CN109182199B - 一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌 - Google Patents

一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌。具体技术方案为：一株油菜假单胞菌，于2018年7月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16170。该油菜假单胞菌具有极佳的耐盐能力，可以在较高盐浓度情况下，保持较强的生命活力和优良的分泌植物激素能力，同时该菌还可以分泌几丁质酶、降解几丁质，从而对防治植物真菌病害有一定的作用；同时该菌还具有良好的解钾、解磷作用，可以实际应用于盐碱地改良上。

Description

一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌
技术领域
本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌。
背景技术
土壤盐碱化是导致农业生产投入高、产出低和低效益的重要原因之一。目前，我国正面临着人口增加和资源减少的双重压力，如何更好地治理和利用盐碱地，既是保持农业生产持续运行的迫切要求，也是盐碱地区发展现有农业发展潜力的一条重要出路。
现在，盐碱地改良措施主要包括物理法、化学法和生物法。物理方法改良以淋洗排盐为主，结合深翻改土、换土、淋洗、淤积等措施达到改良效果；存在工程量大、成本高等问题。化学方法改良是施用一些酸性盐类物质，并结合施用有机肥来改良盐碱地的土壤物理性状；存在二次污染等问题。生物法改良，在排出盐分的同时，也可以起到培肥土壤的作用，具有成本低、制备简单、绿色环保等优点。
生物法改良主要包括植物改良及微生物改良。其中，植物根际促生菌(plantgrowth promoting rhizobacteria，PGPR)可以通过合成植物生长激素，溶解土壤中的难溶磷，产生嗜铁素，酶解降低乙烯水平等方法强化植物抗性，调节植物生长。
一些植物促生菌可以通过合成植物生长激素、维生素、微量元素等来促进植物的生长，其中IAA的产生可以对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用。当植物处于盐胁迫的环境中时，植物自身IAA的合成会受到抑制，但是一些在盐胁迫环境中合成IAA的菌株，可以为植物提供外源生长激素，来促进植物的生长。
磷是土壤中的重要营养元素之一，但是在盐碱土中，大部分的磷以难溶性钙磷酸盐的形式存在。植物促生菌中，具备溶磷作用的菌株占很大比例。植物促生菌通过产生有机酸或者一些胞外物质将难溶磷分解为速效磷，进而增加盐碱土中磷元素的含量，有利于植物对于磷的吸收。
在实际应用中，植物促生菌还可以通过产生嗜铁素与病原菌竞争铁离子，从而使病原菌缺乏铁元素而不能正常生长繁殖，进而可以达到减少植物病害的作用。
在盐碱地改良的实际应用中，植物促生菌的使用，可以促进植物增长，增强植物抗性。同时，还可以减少化学化肥使用造成的二次污染等问题，对于农业的可持续发展具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株油菜假单胞菌，于2018年7月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.16170。
相应的，一株油菜假单胞菌，其16Sr DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
相应的，所述油菜假单胞菌在促进植物生长和/或防治植物真菌病害中的应用。
优选的，所述油菜假单胞菌在促进植物生长中的应用，所述应用的温度为4～37℃，所述应用的pH为5～9。
优选的，所述应用的温度为28℃，所述应用的pH为7。
优选的，所述油菜假单胞菌在防治植物真菌病害中的应用，所述应用的温度为4～37℃，所述应用的pH为5～9。
优选的，所述应用的温度为28℃，所述应用的pH为7。
相应的，所述油菜假单胞菌在改良盐碱地中的应用。
优选的，所述盐碱地中可溶性总盐浓度为0～70g/L。
优选的，所述盐碱地中可溶性总盐浓度为20g/L。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种新的假单胞菌，具有极佳的耐盐能力，可以在较高盐浓度情况下，保持较强的生命活力和优良的分泌植物激素能力。
2、本发明提供的假单胞菌还可以分泌几丁质酶、降解几丁质，从而对防治植物真菌病害有一定的作用。
3、本发明提供的假单胞菌还具有良好的解钾、解磷作用，可以实际应用于盐碱地改良上。
附图说明
图1为菌株YZX4的电镜扫描示意图；
图2为菌株YZX4的菌落形态示意图；
图3为菌株YZX4的生长曲线示意图；
图4为菌株YZX4的系统发育树示意图；
图5为α-丁酮酸标准曲线示意图；
图6为牛血清蛋白标准曲线示意图；
图7为IAA标准曲线示意图；
图8为速效磷标准曲线示意图；
图9为菌株YZX4解磷能力示意图；
图10为速效钾标准曲线示意图；
图11为菌株YZX4在几丁质降解筛选培养基中生长示意图；
图12为不同pH对菌株YZX4生长活性的影响示意图；
图13为不同NaCl浓度对菌株YZX4生长活性的影响示意图；
图14为菌浓度为104CFU/ml的菌株YZX4对种子生长的根长和茎长影响示意图；
图15为菌浓度为105CFU/ml的菌株YZX4对种子生长的根长和茎长影响示意图；
图16为不同菌浓度的菌株YZX4对种子生长平均鲜重的影响示意图；
图17为不同菌浓度的菌株YZX4对种子萌芽率的影响示意图。
图18为菌株YZX4菌浓度为104CFU/ml时小黄白萌芽示意图。
具体实施方式
全文涉及的培养基和溶液如下：
1、牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min，即得。
2、DF盐培养基：KH2PO4 4g，Na2HPO4 6g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2SO4 2g，FeSO4·7H2O 1mg，硼酸10μg，ZnSO4 70μg，CuSO4 50μg，MoO3 10μg，葡萄糖2g，葡萄糖酸2g，柠檬酸2g，去离子水1L，pH＝7.2，115℃，灭菌30min。
3、ADF盐培养基：把ACC溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含有(NH4)2SO4且预先灭菌的DF盐培养基中，pH＝7.2。ACC添加的终浓度为3.0mmol/L。
4、CCM培养基：MgSO4·7H2O 0.2g；KH2PO4 0.2g；甘露醇5.0g；K2HPO4 0.8g；CaCl2·2H2O 0.06g；蔗糖5.0g；NaMoO4·2H2O 2.5mg；酵母粉0.1g；乳酸0.5mL；NaCl 0.1g；浓度为1.64％的乙二胺四乙酸钠铁(Na·Fe·EDTA)4mL；总体积1000mL(蒸馏水补足)；pH＝7.0。
注：灭菌时将MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和Na·Fe·EDTA分开灭菌，否则会产生沉淀。
5、MKB培养基：K2HPO4 2.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，甘油15ml，酸水解酪蛋白5g，pH＝7.2。
6、解磷筛选培养基：葡萄糖10g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 5g，去离子水1L，pH＝7.0～7.2。
7、解钾筛选培养基：蔗糖5g，Na2HPO4 2g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeCl30.005g，CaCO3 0.1g，钾长石粉5g，去离子水1L，pH 7.0～7.2。
8、Ashby无氮培养基：甘露醇10g，CaCO3 5g，KH2PO4 0.2g,MgSO4·7H2O 0.2g,NaCl0.2g,CaSO4·2H2O 0.1g,去离子水1L，pH 6.8～7.0。
9、CAS检测液：
(1)溶液A：将0.07g CAS溶于50ml去离子水，再加入10ml 1mmol/L的Fe3+溶液(FeCl3用10mmol/L的HCl溶解制得)。
(2)溶液B：将0.06g十六烷基三甲基溴化铵溶解于40ml去离子水制得。
(3)将溶液A沿着烧杯壁缓缓加入到溶液B中，慢慢混匀，即得到CAS检测液。
10、钼锑抗试剂：A溶液：5g/L酒石酸氧锑钾溶液：取酒石酸氧锑钾(K(SbO)C4H4O6)0.5g,溶解于100ml水中。B溶液：钼酸铵-硫酸溶液：称取钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)10g，溶于450ml水中，缓慢加入153ml浓硫酸，边加边搅拌。再将上述A溶液加入到B溶液中，最后加水至1L.充分摇匀，贮于棕色瓶中，即为钼锑抗试剂。
11、钼锑抗混合显色剂：称取1.50g抗坏血酸(左旋，旋光度+12～+22，分析纯)溶于100ml钼锑抗试剂中，混匀即得。此试剂有效期为24h，随配随用。
12、1mol/L中性NH4OAc溶液：称取化学纯CH3COONH4 77.09g加水稀释，用HOAc或NH4OH调至pH＝7.0，然后稀释至1L。
13、几丁质降解筛选培养基。
(1)溶液A：KH2PO4 8g，NH4Cl 5g，MgCl2·6H2O 4g，CaCl2·2H2O 1g，去离子水1L。
(2)溶液B：K2PO4 8g，去离子水1L。
(3)微量金属溶液：次氮基三乙酸12.8g，FeSO4·7H2O 0.42g，MnCl2·4H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.17g，CuCl2·2H2O 0.02g，ZnSO4·7H2O 0.21g，NaMoO4·2H2O 0.01g，去离子水1L。
(4)维生素混合液：维生素H 2mg，叶酸2mg/L，维生素B6 10mg，维生素B 5mg，维生素B2 5mg，泛酸钙5mg，维生素B12 0.1mg，氨基苯甲酸5mg，硫辛酸5mg，去离子水1L。
(5)胶体几丁质：称取10g片状几丁质于三角瓶中，加入200ml浓盐酸，在磁力搅拌器上搅拌过夜，然后用4℃的水进行水合沉淀，4000r/min离心10min用4℃纯水洗涤至pH为中性。
(6)取溶液A 50ml，溶液B 50ml，微量金属溶液10ml，维生素混合液10ml，酵母提取物1.0g，胶体几丁质10g，琼脂18g，加蒸馏水至1000ml，pH 7.0～7.2，即得几丁质降解筛选培养基。
14、Salkowski试剂：准确称取FeCl3 4.5g，溶于10.8M H2SO4中，冷却后定容至1L，即得。
实施例一：菌株的筛选、分离和鉴定
1、将从山东宁夏等地区采集的盐碱地原生植被(盐角草、芒草、玉米等)根际进行处理：小心抖落根系表面土壤，将根际表面紧紧附着的土壤用灭过菌的软毛刷轻轻刷入无菌水中，得到根际土壤原液，使用一次性无菌注射器取样，血球计数板计数后，分别稀释到103、104、105、106稀释度，再分别涂布到含有1％、5％、10％NaCl(w/v)的牛肉膏蛋白胨培养基上。将培养皿倒置30℃恒温培养1～4天，挑取不同类型的典型单菌落，经平板纯化后，4℃斜面保藏。
具体纯化方法为：在无菌操作环境下，用接种环挑取少量菌种，在含有1％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中，使用平板划线法，即由点到线，划出3～4条平行线后，烧掉接种环上残余菌种，再在与第一区垂直的的区域，由第一区带到第二区再划出3～4条平行线，再烧掉接种环上残余菌种，重复该步骤划至第四区。之后将平板30℃倒置培养1～2天后，再用平板划线法进行纯化。用以上方法纯化3～4次后，用接种环挑取少量菌种，转接至含有1％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基(斜面)中，4℃保藏。
其中，所述含1％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基是在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上，根据所需NaCl的量，直接在牛肉膏蛋白胨培养基中额外再添加足量NaCl即可。下文中涉及到含某一质量分数NaCl的培养基，均采用相同方法制备得到。
另外需要说明的是，轻度盐碱地土壤中，盐浓度为0.1～0.3％；中度盐碱地的盐浓度为0.3％～0.6％，重度盐碱地的盐浓度为＞0.6％，(分别对应的可溶性总盐1～3g/L、3～6g/L、＞6g/L)。本文中采用的实验均至少在1％NaCl下进行的，全部相当于处于重度盐碱地环境。
2、外观及生理生化特征：分离纯化得到的YZX4菌株，其形态特征为：如图1所示，菌株为直杆状，0.32～1.02nm×1.53～7.55nm，革兰氏染色为阴性，单极生鞭毛，无芽孢。如图2所示，其菌落特征为：在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h后，菌落呈黄绿色，菌落为圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑取。其生长pH值范围为5～9，最适生长pH值为7，生长温度范围为4～37℃，最适生长温度为28℃，耐盐(NaCl，w/v)范围为0～7％，最适盐浓度为2％。
如图3所示，菌株YZX4的生长曲线显示,菌株YZX4的延滞期为0～2h左右，对数期为28h左右，稳定期为10h左右。
3、分子生物学鉴定：
经测定，菌株YZX4的16Sr DNA核苷酸序列含有1439bp，序列如SEQ ID NO.1所示，将其与GeneBank等数据库中进行最大同源性比较，发现该菌株的16Sr DNA序列与油菜假单胞菌Pseudomonas brassicacearum subsp.neoaurantiaca序列同源性达到81％。菌株的系统发育树如图4所示。
该菌于2018年7月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.16170，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例二：菌株YZX4合成ACC脱氨酶能力测定
ACC是植物中乙烯的直接前提，而乙烯作为重要的植物激素，具有促进果实成熟、促进叶片衰老、诱导不定根和根毛发生、打破种子休眠状态等作用。在干旱等恶劣环境的胁迫下，植物根系的依稀代谢增强，加快叶片成熟、衰老和死亡，降低叶片光合作用，从而降低作物产量。
发明人发现，菌株YZX8可以分泌ACC脱氨酶，将ACC降解为α-丁酮酸和氨，降低ACC浓度，进而促进根系不断向外分泌ACC，从而降低植物内部的ACC和应激乙烯浓度，减轻恶劣环境对植物的伤害，促进植物的正常生长发育。而测定生产的α-丁酮酸的量，可以计算出菌株YZX4产ACC脱氨酶的能力。
1、将菌株YZX4接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃180r/min振荡培养24h,12000r/min，离心10min收集菌体。用不含(NH4)2SO4的DF液体培养基离心、洗涤2次(12000r/min,5min,每管加5mL DF)，将菌体重悬于含有1％NaCl(w/v)的ADF培养基中(30℃振荡培养24h,每管加2mL ADF)。收集菌体，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.6)12000r/min,离心5min、洗涤2次(-20℃储存)。
2、取菌重悬于1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中(pH＝7.6)，12000r/min离心5min收集菌体，重悬于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，添加30μL甲苯迅速振荡30s以破碎细胞，得细胞破碎液。取100μL细胞破碎液4℃储存用于测定蛋白浓度。另取细胞破碎液200μL并加入20μL 0.5mol/L ACC混匀进行水浴(30℃,15min)，以不添加ACC的空白作对照。同时加入1mL 0.56mol/L HCl终止此反应，12000r/min离心5min。取上清液1mL加入800μL 0.56mol/L HCl和300μL 0.2％2,4-二硝基苯肼溶液，使其充分溶解，30℃恒温30min,再加入2mL 2mol/L NaOH混匀，540nm测吸光度值。
3、细胞破碎液中总蛋白含量测定(Lowry法)
(1)配制试剂：
1)2g NaOH，10g Na2CO3,用去离子水定容至500ml，作为A液。
2)1.9548g CuSO4·5H2O，用去离子水定容至100ml。
3)4.5886g KNaC4H4O6·4H2O(四水合邻苯二甲酸氢钾)，用去离子水定容至100ml。
4)取2)、3)各1ml，加水至2.5ml，即成B液。
5)按体积比，A液：B液＝50:1，混匀即成C液。
(2)测定：
取细胞破碎液1ml，与C液5ml混合均匀，放置10min后，加入0.5ml1M福林酚，放置30min，750nm处比色。
4、标准曲线的绘制
α-丁酮酸标准曲线：利用0.1mol/L Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液，配制100mmol/L的α-丁酮酸母液。将该浓度的母液稀释为10mmol/L的α-丁酮酸溶液，将其加入试管中，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)补加至1mL,α-丁酮酸浓度范围为0.024～0.293μmol/mL。以吸光度值(OD540)为纵坐标，以α-丁酮酸的浓度(mmol/L)为横坐标绘制标准曲线。结果如图5所示。
牛血清蛋白标准曲线：将标准牛血清蛋白试剂配制为250μg/ml，绘制浓度为0～25μg/ml的牛血清蛋白标准曲线。结果如图6所示。
5、菌株YZX4在以ACC为唯一的氮源培养一天后，菌株YZX4体内产生ACC脱氨酶。在α-丁酮酸测定实验中，在30℃以ACC为催化底物水浴15min后，菌株体内的ACC脱氨酶将ACC分解为α-丁酮酸以及氨。测定细胞破碎液中α-丁酮酸含量的测定结果分别为0.38788μmol，0.47449μmol，0.36528μmol(3个重复)。同时将细胞破碎液按照上述蛋白浓度测定方法进行蛋白总含量的测定，测定结果分别为0.147mg、0.144mg、0.153mg(3个重复)。菌株YZX8产ACC脱氨酶的能力为＝(α-丁酮酸(μmol)/对应蛋白质量(mg·Pr))/反应时间。
经测定和计算，菌株YZX4产ACC脱氨酶的活性为11.10±1.89μmolα-KA/(mg·Pr·h)。
实施例三：菌株YZX4合成IAA的能力测定
IAA又名吲哚乙酸，可以促进细胞生长和分化，进而促进植物的生长发育。发明人发现，菌株YZX4可以分泌IAA,进而促进植物生长。
1、IAA标准曲线的绘制：将3-IAA(3-吲哚乙酸)标准溶液配置为250mg/L，分别稀释至2.5、5、10和25mg/L，并按体积比1:5与Salkowski试剂混合，室温避光放置30min，分别测定各浓度标准液在波长为530nm处的吸光值。以IAA浓度为横坐标，OD530值为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。结果如图7所示，标准曲线为：y＝0.0134x+0.0232。
2、将菌株YZX4接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基(液体)中，30℃，180r/min培养20h，取1mL接种于50mL含1％NaCl(w/v)的CCM培养基(液体)中，取1ml牛肉膏蛋白胨培养基接种于50mlCCM培养基(液体)中，作为对照组。分别于28℃，180r/min培养3～4d后，取2mL该培养基(菌悬液)，12000r/min，4℃，离心5min，取上清液1mL与5mL Salkowsky试剂混合，室温暗处比色30min，在530nm下测定其吸光度值。
3、菌株YZX4的三个重复样品的OD530分别为0.107、0.102、0.110，空白对照OD530分别为0.024、0.026、0.025，代入标准曲线y＝0.0134x+0.0232，得到样品及空白对照稀释后的IAA浓度，分别乘以稀释倍数(6倍)后，再用三个重复样品值减去空白对照的平均浓度，经测定，菌株YZX4合成IAA为36.42±1.81mg/L。
实施例四：菌株YZX4合成嗜铁素的能力测定
将菌株YZX4接种于含有1％NaCl(w/v)MKB培养基(液体)中，28℃，180r/min摇床培养48h后，菌液10000rpm离心10min，取上清液，按照体积1:1与CAS检测液混合均匀。同时将等量未接种的MKB培养基(液体)与CAS检测液1：1混合为对照。静置1h后，于630nm处测定吸光度值。样品吸光度值记为A，对照吸光度值记为Ar，A/Ar代表样品中嗜铁素的相对含量。
按照Payne对铁载体活性单位SU进行定义，A/Ar从1.0～0之间以0.2作为间隔，每减少0.2增加一个+，如0.8记为+，0.6记为++。结果显示，菌株YZX4合成嗜铁素的能力为++。
实施例五：菌株YZX4解磷的能力测定
1、制备速效磷标准曲线：准确称取在105℃烘箱中烘干2h的分析纯KH2PO40.2195g，溶于400ml蒸馏水中。加浓硫酸5ml，转入1000ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，此溶液为50mg/L磷标准液，现用现配。分别吸取50mg/L磷标准液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加钼锑抗混合显色剂5ml，除尽气泡后定容至1L，充分摇匀，即为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L的磷系列标准液。30min后在880nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，磷系列标准液浓度为横坐标绘制磷标准曲线，如图8所示。标准曲线为：y＝0.3477x+0.0279。
2、将菌株YZX4接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃，180r/min培养20h，取菌液2mL接种于80mL含有1％NaCl(w/v)解磷筛选培养基中，以2ml牛肉膏蛋白胨培养基接种到相同的80ml解磷筛选培养基中作为对照组。分别于30℃，180r/min培养，隔12h取样(0h开始)，11000r/min离心5min，取上清液测定速效磷含量，同时测定上清液的pH变化。结果如图9所示。
由图9及标准曲线可以看出，培养到1.5d时，接种菌株YZX4的解磷筛选培养基中的速效磷含量可以达到15.45mg/L的水平，说明在盐胁迫环境(1％NaCl，w/v)下，菌株YZX4具备较佳的溶磷能力。在实际应用中，可以通过将盐碱地以钙磷酸盐形式存在的难溶磷分解为能被植物利用的速效磷，促进植物增长。
实施例六：菌株YZX4解钾的能力测定
1、绘制钾标准曲线：称取KCl(二级，110℃烘干2h)0.1907g溶于1mol/L NH4OAc溶液中，定容至1L，即为含100mg/L钾的NH4OAc溶液。同时分别准确吸取次100mg/L钾标准液0.2、0.6、1、1.5、2ml放入100ml容量瓶中，用1mol/L NH4OAc溶液定容，即得0、0.6、1、1.5、2mg/L钾标准系列溶液。用火焰原子吸收光谱仪测定钾标准系列溶液的吸光度值Abs。以钾标准系列溶液浓度为横坐标，以吸光度值Abs为纵坐标，得速效钾标准曲线，如图10所示。标准曲线为：y＝0.0916x-0.0138。
将菌株YZX4接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃，180r/min培养20h，取培养基(菌液)2mL接种于50mL含有1％NaCl(w/v)解钾筛选培养基中，以2ml牛肉膏蛋白胨培养基接种于相同、等量解钾筛选培养基中，作为对照组，分别于30℃，180r/min培养，3～4d后，取上清液测定速效钾含量。具体方法为：取1ml上清液，过0.45μm水系滤膜，取0.5ml滤液定容至5ml(稀释10倍)，用火焰原子吸收光谱仪测定速效钾含量，代入速效钾标准曲线：y＝0.0916x-0.0138中，得到稀释后的样品速效钾浓度，再乘以稀释倍数即得样品中的速效钾含量。
由标准曲线和测定结果可得，菌株YZX4的解钾能力为3.57±0.40mg/L。
实施例七：菌株YZX4固氮的能力测定
将菌株YZX4接种于5mL Ashby无氮培养基(液体)中，28℃，180r/min培养3天后，取1mL培养基(菌液)重新接种于新的30mL Ashby无氮培养基中，以等量未接种菌液的Ashby无氮液体培养基作为对照组。28℃，120r/min培养6d后，用凯氏定氮法测定培养液中的总氮含量。
结果显示，菌株YZX4的固氮浓度为3.67±0.73N·mg/L。
实施例八：菌株YZX4降解几丁质的能力测定
用接种环取一接种环菌株YZX4以划“十”字的形式，将其接种于含有1％NaCl(w/v)的几丁质降解筛选培养基中，30℃培养2天，结果如图11所示。
培养2天后，如图11所示，菌株YZX4的周边出现了透明圈(图中成“十”字的地方)，证明菌株YZX4在培养过程中产生了几丁质降解酶，将几丁质降解。几丁质是病原真菌细胞壁的主要成分，而菌株YZX4具备产几丁质酶的作用，说明其可以在植物生长过程中，通过降解病原真菌的细胞壁从而减少病原真菌对植物的病害作用。
实施例九：菌株YZX4耐盐碱能力测定
1、碱性耐受实验：将菌株YZX4接种于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，培养20h后，按照1ml/30mL的接种量转接到pH分别为7、8、8.5、9、9.5、10的牛肉膏蛋白胨培养基(2％NaCl，w/v)中，30℃，180r/min摇床培养两天后，测定培养液OD600，以不接菌的牛肉膏蛋白胨培养基作为空白对照。结果如图12所示。
2、NaCl耐受实验：将菌株YZX4接种于5ml牛肉膏蛋白胨培养基中，培养20h后，按照1ml/30mL的接种量转接到分别含有有0、2％、5％、7％、10％(w/v)NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基(pH＝7.2)，30℃，180r/min摇床培养两天后，测定培养液OD600，以不接菌的牛肉膏蛋白胨培养基作为空白对照。结果如图13所示。
3、由图可得，菌株YZX4的耐碱pH为7～9，耐盐范围为0～7％。说明该菌株可以耐受较高的pH以及NaCl含量，在盐碱地改良中，可以较快的适应盐碱环境，更好地对植物生长起到促进作用。
实施例十：菌株YZX4促进种子萌芽的效果展示
1、选取发育时间相同、重量相似的小黄白种子(一种小白菜的种子)，对小黄白种子进行表面消毒：70％酒精浸泡五分钟，无菌水冲洗3次。
2、将菌株YZX4接种于5ml牛肉膏蛋白胨培养基(液体)中，30℃，180r/min过夜培养。取菌液血球计数板计数，将菌液中的菌数分别稀释至104、105CFU/ml，作为实验组。准备高压灭菌烘干后的装有三层滤纸的培养皿，取5ml稀释后的菌液，分别以同样稀释倍数未接菌的牛肉膏蛋白胨培养基(液体)为空白对照，在无菌条件下，将滤纸充分均匀润湿。取已表面消毒的小黄白种子，将其均匀置于滤纸上，30℃培养。
培养三天后，将培养皿取出，测定每皿种子萌发率、根茎长以及平均鲜重。结果如图14～17所示；菌数为104CFU/ml时，对照组和实验组的发芽情况如图18所示。
3、由图可得，菌株YZX4在小黄白种子萌发过程中，当为104CFU/ml时，与相同稀释倍数的牛肉膏蛋白胨培养基处理组相比，小黄白的根茎长度、平均鲜重以及萌发率分别提高了8.2％、13.2％、3.7％以及5.7％。当为105CFU/ml时，与相同稀释倍数的牛肉膏蛋白胨培养基处理组相比，小黄白的根茎长度、平均鲜重以及萌发率分别提高了7.9％、5.1％、14％以及0.2％。
Figure BDA0001817150430000151
Figure BDA0001817150430000161
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> 油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)
<400> 1
gggcatgggg gcagctacca tgcagtcgag cggtagagag gtgcttgcac ctcttgagag 60
cggcggacgg gtgagtaaag cctaggaatc tgcctggtag tgggggataa cgctcggaaa 120
cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct 180
atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga 240
tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg 360
cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcattaac 420
ctaatacgtt agtgttttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact ctgtgccagc 480
agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt 540
aggtggttcg ttaagttgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcaaaa 600
ctgtcgagct agagtatggt agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt 720
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780
caactagccg ttgggagcct tgagctctta gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc 840
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatccaat 960
gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaacattga gacaggtgct gcatggctgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt 1080
agttaccagc acgtaatggt gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gtcggtacag agggttgcca agccgcgagg tggagctaat cccacaaaac cgatcgtagt 1260
ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcgaatcag 1320
aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380
ggttgcacca gaagtagcta gtctaacctt cgggggacgg taccacgtgt atccgtgcg 1439

Claims (9)

1.一株油菜假单胞菌（Pseudomonas brassicacearum），其特征在于：于2018年7月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16170。
2.权利要求1所述油菜假单胞菌在促进小白菜生长和/或防治植物真菌病害中的应用。
3.根据权利要求2所述油菜假单胞菌在促进小白菜生长中的应用，其特征在于：所述应用的温度为4～37℃，所述应用的pH为5～9。
4.根据权利要求3所述油菜假单胞菌在促进小白菜生长中的应用，其特征在于：所述应用的温度为28℃，所述应用的pH为7。
5.根据权利要求2所述油菜假单胞菌在防治植物真菌病害中的应用，其特征在于：所述应用的温度为4～37℃，所述应用的pH为5～9。
6.根据权利要求5所述油菜假单胞菌在防治植物真菌病害中的应用，其特征在于：所述应用的温度为28℃，所述应用的pH为7。
7.权利要求1所述油菜假单胞菌在改良盐碱地中的应用。
8.根据权利要求7所述油菜假单胞菌在改良盐碱地中的应用，其特征在于：所述盐碱地中可溶性总盐浓度为0～70g/L。
9.根据权利要求8所述油菜假单胞菌在改良盐碱地中的应用，其特征在于：所述盐碱地中可溶性总盐浓度为20g/L。
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