CN103329907A - 一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，将油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)通过微生物培养、发酵、提取而获得的一种对多种真菌性植物病害具有良好的抑制效果的新型生物农药。与现有技术相比，本发明制备得到的吩乙霉素生物杀菌剂对油菜立枯病、黄瓜霜霉病和白粉病、小麦根腐病、水稻纹枯病病、菜豆炭疽病、番茄叶霉病、小麦全蚀病、白菜黑斑病、烟草黑胫病、番茄灰霉病和芦笋茎枯病等多种蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种杀菌剂的制备方法，尤其是涉及一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法。
背景技术
油菜假单胞菌应该是属于荧光假单胞菌属的一个种。荧光假单胞菌(P.fluorescens)属于假单胞菌属rRNA I群荧光DNA同源组假单胞菌属，是植物根际最普遍的微生物类群，具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。世界许多国家均有人报道分离到抗植物病害的荧光假单胞菌，而且许多菌株能产生几种活性物质，抗多种植物病害。其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。随着分子生物学的广泛渗入，通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良，使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种通过油菜假单胞菌经过微生物培养、发酵而获得一种新型生物杀菌剂-吩乙霉素的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)接种到经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，控制转速为150-200rpm，在24-28℃下培养1-3天得到含有油菜假单胞菌的液体种子；
(2)将液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，控制发酵罐转速为150-200rpm，在24-28℃下培养2-5天，即得到含有吩乙霉素的发酵液；
(3)将含有吩乙霉素的发酵液搅拌下用酸调节pH至2-4，过滤处理后得到的滤液用溶剂进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即制备得到吩乙霉素生物杀菌剂。
所述的油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)是上海农乐生物制品股份有限公司通过筛选获得的一种重要的植物根际促生细菌，其微生物保藏登记号为：CGMCC NO.6774，保藏时间：2012年11月2日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China GeneralMicrobiological Culture Collection Center(CGMCC)保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
步骤(1)中所述的液体培养基的原料采用以下组分及重量百分比含量：可溶性淀粉3-5％、无水硫酸镁0.1-0.3％、蛋白胨1-3％、磷酸氢二钾0.2-0.4％，余量为水。
步骤(2)中所述的培养基的原料采用以下组分及重量百分比含量：可溶性淀粉3-5％、无水硫酸镁0.1-0.3％、蛋白胨1-3％、磷酸氢二钾0.2-0.4％，余量为水，pH调节至6-8。
步骤(3)中采用盐酸、硫酸或草酸调节pH值。
步骤(3)中采用膜过滤、板框过滤或离心机过滤对含有吩乙霉素的发酵液进行过滤处理。
步骤(3)中所述的溶剂为乙酸乙酯、氯仿或乙酸丁酯。
与现有技术相比，本发明利用油菜假单胞菌经过发酵培养的具有生物活性的代谢产物N，N-二乙基吩嗪-1-甲酰胺(N，N-diethyl phenazine-1-carboxamide)经全国农药标准化技术委员会命名为“吩乙霉素”。从植物根围分离到的油菜假单胞菌大部分都具有防病增产作用，因而可能用于植物病害的生物防治。该类菌株对油菜立枯病菌、黄瓜霜霉病和白粉病菌、小麦根腐病菌、水稻纹枯病病菌、菜豆炭疽病菌、番茄叶霉病菌、小麦全蚀病菌、白菜黑斑病菌、烟草黑胫病菌、番茄灰霉病菌和芦笋茎枯病菌等多种蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用，并且能够在多种作物根际进行定殖，显示了在生物防治中应用的潜力。其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。随着分子生物学的广泛渗入，通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良，使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果。
这种制备方法所使用的生产装置与化工装置相比，具有较大的安全优势。主要生产工艺参数温度、压力处于常态，可控，保险系数高的状态。所用原料以农产品、农产品加工品及生物制品为主，安全性高，无易燃、易爆、高毒等原料及产品风险。最终获得的产品属于低毒，对环境无不良影响，对储存环境要求低，在运输过程中安全。另外，加工成制剂产品后，具有更低的毒性和对环境更友好的特征，使产品从生产到使用整个过程中的安全得到可靠的保证。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)是上海农乐生物制品股份有限公司通过筛选获得的一种重要的植物根际促生细菌，其微生物保藏登记号为：CGMCC NO.6774，保藏时间：2012年11月2日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General MicrobiologicalCulture Collection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。本发明将油菜假单胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)通过微生物培养、发酵、提取而获得的一种对多种真菌性植物病害具有良好的抑制效果的新型生物农药。
实施例1
一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、将生长良好的油菜假单胞菌nlsy003菌种接种到装有经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，转速调节为150rpm，在26℃下培养24小时，得到含有油菜假单胞菌nlsy003液体种子。所述液体培养基配方为：可溶性淀粉3％、无水硫酸镁0.2％、蛋白胨1.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水，调节PH7.2。
2、将上述制好的nlsy003液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，发酵罐转速调节为150rpm，在26℃下培养2天，即得到含有1.5克/升吩乙霉素的发酵液。所述液体培养基配方为：可溶性淀粉3.5％、无水硫酸镁0.25％、蛋白胨1.1％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水，调节PH7.2。
3、将上述制好的含有吩乙霉素的发酵液在搅拌下用酸(盐酸、硫酸、草酸)调节PH2.5，然后进行过滤(膜过滤、板框过滤、离心机过滤)，将滤液再用溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯)进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即得到吩乙霉素产品。
实施例2
一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、将生长良好的油菜假单胞菌nlsy003菌种接种到装有经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，转速调节为180rpm，在27℃下培养36小时，得到含有油菜假单胞菌nlsy003液体种子。所述液体培养基配方为：可溶性淀粉4％、无水硫酸镁0.3％、蛋白胨1.6％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水，调节PH7.0。
2、将上述制好的nlsy003液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，发酵罐转速调节为180rpm，在27℃下培养60小时，即得到含有3.5克/升吩乙霉素的发酵液。所述液体培养基配方为：可溶性淀粉4％、无水硫酸镁0.2％、蛋白胨1.6％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水，调节PH7.0。
3、将上述制好的含有吩乙霉素的发酵液在搅拌下用酸(盐酸、硫酸、草酸)调节PH3.0，然后进行过滤(膜过滤、板框过滤、离心机过滤)，将滤液再用溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯)进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即得到吩乙霉素产品。
实施例3
一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、将生长良好的油菜假单胞菌nlsy003菌种接种到装有经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，转速调节为200rpm，在27℃下培养48小时，得到含有油菜假单胞菌nlsy003液体种子。所述液体培养基配方为：可溶性淀粉4.5％、无水硫酸镁0.25％、蛋白胨2.5％、磷酸氢二钾0.25％，余量为水，调节PH7.5。
2、将上述制好的nlsy003液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，发酵罐转速调节为200rpm，在27℃下培养90小时，即得到含有2.8克/升吩乙霉素的发酵液。所述液体培养基配方为：可溶性淀粉4.5％、无水硫酸镁0.25％、蛋白胨2.5％、磷酸氢二钾0.25％，余量为水，调节PH7.5。
3、将上述制好的含有吩乙霉素的发酵液在搅拌下用酸(盐酸、硫酸、草酸)调节PH3.5，然后进行过滤(膜过滤、板框过滤、离心机过滤)，将滤液再用溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯)进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即得到吩乙霉素产品。
实施例4
吩乙霉素对植物病原菌的抑菌作用：将吩乙霉素制成1％的悬浮剂，分别测试对油菜立枯病(L)、小麦根腐病(G)、水稻纹枯病(W)、菜豆炭疽病(T)、番茄叶霉病(M)、小麦全蚀病(Q)、白菜黑斑病(B)、黄瓜白粉病(H)、番茄灰霉病(F)、芦笋茎枯病(J)的抑菌作用，结果如下表1：
表1
| 病原菌 | L | G | W | T | M | Q | B | H | F | J |
| EC50(mg/L) | 0.63 | 0.72 | 0.22 | 0.63 | 1.95 | 0.96 | 1.63 | 0.75 | 1.64 | 0.82 |
EC50为半致死浓度，浓度越低，表示抑菌作用越强。
试验表明：吩乙霉素是一种广谱生物杀菌剂，对多种植物真菌病害具有显著的抑菌效果。
实施例5
吩乙霉素对黄瓜白粉病的药效试验：将吩乙霉素制成1％的悬浮剂进行药效试验，将1％吩乙霉素悬浮剂稀释500倍、1000倍和1500倍，采用常规的叶面喷雾法进行防治试验。对黄瓜白粉病的试验结果如下表所示，试验中，吩乙霉素生物杀菌剂对黄瓜的叶片、花及果实无任何药害，也没有观察到对其它生物的影响，因此，吩乙霉素生物杀菌剂可以作为无公害的瓜类白粉病防治药物加以使用。
表2吩乙霉素生物杀菌剂对黄瓜白粉病的药效试验
实施例6
吩乙霉素对黄瓜霜霉病的药效试验：将吩乙霉素制成1％的悬浮剂进行药效试验，将1％吩乙霉素悬浮剂稀释500倍、1000倍和1500倍，采用常规的叶面喷雾法进行防治试验。对黄瓜霜霉病的试验结果如下表所示，试验中，吩乙霉素生物杀菌剂对黄瓜的叶片、花及果实无任何药害，也没有观察到对其它生物的影响，因此，吩乙霉素生物杀菌剂可以作为无公害的瓜类霜霉病防治药物加以使用。
表3吩乙霉素生物杀菌剂对黄瓜霜霉病的药效试验
实施例7
吩乙霉素对水稻纹枯病的药效试验：将吩乙霉素制成1％的悬浮剂进行药效试验，将1％吩乙霉素悬浮剂稀释500倍、1000倍和1500倍，采用常规的叶面喷雾，在水稻纹枯病的发病初期施药。施药时把药液喷到水稻茎杆上，喷雾重点部位是水稻中下部。试验结果如下表明，吩乙霉素生物杀菌剂对水稻无任何不良影响，无药害产生。试验药剂1％吩乙霉素悬浮剂对水稻纹枯病有较好的防效，在发病初期连施两次药基本能控制水稻纹枯病的为害。
表4吩乙霉素生物杀菌剂对水稻纹枯病的药效试验(药后14天)
吩乙霉素(N，N-二乙基吩嗪-1-甲酰胺)的毒性试验表明为一种低毒的生物杀菌剂，试验结果如下：
1、急性经口毒性试验：92％N，N-二乙基吩嗪-1-甲酰胺原药对雌雄大鼠经口LD50均为926(636～1350)mg/kg，属低毒；
2、急性经皮毒性试验：92％N，N-二乙基吩嗪-1-甲酰胺原药对雌雄大鼠经皮LD50均大于2000mg/kg，属低毒；
3、急性皮肤刺激试验：92％N，N-二乙基吩嗪-1-甲酰胺原药对急性皮肤刺激分级为“无刺激性”；
4、眼刺激试验：92％N，N-二乙基吩嗪-1-甲酰胺原药对眼刺激分级为“轻度刺激性”。
Claims (7)
1.一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)接种到经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，控制转速为150-200rpm，在24-28℃下培养1-3天得到含有油菜假单胞菌的液体种子；
(2)将液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，控制发酵罐转速为150-200rpm，在24-28℃下培养2-5天，即得到含有吩乙霉素的发酵液；
(3)将含有吩乙霉素的发酵液搅拌下用酸调节pH至2-4，过滤处理后得到的滤液用溶剂进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即制备得到吩乙霉素生物杀菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)其微生物保藏登记号为：CGMCC NO.6774。
3.根据权利要求1所述的一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的液体培养基的原料采用以下组分及重量百分比含量：可溶性淀粉3-5％、无水硫酸镁0.1-0.3％、蛋白胨1-3％、磷酸氢二钾0.2-0.4％，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的培养基的原料采用以下组分及重量百分比含量：可溶性淀粉3-5％、无水硫酸镁0.1-0.3％、蛋白胨1-3％、磷酸氢二钾0.2-0.4％，余量为水，pH调节至6-8。
5.根据权利要求1所述的一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中采用盐酸、硫酸或草酸调节pH值。
6.根据权利要求1所述的一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中采用膜过滤、板框过滤或离心机过滤对含有吩乙霉素的发酵液进行过滤处理。
7.根据权利要求1所述的一种吩乙霉素生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的溶剂为乙酸乙酯、氯仿或乙酸丁酯。
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