CN105018371A - 一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32及其应用 - Google Patents
一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32及其应用，其分类命名为唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia？gladioli)Fse32，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC？NO:M？2014672，保藏日期：2014年12月28日。本发明菌株能显著促进植物生长并且对多种植物病原真菌有拮抗活性。利用该菌接种水稻苗30d后植株干重比对照增加107.04％，株高增加5.38％，根长增加14.02％，叶绿素含量增加68.78％。该菌株具有分泌生长素等促进植物生长的作用和拮抗多种植物病原菌的活性，可应用于促进植物生长及抑制植物病害微生物菌剂和生物有机肥的生产中。
Description
技术领域
本发明涉及植物的内生细菌，具体涉及一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32及其应用。
背景技术
植物内生细菌是指存在植物体内对植物未见危害的一类细菌，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系。植物内生细菌作为一种新的微生物资源，因其能够系统的分布于植物体内，有充足养分如氮源和碳源，具有良好的生存环境，同时能克服以往从根围促生细菌中筛选生防菌的定殖差，受环境影响大的缺点，所以更能发挥其生防效果，在生物防治、生物降解及促进植物生长有着良好的应用前景。专利(ZL 201110 082094.8)报道一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)NSM-05，该菌抑菌谱广，对多种林木和农作物病原菌具有拮抗作用，其中对松枯梢病菌抑菌作用强，具有良好的开发应用前景。专利(ZL 201210241051.4)报道魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7，用于大田防治魔芋细菌性软腐病和十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中。专利(201210010289.6)发明了一株甘蔗内生泛菌属细菌Pantoea sp.NN08200，该菌具有联合固氮、分泌生长素等促植物生长的作用，可应用于生产具有促生或抑制植物病害的固氮微生物菌剂和生物有机肥。
植物促生和增强宿主抗病的内生细菌种类繁多，包括泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)等多个种属，它们可能是植物病原体，如洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)，也可能对植物生长有利，如成团泛菌。伯克霍尔德氏菌属的细 菌是广泛分布于土壤和根际的生物体，传统上它们是已知的植物病原体，一些伯克霍尔德氏菌物种已经发展与其植物宿主有益的相互作用，还发现一些伯克霍尔德氏菌物种是可能的人病原体，还发现一些伯克霍尔德氏菌物种具有作为生物控制产品的潜力。本发明中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)属于伯克霍尔德氏菌属，可通过产生壳多糖酶等酶类或挥发性有机化合物起到拮抗病原菌的作用、产吲哚乙酸及溶磷等促生活性物质有着生防功能，产生酯酶可催化3-羟基异丁酸甲酯的水解拆分，提高其(R)-对映选择性，在工业生产上有着良好的应用前景。因此，从东乡野生稻中分离筛选具有促进水稻生长及拈抗病原真菌的内生细菌，回接定殖于宿主植物，为农业上水稻生产上实现节肥减耗、加强水稻生态系统的良性循环提供科学基础和技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32，以实现用其对植物病原菌进行生物防治和促进水稻秧苗的生长。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一株东乡野生稻内生细菌，其分类命名为唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）Fse32，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC NO: M 2014672，保藏日期：2014 年12月28日，保藏地址为中国武汉大学。
唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32菌株，是从东乡野生稻健康种子内分离筛选获得的对多种植物病原真菌具有良好拮抗活性和促进生长的内生细菌，该内生细菌来源于水稻成熟种子，在水稻秧苗体内能很好的定殖，对植物安全无毒，还具有如下性质：
1、形态特征
在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落呈圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，菌落扁平，乳白色，不透明，呈粘稠状；菌体短杆状、无芽胞、革兰阴性细菌、好氧、氧化酶试验阳性、明胶液化阳性、能利用甘露醇和阿拉伯糖。
2、16S rDNA分析
测得16SrDNA序列1390bp，基因序列在GenBank中登录号为KJ733884，具体如SEQ ID No.1所示。16SrDNA序列通过BLAST比对，在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列与Fse32菌株相似性最高的是唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)，同源性达到99％，结合Fse32菌株形态和培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列系统发育分析结果，鉴定其为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，命名为Burkholderia gladioli strain Fse32。
上述东乡野生稻内生细菌在水稻纹枯病生物防治中的应用。唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32对水稻纹枯病菌(Rhizoctorzia solani)具有强烈的抑菌作用。
上述东乡野生稻内生细菌在促进水稻秧苗生长中的应用。唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32对水稻纹枯病菌(Rhizoctorzia solani)生防作用效果好，同时上述唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32对水稻秧苗还具有促进生长作用。
上述东乡野生稻内生细菌在抑制农作物病原菌中的应用，即唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32对6种农作物病原菌：水稻纹枯病菌(Rhizoctorzia solani)、小麦赤霉病菌(Fusariumt graminearumt)、车前草核盘病菌(Sclerotinia scleroliorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia libertiana)、芝麻枯萎病菌(Fusarium in sesame wilt)、辣椒根腐病菌(Phytophthora capsici)具有抑菌作用，可应用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、车前草核盘病、油菜菌核病、芝麻枯萎病、辣椒根腐病。
有益效果：本发明提供的一种唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)Fse32，是一种东乡野生稻内生细菌，对水稻纹枯病菌抑菌作用强。对水稻秧苗还具有促进生长作用。并且对多种农作物病原菌具有抑菌作用，具有非常广泛的抑菌谱。培养条件简单，易于保存和生产，在水稻秧苗体内定殖能力强，在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，特别是对水稻纹枯病菌的防治具有重要的意义，是一种具有良好开发应用前景的广谱型杀菌剂。
附图说明：
图1是唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32系统发育树分析；
图2是唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32分泌IAA特性的比色反应；
图3是唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32菌株对水稻纹枯病菌的拮抗作用。其中，A图是水稻纹枯病菌对照(CK)，B图是唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32菌株；
图4是接种唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32对水稻幼苗生长的室外促进试验。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行细说明。
实施例1 本发明菌株的分离
取东乡野生稻成熟种子，在超净工作台上先用75％乙醇3min，无菌水冲洗3次，再用3％次氯酸钠浸2min，75％乙醇浸30s，无菌水洗5次。称取2g表面灭菌的种子浸于10mL磷酸盐缓冲液在无菌的研钵中研碎后静置5min，取上清液用无菌水做10倍系列稀释，分别取原液和稀释液100μL铺在培养基(牛肉膏50g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0)平板上。在28℃恒温培养2－3d后，将不同大小、颜色及形态的菌落挑取至纯化培养基上进行划线纯化，将纯化好的菌 株利用甘油保藏法将纯化好的菌落置于超低温冰箱中备用。
实施例2 本发明菌株Fse32的16S rDNA克隆分析
PCR扩增模板的制备：将菌株Fse32活化后接种到LB液体培养基(成分为胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，培养20h后离心收集菌体备用。采用OMEGA细菌基因组提取试剂盒，按产品说明书从新鲜的细菌LB培养物中提取本发明菌株的基因组DNA，保存于-20℃，DNA含量约为50-100ng/μL。
菌株的16SrDNA序列分析：利用细菌16SrDNA通用引27F(AGAGTTTGATCCTGGCTC AG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增细菌的16SrRNA基因。PCR反应程序为：94℃5min预变性，然后94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物回收以后克隆到T载体上，送至北京六合华大基因公司进行测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。
16SrDNA序列分析结果表明本发明菌株与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)同源性达到99％，见图1。综合菌株的菌落形态、生理生化指标及16S rDNA序列分析，将本发明菌株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)细菌。
实施例3 Salkowski比色法测定Fse32菌株分泌IAA的能力
配制S2比色液：将4.5g FeCl3溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入587.4mL 98％H2SO4，待冷却后定容至1L，测定IAA范围5～200mg/L。
将Fse32菌株接种在LB液体培养基中培养16h(28℃、120r/min)后， 用无菌水调节OD600值为0.05，取Fse32菌悬浮液100μL分别接到不含色氨酸的King培养液(成分为蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，蒸馏水100mL，pH 7.0)和含有100mg/L色氨酸的King培养液中，重复4次，以加100μL无菌水的培养液为空白对照，一起置于28℃、转速为120r/min的控温振荡器中培养4d。分别取Fse32菌悬液和空白对照50μL各加入50μL S2比色液，置室温下静置，15min内观察其颜色变化，4个重复均变红为阳性，表示能分泌IAA，颜色越深表示分泌数量多；4个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA。
测定结果见图2，表明Fse32菌株能分泌IAA。
实施例4 菌株Fse32对多种植物病原真菌的拮抗作用
采用平板对峙法，在PDA平板一端接种病原菌菌饼，在平板对称另一端用接种环沾取培养48h的本发明菌株进行点接，正放于28℃培养，以仅接种病原菌的平板为对照，重复3次。待对照长满全皿时测量病原菌菌落生长直径，计算本发明菌株对病原菌生长的抑制率。图3为菌株Fse32对水稻纹枯病菌的拮抗作用效果图。
试验结果表明，本发明菌株Fse32对水稻纹枯病菌(Rhizoctorzia solani)、小麦赤霉病菌(Fusariumt graminearumt)、车前草核盘病菌(Sclerotinia scleroliorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia libertiana)、芝麻枯萎病菌(Fusarium in sesame wilt)、辣椒根腐病菌(Phytophthora capsici)6种植物病原菌均具有抑菌作用，抑制率为30％以上。
表1 菌株Fse32对多种植物病原真菌的拮抗作用
实施例5 菌株Fse32促生活性实验
将菌株Fse32活化后接种到NB培养液中，30℃，200r/min培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1－2×10-8个细胞作为接种菌悬液。取大小均匀的普通水稻种子在2％NaClO中浸泡30min，用无菌水洗数次至无NaClO残留，置无菌培养皿内30℃下浸泡吸胀1d，倒去多余的水，再置于30℃下催芽，种子露白后进行浸种(具体方法为：选取大小一致的种子置于菌株Fse32菌悬液中，对照置于无菌水中浸根，分别浸泡60min后移栽)。将浸泡后的萌芽水稻种子移栽于石英砂盆中，14h light/10h dark，30℃进 行水稻秧苗的培育，每钵20棵，定期浇灌蒸馏水和Hoagland营养液。30d后对水稻的生长情况进行记录、拍照(见图4)和测定以下各项生理指标：苗高、根长、叶绿素含量和物质积累(干重)。
接种试验测定结果见表2。菌株Fse32对水稻具有显著的促生作用，主要表现在植物的干物质积累(干重)增加十分显著，增长率分别为：接种菌株的水稻幼苗植株干重比对照增加107.04％，株高增加5.38％，根长增加14.02％，叶绿素含量增加68.78％。
表2 菌株Fse32对水稻幼苗的促生作用
Claims (3)
1.一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32，其特征在于：其分类命名为唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)Fse32，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCCNO:M 2014672，保藏日期：2014年12月28日。
2.根据权利要求1所述的一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32的应用，其特征在于：东乡野生稻内生细菌在促进水稻秧苗生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32的应用，其特征在于：农作物病原菌为水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、车前草核盘病菌、油菜菌核病菌、芝麻枯萎病菌、辣椒根腐病菌。
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Granted publication date: 20190510 |
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