CN112779192A - 一株对植物疮痂病有抑制作用的卡氏芽孢菌株dm4-2及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株对植物疮痂病有防治作用的卡氏芽孢菌DM4‑2及其菌剂和应用，该DM4‑2菌株于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2021026。本发明经拮抗实验证明该菌株对Streptomyces scabies有较强的抑制作用。本发明提供了利用该菌株的发酵液在防治马铃薯疮痂病方面的应用。本发明实验证明该菌株可以显著提高马铃薯植株的根系活力、抗氧化酶体系等各项生理指标，同时也显著提高了土壤脲酶的活性，从而提高了土壤的供氮能力。本发明的卡氏芽孢菌DM4‑2对S.scabies的强抑制作用可以将其制备成防治马铃薯疮痂病的生防制剂，具有重要的市场应用前景。

Description

一株对植物疮痂病有抑制作用的卡氏芽孢菌株DM4-2及其菌 剂和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对植物疮痂病有防治作用的卡氏芽孢菌DM4-2及其菌剂和应用。

背景技术

马铃薯是世界第四大粮食作物，根据联合国粮食及农业组织(FAO)不完全统计，到2018年，它的产量已经增加到3.68亿吨。在马铃薯的常见病害中，马铃薯疮痂病是主要由S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies等引起的一种土传病害，病原菌可在土壤沉积物中发现，并通过风和水流或病种块茎传播。它们产生的植物毒素可破坏马铃薯块茎的皮层和表皮组织，从而导致马铃薯块茎上的疮痂病变，因疮痂病导致的块茎品质下降引起消费者和厂商的排斥。疮痂病作为全球性病害，导致了巨额经济损失，中国危害面积高达10％，且随着我国主粮化战略的推动，呈逐年加重趋势。目前，病原菌的侵染性、马铃薯品种的易感性、土壤条件、化学药品、生物防治等针对疮痂病的防治措施，也是越来越多的科学研亢者的工作之重。

目前，控制这类疾病的方法主要包括作物轮作、保持高土壤湿度水平、降低土壤pH、五氯硝基苯和氯化苦土壤熏蒸、选育抗性品种、抗菌剂的施用、生长素叶面喷施等传统措施以及利用微生物制剂来进行生物防治控制。许多研亢者希望可以通过培育抗病品种来防止疮痂病的发生，可是由于植物抗性的遗传和生理机制的复杂性，并未得到理想的成果。然而，近些年研亢发现生物制剂对提高植物的抗病性具有较好的效果，其对环境产生的影响很小且对病原菌的针对性强，不仅可以起到抗病的效果还有改善土壤状况、促进植物生长、增加植物产量等优势。

因此，从环境中筛选能在马铃薯植株内稳定定殖并且可以帮助植物抵御或减轻疮痂病病原菌侵染程度的菌株，对于马铃薯疮痂病防治是有重要的研亢意义的。

发明内容

本发明的目的是提供了一株对植物疮痂病有防治作用的卡氏芽孢菌DM4-2及其菌剂和应用。本发明筛选获得了一株能够同时抑制马铃薯疮痂病病原菌S.scabies的菌体以及孢子生长的菌株，并将该菌株DM4-2的发酵液灌根，实验证明菌株DM4-2的发酵液对马铃薯疮痂病的生防效果为42.27％，同时降低了疮痂病的发病率及病情指数，实验结果证明该菌株对马铃薯疮痂病的防治具有广阔的应用前景。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株对植物疮痂病有防治作用的卡氏芽孢菌株DM4-2，其分类命名为卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021026。

进一步的：所述菌株DM4-2为革兰氏阳性菌，其菌落呈椭圆形，菌体呈乳白色，不透明，表明光滑湿润，质黏，边缘不规则，无晕环。

进一步的：所述菌株DM4-2适宜生长的温度为28～37℃，pH为5～12，盐浓度为171mmol/L-1710mmol/L。

进一步的：所述菌株DM4-2培养基的最优配方比例为：淀粉0.5％、蛋白胨1.5％、酵母2.5％、氯化钠3％、硫酸镁0.1％，以质量比计。

本发明还提供了含有所述的卡氏芽孢菌株DM4-2的用于防治植物疮痂病病原菌S.scabies的菌剂。

进一步的：所述植物为马铃薯和萝卜。

进一步的：所述菌剂包含DM4-2菌发酵液，所述DM4-2菌发酵液中的含菌量为8×10⁹个/mL-6×10¹⁰个/mL。

进一步的：所述DM4-2菌发酵液的制备条件为：最适pH为7，培养温度为28℃，培养时间为48-72h。

进一步的：所述DM4-2菌发酵液对马铃薯疮痂病病原菌S.scabies菌体生长和产孢均具有较强抑制作用，同时降低了疮痂病的发病率及病情指数。

进一步的：接种DM4-2菌发酵液后马铃薯的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、抗坏血酸的活力均有显著性提高。

本发明进一步提供了所述的卡氏芽孢菌株DM4-2或权利要求5所述的菌剂在用于防治马铃薯疮痂病的制剂中的应用。

进一步的：在马铃薯膨大期初期用DM4-2菌浓度为8×10⁹个/mL-6×10¹⁰个/mL的菌剂的发酵液灌根，对马铃薯疮痂病有较好的防治效果。

本发明的优点和有益效果是：本发明提供的所述卡氏芽孢菌(Bacilluscabrialesii)DM4-2是从大洋沉积物中分离筛选并经过纯化得到的，可以同时抑制马铃薯疮痂病病原菌S.scabies的孢子及菌体生长的拮抗菌株。具有性状稳定、培养简单、效果明显、适用条件较广以及不会造成环境污染等优点，可以将其制备成防治马铃薯疮痂病的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

本发明的卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2可以在2216E/LB固体/液体培养基中生长，生长温度为28～37℃，pH为5～12，盐浓度为171-1710mmol/L，最适生长温度为28℃，最适pH为7，培养时间为48-72h，培养基组分为淀粉0.5％、蛋白胨1.5％、酵母2.5％、氯化钠3％、硫酸镁0.1％。最优条件下DM4-2的浓度为8×10⁹个/mL-6×10¹⁰个/mL。

本发明利用微生物与植物互作的方法可以明显提高植物的抗病能力，具有不会改变植物性状与基因，效率高且效果明显，不会对环境造成其他影响等优点。

本发明将所述的菌株制成细菌发酵液来浇灌(灌根)已经感染病原菌S.scabies或其孢子的马铃薯植株，在膨大期初期用浓度为8×10⁹个/mL-6×10¹⁰个/mL的DM4-2发酵液灌根，对马铃薯疮痂病有较好的生防效果(42.27％)，同时降低了疮痂病的发病率及病情指数。且发酵液较菌粉而言可以快速达到土壤与马铃薯需要的菌体浓度并且不需要搅拌即可很好地与土壤混合在一起。本发明所述的菌悬液具有活菌数高，菌悬液中菌种适应能力强，菌株性能稳定，制备方法简单，成本低等特点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明分离得到的卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2在LB固体培养基上的菌落照片；

图2为本发明分离得到的卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2的革兰氏染色照片；

图3为本发明所述卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2菌体培养(培养基为2216E液体培养基)的发酵液、上清以及菌悬液对S.scabies的拮抗实验结果；

图4为本发明所述卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2在LB、2216E两种不同液体培养基中培养时的发酵液对S.scabies的拮抗实验结果；

图5为在不同的温度、PH发酵条件下DM4-2的生长情况(以OD600作为监测指标)；

图6为在不同NaCl、MgSO₄浓度下DM4-2的生长情况(以OD600作为监测指标)；

图7为发酵条件优化前后DM4-2的生长曲线(以OD600作为监测指标)；

图8为本发明所述卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2的田间盆栽实验结果；

图9病原菌侵染情况下马铃薯植株接入DM4-2发酵液后马铃薯理化指标的变化(*代表有差异显著性)；

图10为病原菌侵染情况下马铃薯植株接入DM4-2发酵液后脲酶的变化(*代表有差异显著性)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述，但是引用实施例仅用于说明本发明，本发明所保护范围不限于此。

实施例1：卡氏芽孢菌Bacillus cabrialesii DM4-2的分离和纯化

将来源于大洋沉积物的土壤样品1g加入密封玻璃瓶(装满1/50浓度2216E培养基进行富集培养)中，于25℃(或相近温度)培养箱进行了寡营养复苏培养，一天摇两次。随后在第2、10和30天，分别吸取1mL培养液加入到10mL无菌水中混匀制成10^-1稀释液，吸取1mL10^-1稀释液加到9mL无菌水混匀制成10^-2稀释液，以此类推分别制作10^-3、10^-4、10^-5稀释液，分别取10^-3、10^-4、10^-5稀释液涂布于1/2浓度2216E固体培养基，置于28℃培养。

选取不同形态特征的单菌落进行纯化，并将细菌单菌落接种于2216E液体培养基中，28℃、180rpm条件下震荡培养24-72h，在高氏1号固体培养基上均匀涂布马铃薯疮痂病病原菌S.scabies 200μL，然后在固体培养基上均匀对称的打四个孔，接入两种不同菌株发酵液(对称孔接同一种发酵液作为平行)，于28℃培养5到7天，通过有无抑菌圈以及抑菌圈的大小筛选有拮抗能力的菌株最终筛选拮抗效果较好的菌株，其中一株命名为DM4-2，将其在甘油管中保存。

实施例2：卡氏芽孢菌Bacillus cabrialesii DM4-2的鉴定

1、菌株的形态学及生理生化特征

菌株DM4-2在LB固体平板上的菌落形态如图1所示为圆形、乳白色、不透明，表明光滑湿润、质黏、边缘不规则。取稳定期的菌株进行革兰氏染色，如图2所示为淡紫色，为革兰氏阳性菌，在光学显微镜下观察形态均呈椭圆形。菌株DM4-2的生长温度为28～37℃，pH为5～12，最适生长温度为28℃，最适pH为7。

2、菌株的16S rDNA鉴定：

用基因组提取试剂盒提取菌株DM4-2的基因组，以其为模板，以16S rDNA通用引物27F(5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’)和1492R(5’-ACG GAT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)引物进行扩增16S rDNA序列。

PCR反应体系为(25μL)：10×buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物27F 0.5μL，下游引物1492R 0.5μL，Taq酶0.15μL，DNA模板1μL，超纯水18.35μL。PCR程序为：94℃预变性10min，94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min，10℃保温。1％琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR产物条带单一大小约为1.5kb，将PCR产物送至青岛睿博兴科测序公司测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列，将测序结果在EZBioCloud(https：//www.ezbiocloud.net/identify)上进行序列比对，发现该菌株与卡氏芽孢菌的序列相似性为99.93％，因此判断该菌株DM4-2为卡氏芽孢菌。

本发明将筛选到的卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)DM4-2进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2021年1月7日；Bacillus cabrialesiiDM4-2的保藏编号：CCTCC M2021026。

实施例3：卡氏芽孢菌Bacillus cabrialesii DM4-2在不同培养基中培养的拮抗效果

将纯化后的细菌DM4-2单菌落接种于2216E液体培养基中28℃、180rpm条件下震荡培养24-72h，然后在12000rpm条件下离心3min，得到上清液，然后将菌体沉淀用无菌水重悬得到菌悬液，与发酵液一起进行拮抗实验(即在高氏1号固体培养基上均匀涂布马铃薯疮痂病病原菌S.scabies 200μL，然后在固体培养基上均匀对称的打四个孔，分别接入100μL发酵液、上清液、菌悬液以及2216E液体培养基，于28℃培养5到7d，通过有无抑菌圈以及抑菌圈的大小判断抑菌物质的来源)。

实验结果如图3所示，本发明所述菌株DM4-2的发酵液就有较好的拮抗效果。采用相同的培养条件，分别用LB和2216E两种液体培养基培养DM4-2，在高氏1号固体培养基中分别接种两种培养基培养下的DM4-2发酵液进行拮抗实验，如图4所示，菌株DM4-2在LB中培养时对病原菌的菌体和孢子同时有较大程度的抑制作用。

实施例4：卡氏芽孢菌Bacillus cabrialesii DM4-2发酵液的制备及发酵条件优化

所述的卡氏芽孢菌DM4-2的发酵液的制备方法包括以下步骤：将纯化后的菌株DM4-2按照1％的接种量接种到LB液体培养基中，在28℃、180rpm恒温振荡摇床中培养48h-72h后，取少量发酵液于1.5mL离心管中测量OD₆₀₀，制得的所述发酵液中的DM4-2菌浓度最终稀释浓度为8×10⁹-6×10¹⁰个/mL，放入4℃冰箱中保存即可。

本发明将卡氏芽孢菌DM4-2的发酵条件进行了优化，首先通过单因素实验，确定了最优碳源、氮源、无机盐(如表1所示)，碳氮源成分为淀粉、蛋白胨和酵母，无机盐成分为氯化钠和硫酸镁。接着通过正交实验确定其培养基中各个碳氮源的最优比例为0.5％淀粉、1.5％蛋白胨和2.5％酵母。

再通过单因素试验确定了氯化钠和硫酸镁的最适生长浓度为3％和0.1％(如图6所示)。最后采用单因素试验与实际生产结合的方式对发酵条件进行了优化，结果表明最适生长温度为28℃，最适pH为7(如图5所示)。

根据优化前、后的发酵条件分别测定了该菌株的生长曲线(如图7所示)，其中60h时优化条件菌株的生长量达到了原始条件培养菌株的5倍以上，证明对发酵条件的改进在很大程度上了提升了该菌株的生长条件。

合成DM4-2发酵的最佳培养基组分为：淀粉0.5％、蛋白胨1.5％、酵母2.5％、氯化钠3％、硫酸镁0.1％。最佳发酵工艺条件为：初始pH为7，培养温度28℃，培养时间为48h-72h，最优条件下DM4-2的浓度约为8×10⁹-6×10¹⁰个/mL。

表1关于碳源、氮源、无机盐的单因素实验结果

实施例5：卡氏芽孢菌Bacillus cabrialesii DM4-2的田间生防实验

在马铃薯膨大期，取实施例4中制备的所述DM4-2发酵液100mL接入已提前接病原菌的土壤的马铃薯根际中互作，在成熟期收获，对发病情况进行统计。

如图8所示，在接入病原菌的情况下再分别接入清水(SC)，卡氏芽孢菌DM4-2的发酵液(SC+DM)及LB培养基(SC+LB)，其中SC+DM组较SC组和SC+LB组的马铃薯发病情况有较大程度的改善。统计不同处理组马铃薯的发病率、病情指数及生防效果，发现DM4-2对马铃薯疮痂病的发病程度，病情指数都有较大程度的改善，生防效果为42.27％，能有效防治马铃薯疮痂病(如表2所示)。

表2不同处理组马铃薯的发病率、病情指数及生防效果实验

实施例6：病原菌侵染情况下马铃薯植株接入DM4-2发酵液后马铃薯理化指标的变化

在马铃薯膨大期，取实施例4中制备的所述DM4-2发酵液100mL接入已提前接病原菌的土壤的马铃薯根际中互作，在成熟期收获，每组选取具有代表性，且薯块大小较一致的马铃薯块茎及植株根进行理化测定，其中，接入DM4-2能显著性提高马铃薯植株根系活力，抗坏血酸，苯丙氨酸解氨酶以及多酚氧化酶的活力。

根据图9(图中*代表显著性)可以判断该菌株对马铃薯植株的根系有较大的帮助，其根系活力较未接菌的马铃薯有显著性提高。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物体内苯丙烷代谢途径的关键酶，其活性高低控制着植物体内多种次生酚类化合物、类黄酮植保素、木质素等抗菌物质的合成，多酚氧化酶(PPO)能通过催化木质素及醌类化合物形成构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，而抗坏血酸(APX)在植物体内参与电子传递系统中的氧化还原作用，促进植物的新陈代谢。PAL、PPO、APX在植物的次生代谢和抗病代谢中都具有重要作用。从图9中可以看出接种DM4-2后这三个酶的活力均有显著性提高。

综上所述，马铃薯植株接入DM4-2发酵液后可以显著提高其对疮痂病胁迫的抵御能力，在农业方面具有非常广阔的应用前景。

实施例7：病原菌侵染情况下马铃薯植株接入DM4-2发酵液后土壤理化指标的变化

在马铃薯膨大期，取实施例4中制备的所述DM4-2发酵液100mL接入已提前接病原菌的土壤的马铃薯根际中互作，在成熟期收获，对每组的土壤进行理化测定。

接入菌株后土壤的基本指标并未发生显著变化，pH均为7.2-7.4，含水量均在25％左右。菌株不会对马铃薯的种植环境有过多影响。图10的结果表明接入发酵液后土壤中脲酶活性显著增高，土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关，并且植物对磷的利用可能会提高，证明土壤中微生物的丰度和健康指数有了一定的提高。上述结果表明，接入DM4-2发酵液后土壤比之前相对肥沃一些并且不会影响植物的生长环境。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东农业大学

中国大洋矿产资源研究开发协会

<120> 一株对植物疮痂病有抑制作用的卡氏芽孢菌株DM4-2及其菌剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 卡氏芽孢菌(Bacillus cabrialesii)

<400> 1

agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac 60

gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg 120

ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac 180

ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga 240

cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300

gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360

aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc 420

ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480

atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc 540

ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600

tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660

ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt 720

ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780

ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840

acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct 960

agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag 1080

cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa 1200

gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag 1260

tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg 1380

aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag ccgccgaagg 1420

Claims (10)

1.一株对植物疮痂病有防治作用的卡氏芽孢菌株DM4-2，其特征在于：其分类命名为卡氏芽孢菌（Bacillus cabrialesii），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2021026。

2.根据权利要求1所述的卡氏芽孢菌株DM4-2，其特征在于：所述菌株DM4-2为革兰氏阳性菌，其菌落呈椭圆形，菌体呈乳白色，不透明，表明光滑湿润，质黏，边缘不规则，无晕环。

3.根据权利要求1所述的卡氏芽孢菌株DM4-2，其特征在于：所述菌株DM4-2适宜生长的温度为28~37 ℃，pH为5~12，盐浓度为171 mmol/L -1710 mmol/L。

4.根据权利要求1所述的卡氏芽孢菌株DM4-2，其特征在于：所述菌株DM4-2培养基的最优配方比例为：淀粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母2.5%、氯化钠3%、硫酸镁0.1%，以质量比计。

5.含有权利要求1所述的卡氏芽孢菌株DM4-2的用于防治植物疮痂病病原菌S. scabies的菌剂。

6.根据权利要求书5所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂包含DM4-2菌发酵液，所述DM4-2菌发酵液中的含菌量为8×10⁹个/mL-6×10¹⁰个/mL。

7.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述DM4-2菌发酵液的制备条件为：最适pH为7，培养温度为28 ℃，培养时间为48-72 h。

8.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述DM4-2菌发酵液对马铃薯疮痂病病原菌S. scabies菌体生长和产孢均具有较强抑制作用，同时降低了疮痂病的发病率及病情指数。

9.权利要求1所述的卡氏芽孢菌株DM4-2或权利要求5所述的菌剂在用于防治马铃薯疮痂病的制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：在马铃薯膨大期初期用DM4-2菌浓度为8×10⁹个/mL-6×10¹⁰个/mL的菌剂的发酵液灌根，对马铃薯疮痂病有较好的防治效果。

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