CN109234211B - 一种伯克氏菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及伯克氏菌技术领域，特别涉及一种伯克氏菌(Burkholderia)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018703。其对纹枯病、稻瘟病和恶苗病具有抑菌效果。
Description
技术领域
本发明涉及伯克氏菌技术领域。
背景技术
真菌病害严重危及全球粮食安全，植物病害中有70％-80％是病原真菌的侵染所导致。稻瘟病、纹枯病和白叶枯病是水稻的三大主要病害。其它重要病害有稻曲病、恶苗病等。
近年来随着水稻品种更新加快、调运频繁、施肥水平提高以及水稻的大规模种植，特别是优质稻和杂交稻被侵染的情况增多，影响我国中晚稻比重较大。国内外主要采用化学农药对其进行防治,但常因降雨等环境原因造成防治效果不佳、同时也带来环境污染、农药残留和病原菌产生抗药性等诸多问题。
筛选新的具有病原真菌拮抗作用的细菌仍然具有重要的科学价值和实用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，结合我国的种植资源，从杭州市中国水稻研究所富阳基地水稻种植区域内分离得到了众多细菌菌株，并对这些细菌的16S rDNA和病原真菌拮抗能力等进行检测分析，旨在获得高效广谱的生防菌，以期为植物真菌病害的防治提供材料。
因此，本发明提供了一种伯克氏菌(Burkholderia)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018703。
一种如本发明的伯克氏菌CCTCC NO：M 2018703的应用。
在一个具体实施方式中，所述伯克氏菌用于防治纹枯病原菌(Rhizoctoniasolani)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)和恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)所引起的病害中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述伯克氏菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种对本发明的伯克氏菌CCTCC NO：M 2018703进行遗传改良后得到的工程菌。其中，由于该工程菌是以本发明的伯克氏菌CCTCC NO：M 2018703为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该工程菌仍然为伯克氏菌。另外，该工程菌可以为提高了对上述病害活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性和/或被赋予了其他有益特性的工程菌株。
一种如本发明的工程菌的应用。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于防治纹枯病原菌(Rhizoctoniasolani)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)和恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)所引起的病害中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种包含如本发明的伯克氏菌的组合物。其中的伯克氏菌可以包括本发明的野生菌株CCTCC NO：M 2018703，也可以包括对本发明的野生菌株CCTCC NO：M 2018703进行遗传改良后得到的工程菌。所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本发明的伯克氏菌具有增效作用的其他物质，该其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述组合物进一步可以包括与本发明的伯克氏菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。
一种如本发明的组合物的应用。
一种如本发明所述的组合物在防治纹枯病原菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)和恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)所引起的病害中的至少一种的应用。
一种如本发明所述的组合物在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种包含如本发明的伯克氏菌的农药制剂。其中的伯克氏菌可以包括本发明的野生菌株CCTCC NO：M 2018703，也可以包括对本发明的野生菌株CCTCC NO：M 2018703进行遗传改良后得到的工程菌。所述农药制剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述农药制剂还可以包含与本发明的伯克氏菌具有增效作用的其他物质，该其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述农药制剂进一步可以包括与本发明的伯克氏菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。
一种如本发明的农药制剂的应用。
一种如本发明所述的农药制剂在防治纹枯病原菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)和恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)所引起的病害中的至少一种的应用。
一种如本发明所述的农药制剂在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
在本发明中，术语“保护”的意思是通过预防和/或治疗靶标生物产生的病虫害等，从而使靶标生物免于或减轻遭受所述病虫害的为害。例如通过使用所述伯克氏菌预防和/或治疗水稻的稻瘟病。
本发明的有益效果：
本发明的伯克氏菌同时对纹枯病原菌、稻瘟病原菌和恶苗病原菌并具有非常好的抑菌效果，因此，可以将其用于保护植物免于这些病害的为害。因而，本发明的伯克氏菌极具实用价值。
附图说明
图1为利用对峙培养法测得的JP2-270对稻纹枯病原菌的抑制效果图。其中，A为空白对照，B为JP2-270的抑菌实验。
图2为利用对峙培养法测得的JP2-270对稻瘟病原菌的抑制效果图。其中，A为空白对照，B为JP2-270的抑菌实验。
图3为利用对峙培养法测得的JP2-270对恶苗病原菌的抑制效果图。其中，A为空白对照，B为JP2-270的抑菌实验。
图4为JP2-270的16S rDNA构建的系统发育树。
菌种保藏
本发明筛选的一株细菌被定名为JP2-270，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018703，保藏日期为2018年10月22日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072。其系统分类为伯克氏菌(Burkholderia sp.)。即该菌株为伯克氏菌(Burkholderia sp.)JP2-270。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
病原菌：4种供试病原真菌纹枯病原菌(Rhizoctonia solani)GD118、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)guy11和恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)EM-1-10由本实验室保藏。
LB液体培养基配方：胰蛋白胨10克，酵母粉5克，NaCl 10克，蒸馏水1000ml，pH7.2。常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15克/升。
PDA固体培养基配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水1000ml，自然pH。常规灭菌后使用。
相对抑菌率(％)＝[(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半]×100％
实施例
1、菌株的分离与纯化
从中国水稻研究所富阳基地水稻种植区域内随机选取5个点挖取水稻根，将根系上的浮土轻轻用流水冲洗干净，与根系紧密附着的土壤用超声震荡的方式将其洗下，洗下的土壤悬浮液梯度稀释后涂于LB培养皿上，将培养皿置于28℃恒温培养箱内，每当菌落长出后，挑取不同形态菌落在新鲜LB培养基平板上进行划线纯化，然后再挑取单菌落于LB固体斜面4℃短期保存供活性测定使用。与此同时，单菌落接种LB液体，28℃过夜震荡培养后，将菌液与40％的灭菌甘油等体积混合后置－80℃长期保存。
在众多分离得到的菌株中，经活性测定获得了一株对稻曲病和稻瘟病具有优良抑菌效果的菌株，将其命名为JP2-270。
2、菌株JP2-270的抑菌谱
1)对纹枯病原菌的活性测定
采用平板对峙法：一方面，将水稻纹枯病病原菌GD118提前在PDA固体培养基上于28℃下培养2天进行活化。
另一方面，将供试菌株JP2-270于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养11小时，然后取5μl培养液滴加于PDA培养基中心点两侧，距中心2.5cm，同时将活化好的病原菌GD118用6mm打孔器沿着菌丝边缘打取一个菌饼，然后将菌饼的菌丝面朝下，接种到已经接种有供试菌JP2-270的PDA培养基的中央。接种三个平板作为重复。
以不接供试菌JP2-270而只接种病原菌GD118的平板为对照。接种三个平板作为重复。
在28℃下进行对峙培养，培养24h后观察并记录，抑菌情况见图1。
结果显示，JP2-270对水稻纹枯病病源真菌GD118表现出明显抑制作用。受JP2-270抑制的病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为1.10cm，1.12cm和1.20cm，对照病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为4.12cm，4.10cm和4.30cm。
根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率，得到JP2-270对水稻纹枯病病源真菌GD118的相对抑菌率为72.7％。
2)对稻瘟病原菌的活性测定
采用平板对峙法：一方面，将稻瘟病原菌guy11提前在PDA固体培养基上于28℃下培养7天进行活化。
另一方面，将供试菌株JP2-270于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养11小时，然后用无菌牙签蘸取适量菌液后划线接种PDA培养基中心点两侧，距中心2.5cm；同时将活化好的病原菌guy11用6mm打孔器沿着菌丝边缘打取一个菌饼，然后将菌饼的菌丝面朝下，接种到已经接种供试菌JP2-270的PDA培养基中央。接种三个平板作为重复。
以不接供试菌JP2-270而只接种病原真菌guy11的平板为对照。接种三个平板作为重复。
在28℃进行对峙培养，在第6天观察并记录，抑菌情况见图2。
结果显示，JP2-270对水稻稻瘟病原菌guy11表现出明显抑制作用。受JP2-270抑制的病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为0.40cm，0.42cm和0.33cm，对照病原真菌在PSA平板上的生长半径分别为1.65cm，1.65cm和1.7cm。
根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率，得到JP2-270对水稻稻瘟病原菌guy11的相对抑菌率为77.0％。
3)对恶苗病原菌的活性测定
采用平板对峙法：一方面，将水稻恶苗病原菌EM-1-10提前在PDA固体培养基上于28℃下培养5天进行活化。活化好的恶苗病原菌用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。
另一方面，将供试菌株JP2-270于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养11小时，然后用无菌牙签蘸取适量菌液后划线接种PDA培养基中心点两侧，距中心2.5cm，同时将活化好的恶苗病原菌EM-1-10用6mm打孔器沿着菌丝边缘打取一个菌饼，然后将菌饼的菌丝面朝下，接种到已经接种供试菌JP2-270的PDA培养基中央。接种三个平板作为重复。
以不接供试菌而只接种病原真菌EM-1-10的平板为对照。接种三个平板作为重复。
结果显示，在28℃进行对峙培养，在第6天观察并记录，抑菌情况见图3。
JP2-270对水稻恶苗病原菌EM-1-10表现出明显抑制作用。受JP2-270抑制的病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为1.25cm，1.33cm和1.35cm，对照病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为2.2cm，2.15cm和2.2cm。
根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率，得到JP2-270对水稻恶苗病原菌EM-1-10的相对抑菌率为40.0％。
3.菌株JP2-270的16S rDNA测序及序列分析
将供试菌株JP2-270在LB平板活化后，挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养12小时，收集菌体，使用DNAiso Reagent(Takara)进行基因组提取。用细菌16S rDNA通用引物：27F(SEQ ID No.1)和1492R(SEQ ID No.2)扩增JP2-270的16S rDNA序列。50μl的反应体系包括：10×PCR缓冲液5μl，2.5mM dNTP4μl，20μM27F1μl，20μM1492R1μl，5IU的TaqDNA聚合酶0.25μl，DNA模板(50ng/μl，采用Nanodrop测得)1μl，ddH2O补充至50μl。PCR扩增条件：94℃3min预变性，94℃45sec，58℃45sec，72℃90sec，共30个循环，72℃10min延伸。得到的约1500bp的片段，经试剂盒纯化进行TA克隆，转化大肠杆菌得到的克隆子。经过菌液PCR验证正确后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列为1436bp(SEQID No.3所示)。
将SEQ ID No.3提交至EzBioCloud网站进行同源性比对，结果发现SEQ ID No.3与BurkholderiaterritoriiLMG28158T的16S rDNA同源性较高，相似性达为99.37％。采用MEGA6.0构建系统发育树(图4)，16S rDNA系统发育分析显示JP2-270与伯克氏菌属的物种聚类在一起，但是没有与伯克氏菌属的任何一个物种聚在同一个分支上。系统发育树显示的结果与EzBioCloud网站进行同源性比对结果虽然不完全一致，但这属于一种常见现象，并且基于此，尚不能据此将其归为已知菌种，但可以判定该菌归为伯克氏菌属(Burkholderia)。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种伯克氏菌及其应用
<130> LHA1860967
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(non)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(non)
<400> 2
cggttacctt gttacgactt 20
<210> 3
<211> 1436
<212> DNA
<213> 伯克氏菌( Burkholderia sp.)
<400> 3
ggcgttgggg gcagcttaac atgcagtcga cggcagcacg ggtgcttgca cctggtggcg 60
agtggcgaac gggtgagtaa tacatcggaa catgtcctgt agtgggggat agcccggcga 120
aagccggatt aataccgcat acgatctacg gatgaaagcg ggggaccttc gggcctcgcg 180
ctatagggtt ggccgatggc tgattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac 240
gatcagtagc tggtctgaga ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtgg ggaattttgg acaatgggcg aaagcctgat ccagcaatgc 360
cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta aagcactttt gtccggaaag aaatccttgg 420
ctctaataca gtcgggggat gacggtaccg gaagaataag caccggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc 540
gcaggcggtt tgctaagacc gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattggt 600
gactggcagg ctagagtatg gcagaggggg gtagaattcc acgtgtagca gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaatacc gatggcgaag gcagccccct gggccaatac tgacgctcat 720
gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat 780
gtcaactagt tgttggggat tcatttcctt agtaacgtag ctaacgcgtg aagttgaccg 840
cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg 900
gtggatgatg tggattaatt cgatgcaacg cgaaaaacct tacctaccct tgacatggtc 960
ggaatcctgc tgagaggcgg gagtgctcga aagagaaccg gcgcacaggt gctgcatggc 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc 1080
cttagttgct acgcaagagc actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140
ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg ggtagggctt cacacgtcat acaatggtcg 1200
gaacagaggg ttgccaaccc gcgaggggga gctaatccca gaaaaccgat cgtagtccgg 1260
attgcactct gcaactcgag tgcatgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320
ccgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1380
ttaccagaag tggctagtct aaccgcaagg aggacggtca ccacggtaga tttact 1436
Claims (7)
1.一种伯克氏菌(Burkholderia)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018703。
2.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的伯克氏菌。
3.一种农药制剂，所述农药制剂包含如权利要求1所述的伯克氏菌。
4.如权利要求1所述的伯克氏菌、如权利要求2所述的组合物以及如权利要求3所述的农药制剂中的至少一种在用于防治纹枯病原菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)和恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)所引起的病害中的至少一种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述伯克氏菌用于保护植物。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述植物为农作物。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述农作物为水稻。
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