CN117487723A

CN117487723A - 一株卡氏芽孢菌yl-10及其应用

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Publication number: CN117487723A
Application number: CN202311839569.2A
Authority: CN
Inventors: 汪城墙; 季蕾; 李明鹏; 金春梅; 韩坤; 刘凯; 李文杰; 龚嘉慧; 廖婕
Original assignee: Ecology Institute Of Shandong Academy Of Sciences (the Sino-Japanese Friendship Biotechnology Research Center Shandong Academy Of Sciences); Shandong Jinming Biotechnology Co ltd; Shandong Agricultural University
Current assignee: Ecology Institute Of Shandong Academy Of Sciences (the Sino-Japanese Friendship Biotechnology Research Center Shandong Academy Of Sciences); Shandong Jinming Biotechnology Co ltd; Shandong Agricultural University
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2043-12-29
Also published as: CN117487723B

Abstract

本发明涉及一株卡氏芽孢菌YL‑10及其应用，属于微生物肥料技术领域，所述卡氏芽孢菌YL‑10于2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28780；该菌株抗盐碱能力强，能够提高植物在中度、重度盐碱环境中的耐胁迫能力，从而促进植物生长、提高作物产量，同时该菌株还具有解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素和降解PE塑料的作用，应用前景十分广阔。

Description

一株卡氏芽孢菌YL-10及其应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料技术领域，具体是一株卡氏芽孢菌YL-10及其应用。

背景技术

保障粮食高产和安全是满足全球粮食需求的必要条件。小麦作为全球三大谷物之一，提供了全球人口所需的20%的蛋白质和能量，增加小麦产量对稳定全球粮食产量和安全具有重要意义。土壤质量的优劣直接影响农业生产的健康发展，其中土壤盐碱化是影响土壤质量的一个关键问题。我国有盐碱地15亿亩，占世界总量的10%，其中5亿亩具有开发利用潜力，是耕地的战略后备资源；发展耐盐碱作物，对守住18亿亩耕地红线、保障中国粮仓将起到重要作用；另外，耕地土壤若不能进行合理的土地开发利用、灌溉耕作，则很可能导致次生盐渍化的发生。目前，全国各地都在积极开展盐碱地的治理工作，以保护土地资源并提高农业的可持续发展水平。

植物根际促生微生物（PGPM）在维持农业生态系统的功能和健康方面发挥着至关重要的作用，PGPM可以通过不同的机制来减轻作物面对外界环境所受的压力胁迫、增强作物对养分的获取、促进作物生长等。因此，筛选和应用新的PGPM在农业领域具有重要的价值。

卡氏芽孢菌（Bacillus cabrialesii）最初是在2019年VILLALOBOS等人从墨西哥雅基山谷分离得到的一株小麦内生芽孢杆菌，能抑制小麦病原菌离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）的活性；卡氏芽孢菌TE3^T是一种重要的PGPM，Villa-Rodriguez等人在2019年研究发现卡氏芽孢菌TE3^T能拮抗斑点病病原菌，可作为生防菌使用，耐盐度为5%；Rojas等人研究出了使用海藻酸钠对卡氏芽孢菌TE3^T进行微胶囊化的技术，实现了133.9%~338.0%的包封率；卡氏芽孢菌对烟草、蓝莓、梨具有防病效果，如卡氏芽孢菌BC30对烟草植株黑胫病的病原菌具有良好的拮抗效果；另外，卡氏芽孢菌还能降解海藻制造肥料。

目前，尚未有对卡氏芽孢菌抗盐碱特性和降解PE塑料等特性的相关报道，并缺乏其在促生盐碱地作物种植方面的应用研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株卡氏芽孢菌YL-10及其应用，该菌株抗盐碱能力强，同时还具有解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素和降解PE塑料的作用，对小麦在盐碱环境中的生长具有促进作用，能够明显改善盐碱胁迫下小麦的生长状态。

本发明技术方案如下：

一株卡氏芽孢菌（Bacillus cabrialesii）YL-10，2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28780。

其中，所述卡氏芽孢菌YL-10的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述卡氏芽孢菌YL-10菌液的培养方法，包括如下步骤：

（1）将卡氏芽孢菌YL-10菌株转接到LB液体培养基中，置于120~180 rpm，37±1℃条件下震荡培养，得活化菌液；

（2）将步骤（1）中的活化菌液按照LB液体培养基体积的1~3%的接种量接种到LB液体培养基中，继续培养，得卡氏芽孢菌YL-10菌液。

所述卡氏芽孢菌YL-10在解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素、降解PE塑料中的应用。

所述卡氏芽孢菌YL-10在促进植物生长方面的应用。

所述卡氏芽孢菌YL-10在盐含量≤10g/Kg、pH≤9的盐碱环境中促进植物生长方面的应用。

优选的，所述植物为小麦。

所述卡氏芽孢菌YL-10在促进植物生长方面的应用，应用方法是将卡氏芽孢菌YL-10制备成活菌含量为2.0~3.0×10⁸cfu/mL的活菌制剂，稀释100倍以上后按照2~5L/亩的施加量施加在土壤中。

优选的，所述土壤为盐含量≤10g/Kg、pH≤9的盐碱土壤。

一种以所述卡氏芽孢菌YL-10为有效成分的活菌制剂。

本发明的有益效果：

本发明提供的卡氏芽孢菌YL-10抗盐碱能力强，最高能够耐受12%（120g/L）的盐环境和pH为11的碱环境，能够提高植物在中度、重度盐碱环境中的耐胁迫能力，从而促进作物生长、提高作物产量，同时该菌株还具有解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素和降解PE塑料的作用，应用前景十分广阔。

附图说明

图1为菌株YL-10经革兰氏染色后在显微镜下的观察图片；

图2为菌株YL-10经孔雀绿染色后在显微镜下的观察图片；

图3为菌株YL-10在LB固体培养基上三区划线后长出的菌落形态；

图4为菌株YL-10在有机磷细菌培养基（左）和无机磷细菌培养基（右）中的生长情况；

图5为菌株YL-10在硅酸盐细菌培养基中的生长情况；

图6为菌株YL-10在脂肪降解培养基中的生长情况；

图7为菌株YL-10在羧甲基纤维素钠培养基中的生长情况；

图8为测定菌株YL-10降解PE塑料的能力；

图9为菌株YL-10在不同盐度LB固体培养基上的生长情况；

图10为菌株YL-10在不同碱度LB固体培养基上的生长情况；

图11为栽培14天后不同处理组中的小麦形态照片；

图12为菌株YL-10对小麦促生作用的测定结果；其中A图为小麦培养14天后各处理组的生理株高，B图为小麦培养14天后各处理组的地上鲜重，C图为小麦培养14天后各处理组的地上干重，D图为小麦培养14天后各处理组的地下鲜重，E图为小麦培养14天后各处理组的地下干重；

图13 为栽培21天后不同处理组中的小麦形态照片；

图14为菌株YL-10对不同处理组小麦促生作用的测定结果；其中A图为小麦培养7天后各处理组的生理株高，B图为小麦培养14天后各处理组的生理株高，C图为小麦培养21天后各处理组的生理株高。

具体实施方式

下面结合具体实施例进行说明：

实验材料来源说明：

津春6号小麦种子：购自金种子农资公司；

蛭石：购自灵寿县艺川矿产品加工厂。

实施例1：

卡氏芽孢菌YL-10的分离、筛选和鉴定

从中国、山东、东营市河口区的海域底泥中进行采集，具体分离、筛选方法如下：称取10.0g底泥放入装有无菌水的三角瓶中，然后置于37℃、180r/min恒温摇床上震荡30min，得悬液；利用梯度稀释法对悬液进行梯度稀释，吸取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6的悬液涂布到LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱培养；待长出单菌落后，用牙签将单菌落挑出，采用三区划线的方法在培养基上进行纯化，直至获得单一菌落，对菌落进行抗盐碱、解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素、降解PE塑料功能的筛选。

通过上述分离与筛选工作，我们最终筛选得到一株兼具有抗盐碱、解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素、降解PE塑料特性的菌株，将其命名为“YL-10”。

上述筛选得到的菌株YL-10在LB固体培养基上的形态如图1~3所示；如图1所示，经革兰氏染色后，在100倍油镜显微镜下观察菌株YL-10呈长杆状，为革兰氏阳性菌；如图2所示，经孔雀绿染色后，在100倍油镜显微镜下观察菌株YL-10的芽孢呈椭圆状；如图3所示，将菌株YL-10在LB固体培养基上三区划线后培养1天，长出的YL-10菌落形状呈不规则圆形状且表面粗糙不透明，边缘锯齿形。

另外，对筛选得到的菌株YL-10进行生理生化特征鉴定，鉴定结果如下：菌株YL-10无氧化酶活性，不可将硝酸盐还原呈亚硝酸盐，甲基红反应为阳性，可利用甘露醇、鼠李糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、β-半乳糖和葡萄糖。

将菌株YL-10的16S rDNA基因序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果参见SEQ ID NO.1；将所得16S rDNA序列与NCBI数据库中已有的序列进行BLAST分析，并选取同源性相近的菌株，采用MEGA X软件构建系统发育树，构建方法为Neighbor-joining；结果发现，上述筛选得到的菌株YL-10与Bacillus cabrialesii strainTE3^T的相似性为99％，且在进化距离上相对较近，结合菌株的生理生化特征，鉴定其为卡氏芽孢菌（Bacillus cabrialesii）。

卡氏芽孢菌（Bacillus cabrialesii）YL-10，于2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28780。

实施例2：

卡氏芽孢菌YL-10菌液的培养，具体方法如下：

（1）将卡氏芽孢菌YL-10菌株转接到装有5mL LB液体培养基的试管中，放在180rpm、37℃的恒温摇床中震荡培养12h，得活化菌液；

（2）将步骤（1）中的活化菌液按照LB液体培养基体积1%的接种量（0.5mL）接入到50mL LB液体培养基中，继续培养24h，得卡氏芽孢菌YL-10菌液，测定得菌液中的活菌数为2.32×10⁸cfu/mL。

其中，所述LB液体培养基的组分为：酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，蒸馏水1L，pH7.0；121℃灭菌20min。

实验例1：

卡氏芽孢菌YL-10解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素、降解PE塑料能力的测定

（1）通过有机磷、无机磷细菌培养基测定菌株YL-10解磷的能力，具体方法如下：

将菌株YL-10划线分别接种至蒙金娜有机磷细菌培养基和蒙金娜无机磷细菌培养基上，30℃培养3d，观察菌落生长情况；

其中，所述蒙金娜有机磷细菌培养基组分如下：葡萄糖10g，(NH4)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，NaCl 0.3g，CaCO₃5.0g，卵磷脂 0.2g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0~7.5；所述蒙金娜无机磷细菌培养基组分如下：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，KCl0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，NaCl 0.3g，Ca₃(PO₄)₂10.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0~7.5。

菌落生长情况如图4所示，其中左边为蒙金娜有机磷细菌培养基中菌落的生长情况，右边为蒙金娜无机磷细菌培养基中菌落的生长情况；由图4可得，YL-10在有机磷细菌培养基中具有降解圈，通过解磷圈法测得其相对解磷能力为147%；YL-10在无机磷细菌培养基中具有降解圈，通过溶磷圈法测得其相对溶磷能力为207%；以上结果说明菌株YL-10同时具有降解有机磷和溶解无机磷的能力。

（2）通过硅酸盐细菌培养基测定菌株YL-10解钾的能力，具体方法如下：

将菌株YL-10划线接种至硅酸盐细菌培养基上，30℃培养3d，观察菌落生长情况；

其中，所述硅酸盐细菌培养基组分如下：蔗糖5g，MgSO₄0.5g，CaCO₃0.1g，Na₂HPO₄2g，FeCl₃0.005g，玻璃粉1g，琼脂15g、水1000mL，pH 7.0。

菌落生长情况如图5所示，由图5可得，YL-10在硅酸盐细菌培养基上为光滑透明的油滴状菌落，这说明菌株YL-10具有解钾能力。

（3）通过脂肪降解培养基测定菌株YL-10降解脂肪的能力，具体方法如下：

将菌株YL-10划线接种至脂肪降解培养基上，30℃培养2d，观察菌落生长情况；

其中，所述脂肪降解培养基组分如下：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，三丁酸甘油酯2mL，琼脂15g，水1000mL。

菌落生长情况如图6所示，由图6可得，YL-10在脂肪降解培养基中，周围有透明降解圈，这说明菌株YL-10具有降解脂肪的能力。

（4）通过羧甲基纤维素钠培养基测定菌株YL-10降解纤维素的能力，具体方法如下：

将菌株YL-10划线接种至羧甲基纤维素钠培养基上，30℃培养3d，然后加适量甲基红染液，用1mol/L的NaCl溶液洗掉染液，观察菌落生长情况；

其中，所述羧甲基纤维素钠培养基组分如下：磷酸氢二钾2.5g，磷酸氢二钠2.5g，羧甲基纤维素钠20.0g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉0.5g，琼脂14.0g，水1000mL，pH 7.2。

菌落生长情况如图7所示，由图7可得，在羧甲基纤维素钠培养基中，YL-10具有降解圈，这说明菌株YL-10具有降解纤维素的能力，其相对降解能力为850%；

（5）通过加入PE塑料的无机盐培养基测定菌株YL-10降解PE塑料的能力，具体方法如下：

准备三组无机盐培养基，分别为仅塑料组、仅菌株组、塑料+菌株组，其中塑料为灭菌后的PE塑料粉末，菌株为YL-10，塑料加入比例为无机盐培养基体积的2%；将各组无机盐培养基在37℃、180 rpm条件下培养14d，观察菌液透明度的差异；

其中，所述无机盐培养基组分如下：K₂HPO₄0.92g，KH₂PO₄0.7g，MgSO₄·7H₂O 0.7g，NH₄NO₃1g，NaCl 0.005g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，ZnSO₄·7H₂O 0.002g，MnSO₄·4H₂O 0.001g，水1000mL，pH 7.2；

菌液透明度的差异如图8所示，由图8可得，相比于仅塑料组和仅菌株组，塑料+菌株组中菌液顶部的塑料粉末被分解成细小悬浮颗粒，且菌液明显变浑浊，其中测得塑料+菌株组中菌液的OD₆₀₀值为1.57，而仅菌株组的OD₆₀₀值为0.048，这说明菌株YL-10具有降解PE塑料的能力。

实验例2：

卡氏芽孢菌YL-10的耐盐碱能力测定

（1）分别配制NaCl浓度为0~13%的LB固体培养基，即NaCl的浓度依次为0 g/L、10g/L（1%）、70g/L（7%）、90g/L（9%）、100g/L（10%）、120g/L（12%）、130g/L（13%）；取50μL实施例2制备得到的卡氏芽孢菌YL-10菌液涂布于上述LB固体培养基上，37℃恒温培养48h，观察卡氏芽孢菌YL-10在不同盐度LB固体培养基上的生长情况，结果如图9所示：

由图9可得，卡氏芽孢菌YL-10能够在盐度为0~12%的环境中生长，但当盐度升高为13%时则停止生长，这说明卡氏芽孢菌YL-10最高能够耐受12%（120g/L）的盐环境。

（2）分别配制pH为6~14的LB固体培养基；取50μL实施例2制备得到的卡氏芽孢菌YL-10菌液涂布于上述LB固体培养基上，37℃恒温培养4h，观察卡氏芽孢菌YL-10在不同碱度LB固体培养基上的生长情况；结果如图10所示：

由图10可得，卡氏芽孢菌YL-10能够在pH为6~11的环境中生长，但当pH升高为12时则停止生长，这说明卡氏芽孢菌YL-10最高能够耐受pH为11的碱性环境。

实验例3：

卡氏芽孢菌YL-10在中度盐碱土环境下对小麦促生作用的测定

（1）使用1%（10mL/L）的次氯酸钠溶液充分浸泡津春6号小麦种子10min，将浸泡好的小麦种子用无菌水清洗干净，然后将清洗干净的小麦种子使用75%的乙醇浸泡5min，再次用无菌水清洗干净，将清洗干净的小麦种子用湿纱布包裹12h，备用。

（2）准备12个栽培盆用于栽培小麦，将12个栽培盆平均分为四组，分别为无盐无菌组、无盐有菌组、有盐无菌组、有盐有菌组，每组设置3个重复；

其中，栽培盆中所添加的盐含量为3.445g/Kg，所述盐是将NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃按照重量份为1：9：9：1的比例组成，并使得有盐栽培盆内土壤的pH为8.5，以模拟中度盐碱土环境；

其中，栽培盆中所添加的菌为卡氏芽孢菌YL-10，施加方式为：一是提前用YL-10菌液对小麦种子进行表面拌种，二是将实施例2中制备得到的菌液加水稀释200倍，在土壤中的施加量为70mL/Kg。

（3）选取步骤（1）中大小均匀的小麦种子种植入栽培盆中，待到出苗后进行间苗，使得每个栽培盆中的麦苗为2株，间苗结束后进行加盐加菌处理；栽培14天后，对小麦的生长形态进行拍照，然后收苗并测定小麦的生理株高（拉直后所具有的最大距离）、地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重等农艺性状数据。

栽培14天后不同处理组中的小麦形态照片如图11所示，由图11可得，在栽培第14天后，有菌组比无菌组中的小麦植株生长更加旺盛，尤其是在有盐条件下区别更加显著；

栽培14天后对小麦的生理株高测量结果如图12中的A图所示，由A图可得：在无盐条件下，第14天有菌组比无菌组中的小麦株高增加了6.45%；在有盐条件下，第14天后有菌组比无菌组中的小麦株高增加了20.26%（达到显著差异，p<0.05）；

栽培14天后对小麦的重量测定结果如图12中的B~E图所示，由B~E图可得：无盐条件下的小麦，在地上鲜重方面，第14天有菌组比无菌组增加了10.8%（达到显著差异，p<0.05）；在地上干重方面，第14天有菌组比无菌组增加了17.4%（达到显著差异，p<0.05）；在地下鲜重方面，第14天有菌组比无菌组增加了54.1%（达到极显著差异，p<0.01）；在地下干重方面，第14天有菌组比无菌组增加了9.3%。有盐条件下的小麦，在地上鲜重方面，第14天有菌组比无菌组增加了48.06%（达到极显著差异，p<0.01）；在地上干重方面，第14天有菌组比无菌组增加了43.8%（达到极显著差异，p<0.01）；在地下鲜重方面，第14天有菌组比无菌组增加了84.3%（达到极显著差异，p<0.01）；在地下干重方面，第14天有菌组比无菌组增加了74.6%（达到极显著差异，p<0.01）。

实验例4：

卡氏芽孢菌YL-10在重度盐碱土环境下对小麦促生作用的测定

与实验例3不同的是，本实验例采用东营盐碱地的重度盐碱土进行盆栽实验，盐碱土的盐浓度为10g/kg，pH为8，为重度盐碱土；将盐碱土与蛭石按照体积比为2：1的比例混匀，再加入有机肥混匀分装，有机肥用量为10g/kg；由于重度盐碱地的土壤透气性差并且有机质含量少，不利于作物生长，因此加入蛭石是为了增强通气性，加入有机肥是为了增加有机质。

将栽培盆分为两组，每组3盆，分别为对照组和实验组，其中实验组按照实验例3中的方法加入YL-10，对照组则不加菌；其余步骤同实验例3；

试验期间，每隔7天测量小麦的生理株高，栽培21天后对小麦的生长形态进行拍照。

栽培21天后不同处理组中的小麦形态照片如图13所示，由图13可得，在栽培第21天后，实验组比对照组中的小麦植株生长更加旺盛；

栽培7天后对小麦的生理株高测量结果如图14中的A图所示，由A图可得，第7天实验组与对照组中的小麦株高基本持平；

栽培14天后对小麦的生理株高测量结果如图14中的B图所示，由B图可得，第14天实验组比对照组中的小麦株高增加了38.61%（达到极显著差异，p<0.01）；

栽培21天后对小麦的生理株高测量结果如图14中的C图所示，由C图可得，第21天实验组比对照组中的小麦株高增加了43.62%（达到极显著差异，p<0.01）。

综上，本发明所提供的卡氏芽孢菌YL-10，在无盐和有盐条件下均能够对小麦表现出促生作用，尤其是在盐碱环境中对小麦的促生作用更加显著，能够提高作物对中度、重度盐碱环境的耐受性，从而促进作物生长、提高作物产量；除此之外，卡氏芽孢菌YL-10同时具有解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素和降解PE塑料的作用，应用前景十分广阔。

Claims

1.一株卡氏芽孢菌（Bacillus cabrialesii）YL-10，其特征在于，于2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28780；

2.权利要求1所述卡氏芽孢菌YL-10的菌液的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）将步骤（1）中的活化菌液按照LB液体培养基体积的1~3%的接种量接种到LB液体培养基中，继续培养，得卡氏芽孢菌YL-10的菌液。

3.权利要求1所述卡氏芽孢菌YL-10的应用，其特征在于，应用于解有机磷、溶无机磷、解钾、降解脂肪、降解纤维素、降解PE塑料。

4.权利要求1所述卡氏芽孢菌YL-10的应用，其特征在于，应用于促进植物生长。

5.权利要求1所述卡氏芽孢菌YL-10的应用，其特征在于，应用于在盐含量≤10g/Kg、pH≤9的盐碱环境中促进植物生长。

6.如权利要求4或5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，应用方法是将卡氏芽孢菌YL-10制备成活菌含量为2.0~3.0×10⁸cfu/mL的活菌制剂，稀释100倍以上后按照2~5L/亩的施加量施加在土壤中。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述土壤为盐含量≤10g/Kg、pH≤9的盐碱土壤。

9.一种活菌制剂，其特征在于，所述活菌制剂以权利要求1所述的卡氏芽孢菌YL-10为有效成分。