄主植物体内完成其全部或部分阶段的生活史，与寄主协同进化，相互关系密切(杨镇,曹君.植物内生菌及其刺激代谢产物的研究进展[J].微生物学杂志..2016,36(4):1-6)。内生菌可以作为外源基因载体、能够促进植物健康生长、诱导植物抗性产生等功能而被广泛利用。植物内生菌因其来源于植物体内，具有受环境影响小、易转化定殖及安全友好等优点，能够更好地发挥其潜在菌肥/菌剂的生防效果而倍受关注。

中国发明专利CN105018371A公开了一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)菌株Fse32，该菌株对水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、车前草核盘病菌(Sclerotiniascleroliorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia libertiana)、芝麻枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、辣椒根腐病菌(Phytophthora capsici)6种植物病原菌均具有抑菌作用，但是其抑制率为30.6％～41.5％，其中对水稻纹枯病菌的抑制率仅为30.6％，抑菌效果有待提高，而且菌株作为纯培养体，个体的特异性比较强，受环境的影响较大。不断挖掘、探索新的、防治效果更好的植物病害生防菌十分必要并且重要，从而丰富生防菌库，为病害防控提供新资源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中植物真菌病害防治的不足，提供一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25。该PJB25菌株分离自健康花生植株，对植物真菌病害病原菌具有显著的抑制作用。

本发明的目的在于提供一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25。

本发明的目的还在于提供内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在防治植物真菌病害方面的应用，尤其是在防治花生真菌病害方面的应用。

本发明的目的还在于提供内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在制备防治植物真菌病害生物制剂方面的应用。

本发明的目的还在于提供一种含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25生物制剂。

利用含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25生物制剂防治植物真菌病害的方法也在本发明保护范围之内。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)PJB25，已于2020年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61053，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

该菌株从采集自广东省广州市华南农业大学跃进北教学科研实践基地花生种植区健康花生植株样本，经分离纯化筛选获得。该菌株的16S rRNA的核苷酸序列长度为1426bp，经NCBI中BLAST比对，该菌株与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)同源性为99.80％，根据16S rRNA序列构建的系统进化树，鉴定其为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，命名为Burkholderia gladioli PJB25。

本发明实验结果表明，内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25对花生黑腐病菌的菌丝生长有很强的抑菌作用，能够显著减轻花生黑腐病的症状发生；同时对花生根腐病菌(Fusarium solani)，花生纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，花生茎腐病菌(Lasiodiplodiatheobromae)，花生炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)及花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii)也具有很强的抑制作用，抑制率在34.50～99.07％之间。该内生菌株PJB25对花生真菌病害的防治不仅效果佳，而且抑菌谱广，在防治植物真菌病害方面具有巨大的应用价值及潜力。因此，以下所述应用均在本发明保护范围之内。

所述内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在防治植物真菌病害方面的应用。

所述内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在防治花生真菌病害方面的应用。

所述内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在制备防治植物真菌病害生物制剂方面的应用。

所述内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在制备防治花生真菌病害生物制剂方面的应用。

优选地，所述植物真菌为花生黑腐病菌、花生根腐病菌、花生纹枯病菌、花生茎腐病菌、花生炭疽病菌及花生白绢病菌。

一种含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25的生物制剂也在本发明保护范围之内。

优选地，所述生物制剂包含内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25菌体和/或菌液。

作为一种具体的方式，一种含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25的生物制剂是将内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25菌株接种于液体培养基中培养获得。

更具体地，将内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25接种于pH 7.0的LB液体培养基中，32℃、200rpm条件下培养36h制备获得。

一种利用含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25的生物制剂防治植物真菌病害的方法，所述方法是利用内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25防治植物真菌病害。

优选地，所述内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25为其菌体和/或菌液。

优选地，所述植物为花生。

作为一种具体的方法，一种利用含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25的生物制剂防治植物真菌病害的方法，是将含有内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25的生物制剂通过灌根的方式接种于植物以防治植物真菌病害。

相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的内生唐菖蒲伯克霍尔德菌PJB25生物制剂抑菌谱广泛，对危害花生生产中的黑腐病菌等多种重要的植物病原真菌均具有抑菌活性，是具有良好开发应用前景的广谱性微生物菌剂/菌肥，对花生病害的绿色防控具有重要意义。

2.本发明内生唐菖蒲伯克霍尔德菌PJB25生物制剂培养条件简单，繁殖速度快，易于保存和运输。

3.本发明内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)PJB25，是从健康花生植株内分离、纯化获得，其本身安全无毒性，对环境友好。

附图说明

图1为本发明内生菌PJB25对花生黑腐病菌的抑菌效果，图1-A:花生黑腐病菌菌落；图1-B:内生菌PJB25抑制花生黑腐病菌的菌丝生长。

图2为本发明基于内生菌PJB25的16S rDNA基因序列构建的系统发育树。

图3为本发明内生菌PJB25对峙花生根腐病菌的抑菌效果，图3-A:花生根腐病菌菌落；图3-B:内生菌PJB25抑制花生根腐病菌的菌丝生长。

图4为本发明内生菌PJB25对峙花生纹枯病菌的抑菌效果，图4-A:花生纹枯病菌菌落；图4-B:内生菌PJB25抑制花生纹枯病菌的菌丝生长。

图5为本发明内生菌PJB25对峙花生茎腐病菌的抑菌效果，图5-A:花生纹茎腐菌菌落；图5-B:内生菌PJB25抑制花生茎腐病菌的菌丝生长。

图6为本发明内生菌PJB25对峙花生炭疽病菌的抑菌效果，图6-A:花生炭疽病菌菌落；图6-B:内生菌PJB25抑制花生炭疽病菌的菌丝生长。

图7为本发明内生菌PJB25对峙花生白绢病菌的抑菌效果，图7-A:花生白绢病菌菌落；图7-B:内生菌PJB25抑制花生白绢病菌的菌丝生长。

图8为本发明盆栽试验中内生菌PJB25对花生黑腐病的生测效果，8-A：内生菌PJB25处理对花生黑腐病症状发生的减缓效果(整株)，8-A1：PJB25+P(PJB25处理花生植株3d后接种花生黑腐病菌)；8-A2：LB培养液+P(LB处理花生植株3d后接种花生黑腐病菌)；8-B：内生菌PJB25处理对花生黑腐病症状发生的减缓效果(根部)，8-B1：PJB25+P(PJB25处理花生植株3d后接种花生黑腐病菌)；8-B2：LB培养液+P(LB处理花生植株3d后接种花生黑腐病菌)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25的分离纯化、制备及对花生黑腐病菌的抑菌活性测定

1.1培养基配制

NA培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，琼脂粉20g，加水定容至1L；121℃湿热灭菌20min备用。

NB培养液：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，加水定容至1L；121℃湿热灭菌20min备用。

LB培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母提取物5g，琼脂粉20g，加水定容至1L。121℃湿热灭菌20min备用。

PDA培养基：将马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤。加入葡萄糖20g，加水至1000mL，搅拌混匀，加入琼脂15g，充分加热溶解后分装至三角瓶中，121℃湿热灭菌20min，保存备用。

1.2内生细菌PJB25的分离、纯化及制备

于广东省广州市华南农业大学跃进北教学科研实践基地花生种植区里，选取健康花生植株带回实验室，称取1g花生植株的茎基部和根部组织，切成适合小段，75％酒精浸泡1min，再用3％次氯酸钠浸泡2min，无菌水冲洗5次。将冲洗干净的植物组织移入无菌研钵，加入5mL无菌水充分研磨，在NA平板上涂布100μL研磨液，NA平板上涂布最后一次无菌水洗涤液作为空白对照，每个样本重复3次。培养皿28℃恒温黑暗培养至平板上长出菌落(空白对照无菌落生长)，挑取NA平板上的单菌落采用平板划线法在LB培养基平板上进一步纯化获得内生细菌菌株PJB25，保存待用。

内生细菌菌株PJB25经液体发酵制备获得其生物制剂，具体为：将内生细菌菌株PJB25在200rpm，32℃，pH 7.0的LB培养液中培养36h即获得其生物制剂菌液。

1.3内生细菌PJB25对花生黑腐病菌的抑菌活性测定

供试靶标菌株：花生黑腐病菌(Calonectria ilicicola)菌株GDMZ6，由华南农业大学植物病理学系杀菌剂研究室提供。

以花生黑腐病菌为靶标，采用平板对峙法进行内生细菌PJB25抑菌活性的测定。

将内生细菌PJB25接种到LB培养液中，200rpm、32℃振荡培养36h获得生物制剂菌液。将花生黑腐病菌菌饼(d＝7mm)接种至PDA培养基平板的中心。采用打孔法进行接种，按十字交叉位置在距离花生黑腐病菌菌饼20mm的等距离四角处打4个孔(d＝7mm)，用少量琼脂封孔底。取100μL内生细菌PJB25生物制剂菌液至4个孔中，进行对峙培养观察并测定。以PDA培养基平板中心只接种花生黑腐病菌、4个孔中接种LB培养液为空白对照。28℃黑暗培养，三次生物学重复。待对照中的菌落长至超过2/3皿，用十字交叉法测定两孔间花生黑腐病菌的面积，计算内生细菌PJB25对花生黑腐病菌的抑制率。

内生菌PJB25对花生黑腐病菌的抑菌效果如图1。结果表明，内生细菌PJB25对花生黑腐病菌的菌丝生长抑制作用强，抑制率为67.13％。PJB25在平板上生长蔓延快速，能够抑制靶标菌的菌丝生长，与PJB25菌苔接触的花生黑腐病菌菌落边缘的菌丝生长十分稀疏，具有明显的溶菌现象。

实施例2内生细菌PJB25的分子鉴定

2.1培养基配制

培养基配制同实施例1中1.1。

2.2内生细菌PJB25的分子鉴定

以内生细菌PJB25菌液为模板，利用细菌基因组试剂盒提取细菌基因组DNA，16SrRNA基因通用引物fD2/rP1进行PCR扩增。

引物序列：fD2(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和rP1(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

将扩增获得的16S rRNA目的基因片段纯化后连接到pMD19-T载体，转化于Escherichia coli DH5α，取阳性克隆委托华大基因进行测序，在NCBI进行序列比对，并利用MEGA5构建系统发育树。基于内生菌PJB25的16S rDNA基因序列构建的系统发育树如图2。

结果表明：内生细菌PJB25经PCR扩增获得的16S rRNA，经NCBI比对，与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)的同源性最高，为99.80％。内生细菌PJB25鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)，该唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25已于2020年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61053，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例3内生细菌PJB25抑菌谱测定

3.1培养基的配制

培养基配制同实施例1中1.1。

3.2供试菌株

选择生产中为害花生/大豆根茎部生长的5种重要病原真菌为内生细菌PJB25抑菌谱测定的供试菌株，包括：花生根腐病菌(Fusarium solani)，花生纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、花生茎腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)、花生炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)及花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii)，由华南农业大学植物病理学系杀菌剂研究室提供。

3.3利用平板对峙法进行抑菌谱测定

方法同实施例1中1.3。

内生菌PJB25对花生根腐病菌、花生纹枯病菌、花生茎腐病菌、花生炭疽病菌、花生白绢病菌的抑菌效果如图3～7。抑菌谱测定结果表明：内生细菌PJB25生物制剂不仅抑菌作用强，抑菌谱广泛，对5种供试病菌：花生根腐病菌，花生纹枯病菌、花生茎腐病菌、花生炭疽病菌及花生白绢病菌的菌丝生长的均有很强的抑制，与内生菌PJB25接触的5种病原真菌菌落边缘的菌丝生长稀疏或停止生长，如花生根腐病菌的菌丝生长完全被内生菌PJB25抑制，溶菌现象显著，内生菌PJB25对花生根腐病菌、花生纹枯病菌、花生茎腐病菌、花生炭疽病菌及花生白绢病菌菌丝生长的抑制率分别为99.07％、53.98％、43.34％、36.36％和34.50％。

实施例4花生内生细菌PJB25的盆栽防效测定

4.1培养基配制

培养基配制同实施例1中1.1。

4.2内生细菌PJB25的盆栽防效测定

植物材料花生品种：天府3号，购自宏润种业公司。

将内生细菌PJB25接种至LB培养液，200rpm、32℃摇菌36h备用。选择健康/长势一致的花生苗进行接种，处理组(PJB25+P)预先灌根接种内生细菌PJB25生物制剂菌液(接种浓度为1×108CFU/mL)，3d后拌土接种花生黑腐病菌菌饼。以预先灌根接种LB培养液，3d后拌土接种花生黑腐病菌菌饼的花生苗为对照组(LB+P)。每组8株花生苗，3次生物学重复。内生细菌PJB25预先接种处理后，病原菌挑战接种当日记为0d，在挑战接种后7d进行花生黑腐病的病情调查，计算病情指数和相对防治效果。

盆栽试验中内生菌PJB25对花生黑腐病的生测效果如图8。盆栽试验结果表明，病原菌处理对照组(W+P)的花生植株萎蔫干枯，根系及茎基部严重变黑腐烂，根系不发达，发病严重，病情指数为87.60；内生细菌PJB25预处理而后拌土接种花生黑腐病菌的处理组(PJB25+P)的花生植株生长良好，新叶抽发较多，根系及茎基部健康，根系较发达，仅少数植株出现轻度萎蔫，茎基部轻微变黑，发病轻，病情指数为36.74，相对防效为58％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)PJB25，其特征在于，已于2020年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61053，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.权利要求1所述的内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在防治植物真菌病害方面的应用，其特征在于，所述植物真菌为花生黑腐病菌Calonectria ilicicola、花生根腐病菌Fusarium solani、花生纹枯病菌Rhizoctonia solani、花生茎腐病菌Lasiodiplodiatheobromae、花生炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides及花生白绢病菌Sclerotiumrolfsii。

3.权利要求1所述的内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25在制备防治植物真菌病害生物制剂方面的应用，其特征在于，所述植物真菌为花生黑腐病菌Calonectria ilicicola、花生根腐病菌Fusarium solani、花生纹枯病菌Rhizoctonia solani、花生茎腐病菌Lasiodiplodia theobromae、花生炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides及花生白绢病菌Sclerotium rolfsii。

4.一种生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌PJB25。

5.一种利用权利要求4所述生物制剂防治植物真菌病害的方法，其特征在于，所述植物真菌为花生黑腐病菌Calonectria ilicicola、花生根腐病菌Fusarium solani、花生纹枯病菌Rhizoctonia solani、花生茎腐病菌Lasiodiplodia theobromae、花生炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides及花生白绢病菌Sclerotium rolfsii。

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