CN108148782B - 产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株及其应用 - Google Patents

产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种筛选产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株的方法,及通过该筛选所筛选出的一种绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens)SPS‑41菌株GDMCC No.60273,以及该菌株在防治甘薯采后黑斑病的应用。本发明的筛选产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株方法,成本低、操作简单,所筛选的绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种SPS‑41,活性高且稳定,能有效抑制黑斑病病菌的生长。使用绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种SPS‑41防治甘薯采后黑斑病,成本低、使用简单,且无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。

Description

产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种产挥发性气体的微生物,尤其涉及一种筛选产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株的方法,以及筛选出的绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonaschlororaphis subsp.aureofaciens)SPS-41菌株GDMCC No.60273和该菌株在防治甘薯采后黑斑病的应用。
背景技术
我国是世界上最大的甘薯生产国,甘薯也是我国的第四大粮食作物。甘薯营养丰富是一种优良的药食同源作物。甘薯生产和储存中极易感染甘薯长喙壳菌,导致甘薯黑斑病的发生,使薯块发黑变苦无法食用或饲用,给我国的甘薯产业带来了巨大的经济损失。该病菌可随种苗、种薯的调运,以及带菌土壤、肥料、流水、农具及鼠类、昆虫等进行远距离传播,防治难度极大。目前,在生产实践中化学农药仍然是防治甘薯黑斑病的主要手段。化学农药价格低廉、见效快,但是化学农药的长期大量使用会引起一系列的问题,如污染环境、毒素残留、危害人类健康等。
生物防治具有专一性强、成本低、对环境安全和可持续控害等特点,因而受到广泛的关注。利用微生物产生的挥发性气体对甘薯采后黑斑病进行生物防治以替代化学农药是近年来的一个新的研究热点。一些微生物可以产生多种挥发性气体,如醇类、醛类、酯类、酮类、烃类等。这些挥发性有机物(VOCs)可以抑制植物病原细菌和真菌的生长,杀灭线虫,促进植物生长诱导植物产生系统抗性。此外,利用微生物产生的挥发性气体对甘薯采后黑斑病进行生物防治,活体菌剂与甘薯不直接接触,没有化学毒素残留物,使用方法简便高效,是一项具有开发潜力和开发价值的新型技术。目前国内外关于产挥发性气体微生物在甘薯采后黑斑病的研究,多停留在一般问题描述或实验室研究阶段,尚未有能高效抑制黑斑病菌的菌种。
发明内容
为了克服化学农药在防治甘薯采后黑斑病中存在的污染环境、毒素残留、威胁人类健康、催生抗药菌等问题,本发明提供了一种筛选产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株的方法,及通过该筛选所筛选出的一种绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonaschlororaphis subsp.aureofaciens)SPS-41菌株GDMCC No.60273和该菌株在防治甘薯采后黑斑病的应用。使用该菌株防治甘薯采后黑斑病,成本低、操作简单、无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。
本发明人通多大量实验获得了筛选产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株方法,包括步骤:
S1:取健康甘薯植株根际表面的土壤用无菌水稀释成悬浊液,取该悬浊液涂布于LB培养基上进行培养。
S2:当所述LB培养基上长出菌落后,分离纯化所述LB培养基上长出的菌落得纯菌株。
S3:取2组一侧为PDA培养基另一侧为LB培养基的分隔琼脂平板,在2组分隔琼脂平板的PDA培养基上分别接种同样的甘薯黑斑病菌菌饼,在其中一组分隔琼脂平板的LB培养基上接种所述纯菌株作为处理组,另一组分隔琼脂平板作为对照组,密封2组分隔琼脂平板进行培养。
S4:测量培养后的2组分隔琼脂平板上的甘薯黑斑病菌菌饼的菌落直径,若处理组的菌落直径小于对照组的菌落直径则所述纯菌株为产生挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株,若处理组菌落直径等于或大于对照组菌落直径,则所述纯菌株不是产生挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株。
该产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株的筛选方法构成本发明的第一方面。
本发明的第二方面是由上述筛选方法筛选出的一种可产生挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株,经鉴定,该菌株为绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonaschlororaphis subsp.aureofaciens)SPS-41。
由于该菌株能产生挥发性气体抑制黑斑病菌的生长,能用于黑斑病的防治,特别是甘薯采后黑斑病的防治。这种应用构成本发明的第三方面。
本发明的有益效果:
1.本发明的筛选产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株方法,成本低、操作简单;
2.所筛选的绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种SPS-41,活性高且稳定,能有效抑制黑斑病病菌的生长;
3.以绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种SPS-41防治甘薯采后黑斑病,成本低、使用简单,且无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。
本发明的菌种保藏日期为2017年11月8日,保藏编号为:GDMCC No.60273。分类名称为:绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aureofaciens)SPS-41,保藏单位名称为广东省微生物菌种保藏中心,地址为中国广州市广东微生物研究所,邮编510075。
附图说明
图1为本发明实施例1中所述的菌株SPS-41对甘薯黑斑病菌菌丝生长的抑制作用实验照片,其中,左图为空白对照图,右图为菌株SPS-41处理图;
图2为本发明实施例2所述的菌株SPS-41在LB平板上培养48小时后的菌落照片;
图3为本发明实施例2所述的基于16S rRNA基因构建的菌株SPS-41的系统发育树;
图4为本发明实施例3所述的菌株SPS-41的8中挥发性物质的GC/MS图谱;
图5本发明实施例4所述的菌株SPS-41所产生的挥发性物质纯品对甘薯黑斑病菌菌丝生长的抑制作用实验照片;
图6为本发明实施例5所述的菌株SPS-41对甘薯黑斑病的防治作用实施照片,其中,上图为空白对照图,下图为菌株SPS-41的处理图。
具体实施方式:
实施例1:产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株的筛选
选择健康且长势良好的甘薯植株,用铲子将带有细根的储藏根挖出,抖去表面浮土,用毛刷将根际表面的土壤轻轻刷下装入自封袋中密封,作为根际土壤。取2g根际土壤置于盛有20mL无菌水的的100mL三角瓶中,三角瓶内放有若干玻璃珠。充分振荡后,制成10-1稀释液。吸取10-1稀释液0.5mL至装有4.5mL的无菌水试管中,充分搅匀。重复上述操作,直至获得10-6稀释液。吸取10-4、10-5或10-6稀释液各0.1mL,涂布于LB分离培养基上,其中,LB分离培养基的配方为:
10g胰蛋白胨
5g酵母粉
30g NaCl
pH 7.2
琼脂18g
1000mL水
将LB分离培养基平板倒置在37℃下培养1-2填,对长出的菌落及时进行纯化并用LB固体斜面于4℃条件下保藏。
采用直径90mm,中间有隔板分隔平板进行菌株筛选。在分隔平板一侧倒入PDA培养基,其配方为:
去皮土豆200g
葡萄糖20g
琼脂15g
蒸馏水1000mL
pH自然
在分隔平板的另一侧倒入LB培养基,冷凝后,PDA培养基一侧接种直径为6mm的甘薯黑斑病菌菌饼,LB培养基一侧划线接种分离的纯菌株,并以不接种细菌的分隔平板为对照。用封口膜密封各分隔平板的边缘,每组处理3皿。将分隔平板倒置于28℃中培养7天,用十字交叉法测量甘薯黑斑病菌菌落直径的大小,并按下列公式计算其抑菌率:
Figure BDA0001561482230000041
抑制率大于0则所接种的纯菌株为产生挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株,抑制率小于或等于0,则所接种的纯菌株不是产生挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株。
通过上述筛选方法从健康甘薯植株中得到一株编号为SPS-41的细菌。如图1所示,甘薯黑斑病菌培养7天后,对照组甘薯黑斑病菌菌丝生长直径为35.67mm,菌株SPS-41处理组中菌丝直径为10.00mm,对菌丝生长的抑制率为86.52%,证明菌株SPS-41所产生的挥发性气体对甘薯黑斑病菌有良好的抑菌效果。
实施例2:菌株SPS-41的鉴定
菌株SPS-41的形态特征:如图2所示,菌株SPS-41在LB固体平板上生长良好,在37℃条件下培养48h后,菌落为浅黄色,形状为圆形、边缘光滑、直径约1-2mm。
使用NA液体培养基于37℃、150rpm摇瓶培养48h后以8000rpm离心收集菌体,通过微波法提取菌体基因组DNA,用细菌通用引物27f5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492r:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGC A-3'进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系为:模板DNA 2μL,10×buffer 5μL,25mmol/LMgCl23μL,10mmol/L dNTP 1μL,10μmol/L27f 1μL,10μmol/L1492r 1μL,5u/μL Taq酶0.5μL,PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工有限公司测序。测序结果在NCBI以及EzBio Cloud网站上比对测序结果,之后使用Mega 6.0软件进行序列比对及分析,最后用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树并进行系统发育分析。如图3所示,序列比对发现该菌株与假单胞菌属的有效种序列相似性最高,与绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciensNBRC3521T的相似性为99.4%。因此,菌株SPS-41应属于假单胞菌属的成员,命名为绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens)SPS-41。
实施例3:菌株SPS-41产生的挥发性气体的成分鉴定
将菌株SPS-41用LB固体培养基于28℃恒温培养2天后,其VOCs用顶空固相萃取法收集后,用GC/MS分析检测。检测条件如下:
气相色谱条件:HP-INNOWax(32m×250μm×0.25μm),进样口温度260℃。载气He,流速1mL/min,程序程序升温,初始温度40℃,保持5min,以5℃/min升至250℃,保持5min。
质谱条件:电离电压70eV,离子源温度230℃,传输线温度260℃,四级杆温度150℃,溶剂延迟时间0min,扫描范围20-400m/z。
使用NIST14数据库对比,测得菌株SPS-41至少产生319种挥发性物质。如图4所示,其中含量最高的8种物质分别为乙酸异戊酯(保留时间RT=9.60),2-甲基-1-丁醇(RT=12.90),己酸乙酯(RT=12.97),3-甲基-1-丁醇(RT=13.04),辛酸乙酯(RT=18.93),癸酸乙酯(RT=24.09),2-苯基乙酸乙酯(RT=28.07),苯乙醇(RT=30.12)。
实施例4:菌株SPS-41产生的8中主要有效成分对甘薯黑斑病菌的作用分析
在分隔平板一侧倒入PDA培养基,待冷凝后接种直径为6mm的甘薯黑斑病菌菌饼。在分隔平板另一侧倒入LB培养基,待冷凝后放置一张直径为6mm的无菌滤纸片,并在无菌滤纸片是滴加20μL挥发性化学物质,对照组中的滤纸片上则滴加20μL无菌水。用封口膜密封平板边缘,每组处理3皿。将各分隔平板倒置于28℃培养7天后,用十字交叉法测量甘薯黑斑病菌菌落直径大小,按上述抑制率计算公式计算其抑菌率。
如图5所示,菌株SPS-41所产生的挥发性气体中含量最高的八种物质对甘薯黑斑病菌的菌丝生长有不同程度的抑制作用。其中,八种挥发性物质对甘薯黑斑病菌的菌丝生长的抑制率分别为:乙酸异戊酯为16.99%,2-甲基-1-丁醇为86.89%,己酸乙酯为33.50%,3-甲基-1-丁醇为56.80%,辛酸乙酯为17.96%,癸酸乙酯为6.31%,2-苯基乙酸乙酯为67.96%,苯乙醇为41.75%。
实施例5:菌株SPS-41对甘薯黑斑病的防治
选取若干健康甘薯,用无菌水冲洗,室温晾干3-4h。用无菌接种针在甘薯腰部针刺20个伤口。在晾干的甘薯伤口处接种20μL 1×106个/ml的甘薯黑斑病菌孢子悬液。将处理组和对照组的甘薯分别放入保鲜盒中,其中处理组保鲜盒中四周放置4个接种有SPS-41的无皿盖LB平板。将上述甘薯于28℃恒温培养20d。
如图6所示,在培养20d后,无菌水处理组的甘薯100%发病,横切面已经整体变黑,表明甘薯已经严重发病。而SPS-41处理组的甘薯横切面,仅有个别甘薯在针刺部位有轻微的浅层发病。证明菌株SPS-41所产生的挥发性气体可以有效防治甘薯黑斑病的发生。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> 绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens )
<400> 1
ggcatctacc atgcagtcga gcggtagaga gaagcttgct tctcttgaga gcggcggacg 60
ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggata acgttcggaa acggacgcta 120
ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga 180
gcctaggtcg gattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg atccgtaact 240
ggtctgagag gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg 300
cagcagtggg gaatattggr caatgggcga aarcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga 360
agaaggtctt cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggtactta cctaatacgt 420
gagtattttg acgttaccga cagaataagc accggctaac tctgtgccag cagccgcggt 480
aatacagagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggttc 540
gttaagttgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa actggcgagc 600
tagagtatgg tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga 660
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tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcaactagcc 780
gttgggagcc ttgagctctt agtggcgcag ctaacgcatt aagttgaccg cctggggagt 840
acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900
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gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag 1080
cacgtcatgg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaagtc atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca 1200
gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tcccataaaa ccgatcgtag tccggatcgc 1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca gaatgtcgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcacc 1380
agaagtagct agtctaacct cggaggacgg taccacgtga tacgg 1425

Claims (2)

1. 产挥发性气体拮抗甘薯黑斑病菌的菌株,其特征在于,其分类命名为绿针假单胞菌致金色假单胞菌亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens) SPS-41,其保藏编号为:GDMCC No.60273。
2.权利要求1所述的菌株在防治甘薯采后黑斑病中的应用。
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