CN110668876B - 一种复合菌根生物肥及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物肥料和制剂技术领域，公开了一种复合菌根生物肥及其制备方法和应用，将保藏的菌种用固体活化培养基活化，挑取单菌落按照分组内的成员菌两两交叉三区划线到同一培养基平板上培养，30℃培养3天，3次重复；将无拮抗菌株和菌根菌接入到各自的液体培养基中；于35℃下，以海藻酸钠浓度3％与聚乙稀醇浓度3％配比，配制溶液100ml；添加0.5％生物炭，于35℃下配制成溶液100ml，121℃灭菌20min，冷却至35℃，取复合功能细菌和菌根真菌菌体各2g，加入包埋剂溶液中，于恒温磁力搅拌器上混均。本发明功能菌系和菌根真菌混合包埋固定化研究及包埋固定化颗粒对油松幼苗促进作用。

Description

一种复合菌根生物肥及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物肥料和制剂技术领域，尤其涉及一种复合菌根生物肥及其制备方法和应用。

背景技术

目前，最接近的现有技术：我国土壤微生物学的奠基人陈华癸院士定义微生物肥料为一类“含有活微生物的特定制品，并且植物获得的肥料效应主要取决于制品中活微生物的生命活动。微生物肥料应用于农林业生产中，施入土壤后有多类促生菌或生防菌稳定定植于植物根围土壤形成优势菌群的特定微生物制剂，具有解磷解钾固氮及虫害防治等特定肥料效应，并且在微生物的生命活动过程中，同时还会产生活性物质，促进植物生长及控制病虫害的特定生物制品。由于我国长期大量使用化肥造成土体盐渍化、重金属污染、土壤微生态环境遭到破坏、植物利用化肥效率低造成能源的巨大浪费和农产品品质下降等因素，严重影响我国城乡人民的健康。在2011年年底国家发布文件《“十二五”生物技术发展规划》和《农业科技发展“十二五”规划》中，将优先发展微生物肥料领域以来，微肥领域的发展得到了突飞猛进的进步，种类上也变得多样化。

根据所含植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)种类不同将微生物肥料分为细菌微肥、放线菌微肥、真菌微肥。根据作用原理可分为根瘤菌类、解磷菌类、解钾细菌类，外生或内生菌根菌类，光合细菌类和有机物料腐熟剂。根据微肥功能多样性分为：单菌株制剂、多菌株制剂、微生物化肥复合制剂、微生物中微量元素复合制剂、微生物有机肥制剂。根据剂型分为：液体、粉剂、颗粒、冻干。根据成品性状分为：有液体的，主要用于拌种、叶面喷施；有固体颗粒的，用于基施或追施。

对于我国微肥领域的探究及应用从最初的大豆根瘤菌剂和花生根瘤菌剂的研制到如今的多种功能菌株复合的生物肥料的研制已历经70多年。尤其在近年来，大多数城乡已经步入小康，人们对食品的健康及安全越来越重视，微肥也受到了科研学者关注及农民的青睐，微肥领域得到了迅速发展。

微肥产品种类日渐增多，功能各异，在施用方法用量上也不同。微肥年产量及施用面积也在日益增加。我国微肥领域的企业在2012年已达到850多家，年产量为900万吨/年，总产值高达150亿元/年。在微肥众多种类中固氮菌剂、根瘤菌菌剂、硅酸盐菌剂、溶磷菌剂、光合细菌菌剂、有机物料腐熟剂、复合菌剂、内外生菌根菌剂、生物修复菌剂及复合微生物肥料和生物有机肥类产品等11类产品在农业部登记。

微生物肥料使用菌种也在科研学者的不断筛选及鉴定中不断增多，在2014年时可用外生菌根菌(ECM)、内生菌根真菌(VA)、解磷菌、解钾菌、联合及自生固氮菌等植物根际促生菌(PGPR)菌种已到达150多种。

而在国家农业部提倡化肥减量增效以来，微生物肥料的使用已渐渐被使用者认可，张焕菊等人研究表明，应用生物有机肥替代化肥用量的30％后发现烤烟的生长与施用全量化肥的烤烟生长无差异^[8]。虽然目前微生物肥料在农林业增产方面还远不如化肥，但在改善农产品质量、减少化肥施用量、减少农药施用量及保护土壤微生态环境方面有了实践证明。

微生物肥料从最开始的根瘤菌剂发展至今历经70多年，越来越多的微肥新兴企业成立，尤其在畜牧业发展迅速的内蒙地区，牛羊粪经高温发酵后配合微生物菌剂形成微生物有机肥。一些大型企业营业领域也开始拓展到微生物肥料，例如氨基酸年产量全国第一的梅花集团，利用氨基酸废液残渣生产有机肥；国酒茅台等酿造企业也利用酒糟制成生物有机肥。但在微肥领域迅速发展的同时，诸多问题也体现出来。

(1)企业规模小

在众多微生物肥料其中多数企业为中小型企业，菌剂和菌肥的年产量分别能达到1千吨和5万吨的企业屈指可数，由于微生物肥料的迅速发展，微肥年产量比前几年提高了很多，但在整个肥料行业中所占比重远不如化肥，仅为整个肥料行业的2％。

(2)微肥领域中部分企业设备更新慢、生产工艺原始、产品质量差。

特别是有机肥生产企业，他们多不具备生产菌剂的技术及设备，主要通过购买菌剂与有机肥进行复配从而得到菌肥。此外，微肥施用效果不稳定，受施用方法、施用环境条件等诸多因素影响，阻碍了微肥行业的进一步推广和应用。

(3)微肥中PGPR不能稳定定殖

微肥中一种或多种PGPR在不同地区具有不同的生态适应能力，不同的菌株在不同的环境中受到土壤温度、土壤营养成分、土壤含水量、土壤酸碱度及土壤盐碱度等条件的影响，环境的改变使得微肥中功能菌不能稳定生长繁殖，PGPR菌株不能稳定发挥其功能甚至功能丧失，因此应该根据施用地的土壤条件和作物类型有针对性的筛选功能菌种，从而保证微肥中PGPR的有效性。目前大多数企业仍然在使用以芽孢杆菌为主的固氮、解磷解钾细菌，VA和ECM等真菌类功能菌的使用却很少。

(4)微肥产品作用机理研究不够深入

研究表明微肥中PGPR促进植株生长机制分为直接机制和间接机制，两种机制的区别主要根据机制发生部位不同而分，PGPR作用发生在植株外部为间接机制，PGPR作用发生在植株内部为直接机制，PGPR促进植物生长的直接机制还停留在生物固氮、解磷解钾、植物激素的产生吲哚-3-乙酸(IAA)、细胞分裂素(CK)、赤霉素(GAs)等研究，而间接机制研究也仅限于产铁载体、裂解酶类的产生、抗生素的产生、诱导植物系统抗性及ACCD等，而土壤微生态环境中菌与菌之间相互作用机理及菌与植物相互作用机理研究不够细化。

(5)国家微肥管理力度不够

微肥在微肥市场不断拓展的同时不少企业存在未登记和假冒伪劣产品，影响了微肥行业的声誉。

19世纪50年代一些国外科研学者发现了真菌菌丝在水晶兰(Monotro pahypopitys)根上的寄生现象，在19世纪后期Kamienski发现了这种真菌菌丝与水晶兰是共生关系并且对水晶兰有促生作用，后来Frank在松树、山毛榉和桦树也发现了这种共生真菌并且对松树也有促生作用，他将这种植物根部与真菌共生并具有促生作用的联合体称为菌根。从菌根被发现到被各国科研学者重视后相关研究进展任然很缓慢，甚至还有诸多学者认为这种共生现象是病态，但随着菌根的不断深入研究，菌根菌对植物及土壤微生态环境的好处不断被放大，尤其是在瑞典科研学者Melin肯定了这种共生关系为互利共生，在20世纪早期才有了飞速的发展，20世纪50年代人们对菌根的认识也有了新的高度，认识到了自然界中绝大多数植物都存在菌根。

ECM是真菌菌丝体包围宿主植物尚未木栓化的营养根而形成的，并且在宿主根表面、根组织内部、根周围等部位形成菌套、哈蒂氏网、外延菌丝和菌索等形态结构。菌根真菌与宿主根互利共生时，在宿主植物尚未木栓化的根系分泌物作用下，菌根真菌菌丝体生长并缠绕宿主植物未木栓化根系表面形成的套状结构称为菌套，菌套重量大约是菌根重量的30％左右，因此推测菌套不仅有吸收土壤营养及转化营养的功能，还有储藏营养物质的功能。根据菌根真菌、宿主林木和土壤物理化学性质不同形成的菌套也有所不同。相同环境下同一宿主植物的不同菌根形成菌套的厚度也不一样，菌套厚度在20-100μm之间变动，菌套较薄的在根系表面只有几层菌丝体缠绕，甚至看不到菌套，而较厚的菌套能达到50-100μm，绝大多数菌根形成的菌套厚度在35μm左右。大量菌丝体围绕营养根形成的菌套结构能有效减少病原微生物和有害物质与植物根系直接接触的面积，从而增强宿主植物的抗病能力及抗逆能力。菌丝体进入宿主植物营养根皮层内部，并在皮层细胞间生长形成的三维网络结构称为哈蒂氏网(Hartig-net)，哈蒂氏网结构是植物营养根与菌根真菌之间进行物质交换的重要结构，是从形态结构辨别外生菌根的标志性结构。外延菌丝也是外生菌根的一个重要特征之一，可以根据不同菌根的菌丝类型、粗细、菌丝细胞壁特征、分隔方式和分支方式进行分类。外延菌丝在土壤中不断生长延伸，可有效扩大宿主植物根的吸收范围从而促进植物生长。土壤中外延菌丝或菌索有助于宿主植物对水分和矿质元素的吸收。尤其是长距离的水分及营养物质的运输，大部分依赖根状菌索进行。

研究表明，内生菌根真菌出现在4-5亿年前，0.5亿年前出现外生菌根，在森林生态系统中有200科1000属的植物能形成菌根，能形成外生菌根的植物只占3％左右，但能形成外生菌根真菌的植物在森林生态系统中占地面积大，涵盖了大部分的寒带和温带的植被及75％的热带植被，龙脑香科(Dipterocarpaceae)、半日花科(Cistaceae)木麻黄科(Casuarinaceae)等许多灌木和松科(Pinaceae)、榛科(Corylaceae)、壳斗科(Fagaceae)、杨柳科(Salicaceae)、桦木科(Betulaceae)、椴树科(Tilliaceae)等许多乔木和均能形成外生菌根^[22～23]。研究表明，ECM的存在对于森林生态系统的稳定起到了至关重要的作用。特别体现在在干旱、半干旱退化森林生态系统中植物的恢复。

据目前科研学者统计表明，有49科和139属，5000-6000种真菌能和宿主植物形成外生菌根，大多数能形成菌根的真菌属于Basidiomycotin，少数为Ascomycotina和Zygomycotina亚门。目前，我国有30科，63属，仅650多种外生菌根菌。最常见的科属如：牛肝菌科(Boletaceae)、红菇科(Russulaceae)、丝膜菌属(Cortinarius)、丝盖伞属(Inocybe)、鹅膏属(Amanita)、口蘑属(Tricholoma)及豆马勃属(Pisolithus)等。随着各国学者对外生菌根真菌的研究越加深入，外生菌根资源调查研究在全球开展，不同地区外生菌根菌的种类及地理分布做了系统的调查，对外生菌根真菌的研究也从最初的菌根真菌子实体研究到形态学研究，再进化到如今的分子生物学研究，对外生菌根菌有了更准确和深入的研究。

(1)扩大宿主植物根系水分和养分吸收范围

菌根在地下微生态环境中能形成庞大的菌丝网，大量的外延菌丝有着宿主植物根毛同样的功能，将根毛不能触及的地方的水分、养分输送给宿主植物，增强了宿主植物对土壤中各种营养元素的吸收能力，特别是对磷的吸收更为明显。当土壤缺少水分、土壤水分流动性较差和植物可利用营养元素匮乏时，植物吸收营养的主控因素是根系吸收面积，而菌根外延菌丝可以很大程度扩大宿主植物根系吸收面积，外延菌丝可以穿越根系无法穿越的营养耗损区域，从而补充植物所需营养，特别是土壤中难以扩散的锌、铜等微量元素，由于营养物质的浓度梯度与吸收单元的直径成反比，如吸收单元直径较小的外延菌丝体，其周围大量及中微量元素浓度相对较高，而且菌丝体可以蔓延到一些土壤颗粒空隙中，吸收土壤颗粒中难以外释的营养。

(2)提高土壤肥力

外生菌根菌和一些解磷解钾菌细菌一样，有着能把土壤难溶性磷钾转化为可溶性磷钾的能力，溶磷溶钾基质也大相径庭，依靠自身特殊酶系，分泌草酸、乳酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸等有机酸和氢离子。有机酸鳌合金属离子Fe³⁺和Al³⁺使Fe-P、Al-P鳌合物中释放可溶性磷，从而将难溶性磷钾转化为植物可吸收利用的磷钾元素。徐冰等研究表明外生菌根真菌能分泌泌草酸、乳酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸等有机酸，这些有机酸与难溶性磷的转化有存在显著相关性，并且外生菌根真菌不同分泌有机酸种类及含量不同。Cromack也证明了外生菌根菌能分泌如草酸等有机酸，不仅降低了菌根际的pH值，而且对菌根际难溶性矿物有一定的酸化腐蚀作用，加快了磷元素的释放^[37]。Criffith研究认为，含菌根根际土壤与非菌根根际土壤相比，前者中所含有机酸和速效磷含量高于后者。Schimel研究表明目标植物接种菌根菌后可增加土壤磷酸酶活性，促进土壤有机磷的水解。有的菌根能够分泌硝酸还原酶直接吸收NH⁴⁺态氮和NO^3-态氮，为宿主提供生长必须的氮素。

外生菌根菌能活化土壤无效钾，张亮等研究了外生菌根真菌对土壤钾的活化作用结果表明，供试外生菌根真菌能不同程度的活化土壤无效钾，其活化能力可能与分泌氢离子和有机酸尤其是草酸密切相关，以土壤为钾源培养菌根真菌，培养液中的钾浓度显著提高，并且培养液中检测到了苹果酸、丁二酸和柠檬酸。外生菌根真菌分泌H^十和草酸，H^十能取代2:1型粘粒矿物晶层和晶格内的钾，草酸能络合AlO八面体品格中的Al⁺³、Mg⁺²、Fe²⁺等离子，使2:l型粘粒矿物风化分解，导致钾离子释放。大量试验证明，带有菌根菌的苗木中P，N，K，Ca，Mg，Na等的含量比对照高。由此可见，菌根能够显著提高土壤肥力。

(3)提高植物抗逆性

提高宿主植物抗旱性的主要机制在于植物菌根化后扩大了根吸收面积，降低了植物与土壤间的流体阻力。另一方面菌根真菌菌丝能分泌大量的粘性胶质能团聚土壤微粒，这种团聚体有着一定的保水能力和储存养分能力，在干旱胁迫下对土壤水分和养分有一定的调节作用，从而提高植物抗旱性，吴炳云研究水分胁迫下外生菌根对油松容器苗的影响，结果表明，接种外生菌根菌可以促进宿主植物的生长，提高苗木的叶水势，在土壤水势为-4.0MPa下，苗木的针叶水势平均比对照高出0.75MPa。程玉娥在外生菌根真菌提高杨树抗旱性的研究表明干旱胁迫使杨树叶片的含水量下降，超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、游离脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量升高。但相同时间、相同胁迫水势下，接种B.l和S.b的杨树叶片含水量、SOD活性、CAT活性、游离脯氨酸含量均显著高于CK。杨艳在外生菌根真菌提高油松抗旱性的研究中采用PEG-6000模拟干旱胁迫，随着PEG浓度的增加和胁迫时间的延长，接种过的油松苗枯萎速度慢于CK，程度也较轻。

Colpaert等人发现菌根菌能减少重金属对宿主植物的胁迫。黄艺等人认为外生菌根真菌菌丝细胞壁对重金属有固定作用，外生菌根菌能分泌富集重金属离子的草酸形成草酸盐结晶。冯欢在研究外生菌根真菌Leucoagaricussp.对青杨雌、雄株铅耐受性的影响中表明青杨接种外生菌根真菌时，铅胁迫对青杨干物质积累的抑制作用降低，在铅胁迫下接种菌根菌时，雄株叶片中的MDA含量相比于非接菌组都下降，青杨叶片SOD、CAT、亚铁血红素蛋白(APX)的活性都得到显著提高。

磷是植物生长所必需的元素。土壤中核酸、植酸和卵磷脂等为植物不可直接利用的有机磷，而土壤中的磷酸镁、磷酸钙和磷灰石等为植物不可直接利用无机磷。在我国可耕作土壤中全磷的含量高于可溶性磷含量，呈难溶有机磷或无机磷状态存在，不能被植物直接的进行吸收利用。目前农业生产中，主要是通过向土壤中施入磷肥来满足植物生命活动所需磷元素。但就目前情况而言，磷肥的使用弊端逐渐显现，比如随着磷肥的使用磷矿资源不断减少和衰竭。另一方面，施用大量的磷肥后利用率不高，随土壤流失而进入水体中，水体中过多的磷会污染水源。同时伴随着农用磷肥的施入其参带的部分重金属元素也随之进入土壤引起土壤重金属污染。

目前已知解磷菌种类甚多，有欧文氏菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、沙雷氏菌属、肠细菌属、微球菌属、黄杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、节细菌属、固氮菌属、氧化硫属、埃希氏菌属、多硫杆菌属、色杆菌属和产碱菌属等等。研究表明，耕地土壤生态系统中的有机磷解磷细菌主要为芽孢类杆菌，而假单胞菌属和芽孢杆菌属除了存在于林地和菜地外还主要存在于豆科植物根际。另外，大部分研究发现，非根际土壤中的磷细菌种类与数量都相对较少，有机磷细菌比无机磷细菌在数量上差异显著，有机磷细菌相对较多。

土壤中的非溶性磷源被PGPR分解后除了供植物利用外，一部分还会存于微生物体内。非溶性磷源被分解后的总磷量主要取决于土壤中PGPR的数量。土壤PGPR胞内量磷占全磷量的2％-23％，占有机磷的5％-50％。在土壤微生态系统中微生物所含总磷量是评价土壤磷的一个重要指标。微生物所含总磷量一般都比作物体含磷量高，所以土壤微生态系统中的微生物所含总磷量的循环足以满足植物生长对磷的需求。

解磷微生物在其生命活动过程中分泌有机酸、琥珀酸、乳酸、柠檬酸和延胡索酸等有机酸鳌合Ca²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Al³⁺等离子，使不溶性磷酸盐溶解。范丙全研究表明其筛选的两株菌青霉菌P8和Pn1对骨粉、Ca₃(PO₄)₂、Ca₈H₂(PO₄)₆₅H₂O、CaHPO₄和FePO₄的有较强溶解能力，并且氮源对两株菌的溶磷能力有较大影响，在不同氮源培养基中两株菌代谢产生有机酸的方向不同，在供应铵态氮时P8能分泌苹果酸、乙酸、丙酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸。而供应硝态氮时不产生这些有机酸，说明解磷细菌对难容性磷的降解机制不只一种。Illmer等研究同样证明了这一说法，其研究的3种解磷细菌中都能溶解羟磷灰石等无机磷，但其机理并不是解磷菌在生命活动过程中代谢产物有机酸发挥功效，而是通过自身呼吸作用或NH₄ ⁺同化作用产生质子溶解难溶性无机磷。王莉晶利用高效液相色谱仪对解磷细菌进行了解磷机制的初步探究，结果表明解磷菌在难溶性磷存在的条件下生长，能分泌出8种有机酸。

土壤中有机磷占土壤全磷的40％左右，它包括磷酸肌醇、磷脂、核酸及少数磷蛋白和核酸糖以及微生态磷等。一般情况下，这些磷素必须经过降解、矿化才能被植物吸收利用。微生物在代谢过程中可产生各种酸性或碱性磷酸酶类，如植酸酶和核酸酶等，从而使磷酸酯等有机磷酸盐水解转化为植物可以吸收和利用的可溶性磷。研究表明，将解有机磷细菌接种到以RNA和DNA为唯一磷源的培养基中培养，在24h后检测到培养基中有核苷酸，10天后检测到正磷酸盐。微生物细胞可以固持土壤可溶性磷酸盐，当微生物细胞死亡时其所固持的有效性磷酸盐又重新回到土壤，解磷微生物降解难容性磷含量应包括自身所利用的有效态磷。Turner等研究表明微生物细胞裂解后可增加土壤水溶性磷含量。研究表明细菌、真菌及放线菌胞内磷含量存在差异，其中细菌和放线菌胞内磷含量占自身干重的1.5％-2.5％，真菌高达4.8％，而植物体胞内磷含量只有0.5％-1％。

针对于钾细菌的研究，于20世纪30年代，苏联学者亚历山大罗夫首次从土壤中筛选分离到钾细菌，并具有一定解钾能力。土壤中大量元素钾含量最为丰富，平均含量为2.5％，但植物却不能直接利用，土壤富钾然而又缺钾，大多以长石和云母等形式存在，其化学性质极其稳定，因此，硅酸盐细菌使长石和云母中钾的释放是解决植物在富钾土壤中却不能吸收钾素的必要过程。目前，能分解土壤中沉积硅酸盐类矿物的途径唯有解钾菌高效经济，因此超能力解钾菌的筛选对发展绿色经济、生态文明具有深远意义。研究表明，钾细菌大多属于胶质芽胞杆菌，它除了对钾矿物元素有利用能力，将钾矿物分解为可溶性钾外，对非溶性磷也有一定分解能力。陈华癸和陈廷伟先生认为，硅酸盐细菌主要依靠自身大英膜包裹钾长石或云母，产生特异性酶破坏晶体结构，从而将非溶性钾转换为可溶性钾供植物和自身利用。所以钾细菌肥施入不仅为只植物提供速效钾元素外，还能改造土壤中钾长石、云母等矿石的结晶构造的作用，从而有促进植物对大量元素钾的吸收。目前微肥的生产应用中解钾PGPR已是不可或缺的功能菌，大田试验证明它能在种子或作物根系周围能迅速释放钾磷元素供植物利用，同时具有固氮和解磷功能。

通过微生物作用释放长石或云母等矿石中钾素的主要机理可分为有机酸酸解、荚膜多糖作用和酶解，酸解中起主要作用的酸碳酸、硝酸、硫酸和乳酸、羟基乙酸等有机酸，一些异样微生物能产生CO₂与土壤水分子形成碳酸，大量不产酸类微生物能无机酸促使难容性钾的释放，加快难溶性钾矿石的风化，陈华癸等人则认为硅酸盐细菌能利用自身大英膜包裹矿石，通过硅酸盐细菌自身酶系酶解矿石晶体释放钾，盛下放认为硅酸盐细菌NBT菌株通过产生有机酸、氨基酸、多糖酸解或络合作用形成配位化合物释放矿物钾，连宾等人则认为，硅酸盐细菌作用矿物钾的过程中首先是胞外多糖和矿物钾结合形成细菌-矿物钾复合体，细菌不断产生溶蚀作用将大颗粒矿物钾溶蚀为小颗粒矿物钾，其次细菌生命活动过程中产生的次级代谢产物对矿物钾进行进一步降解使矿物钾颗粒晶格发生崩解释放钾离子。

细胞包埋固定化技术是指将功能性微生物包埋固定于天然高分子聚合物或有机合成高分子物质中形成相对封闭的微环境的一种技术。被包埋微生物与外界环境有着一定的隔绝效应，微生物在包埋环境下能保持高活性和稳定增值，保证了微生物的存活和与土著菌的生态竞争。包埋颗粒本身具有三维孔状结构，能与外界环境进行物质交换，保证了被包埋菌的定值和形成优势菌群。

(1)天然载体材料

活性污泥是水处理工程中应用得最多的天然微生物载体。天然无机类载体材料主要是沙粒、沸石硅藻土等。它们由于密度较大、实现流化困难、微生物吸附有限、易脱落等原因，使用受到一些限制。天然有机载体应用和研究较多，其主要成分为多糖，如聚γ-谷氨酸、纤维素及其衍生物、琼脂、角叉莱胶、海藻酸盐、卡拉胶、聚乙烯醇等，天然有机类载体普遍具有良好的生物相容性，一般对生物无毒性，但强度较低，传质性能不佳，易被微生物分解，因而使用寿命短。

(2)合成高分子载体

由于高分子材料用于细胞固定时形成颗粒机械强度低且易被分解、使用寿命等诸多缺陷，研究方向从天然高分子材料倾向于有机合成高分子材料，该类材料应用较多的主要是聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氨酯、羧甲基纤维素等。Siripattanakul等通过对比应用聚乙烯醇(PVA)固定的土壤杆菌与游离的土壤杆菌对污染农田的生物修复，发现固定化菌比游离菌更有效降解了阿特拉津农药残留物，并明显地降低了其扩散率，同时减少了菌体的流失。

(3)人工无机载体材料

多孔陶瓷、活性炭、微孔玻璃、泡沫金属等人造无机载体，大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应把微生物固定。该类材料通常具有力学强度大、对微生物无毒性、不易被微生物分解、寿命长等特性，是一类重要的载体材料。无机载体内部有着良好的孔结构和很高的孔隙率，可以容纳不断增殖的微生物，使载体内细胞浓度增大，提高了处理效率。特别是介孔分子筛由于具有规则的孔道、大的比表面积、气液传质速率高等特点，近年来在固定化技术中体现出得天独厚的优势。

(4)复合载体材料。

由于有机载体材料和无机载体材料各有优缺点，而两类材料在许多性能方面互补，因此，利用组成和结构可调控的有机聚合物对传统无机载体材料进行改性修饰，制备兼具两者优良特性的复合载体用于微生物的固定化研究，受到了众多学者的青睐。廖强等以硼酸为交联剂制备了PVA－海藻酸纳透明颗粒，并将该透明颗粒应用于光合细菌固定化产氢的研究中，取得了很好的效果。

目前细胞固定化方法主要是吸附法和包埋法。包埋固定化技术最初应用于生物化学领域，主要包埋活性蛋白或一些大分子物质，后来推广应用到微生物细胞的包埋。固定化细胞时应满足一下特点：(1)固定细胞和载体结合条件温和；(2)所使用的载体材料便宜易得；(3)载体性能稳定，对细胞无毒性；(4)固定化细胞具有良好的稳定性；(5)细胞在载体中能均匀分布；(6)可以控制固定化细胞颗粒的大小；(7)固定化细胞颗粒传质阻力较低，对大分子底物自由进出的影响较小。

(1)包埋法

包埋法是用物理或化学的方法将功能微生物包埋于三维孔状凝胶颗粒中使细胞得到固定。常用的凝胶载体有海藻酸钠(sodium alginate，SA)、聚乙稀醇(polyvinylalcohol，PVA)、卡拉胶(carrageenan)、琼脂(agar)、聚丙稀酰胺(polyacrylamideammonium，ACRM)、醋酸纤维(acetate)、明胶(gelatin)等。田春华用聚γ-谷氨酸及明胶等天然化合物为壁材通过凝聚相分离法以及喷雾干燥技术对Bt进行微胶囊化研究，制备Bt胶囊菌剂最佳工艺条件为Bt原粉为5％，壁材浓度1.6％，明胶：聚γ-谷氨酸为1:1，pH4.0，温度40℃，甲醛0.6ml/g明胶，包埋率为89.2％。并且用紫外线和热处理胶囊菌剂研究其抗逆性发现Bt胶囊可显著增加Bt对热处理及紫外照射的抗逆性。韩梅将大豆根瘤菌和溶磷解钾固氮菌包埋于SA-PVA混合胶中，包埋率高达93％左右，活菌释放率90％，机械强度为55g/g左右。包埋颗粒菌剂抗力性和对大豆促生作用显著高于草炭粉剂和液体菌剂。薛振文将褐环乳牛肝菌(S.luteus)和圆褐固氮菌包埋固定于海藻酸钠(SA)中，结果表明：在海藻酸钠中添加椰蓉和泥炭为适宜的承载物，固化剂浓度为5％-7％之间最佳，固化时间为10min为宜，并接种油松幼苗显示包埋菌剂促生效果优于单一接种。

(2)其他细胞固定化方法

目前市面微肥大多用的固定方法是吸附法，吸附法是将PGPR与硅藻土、活性炭、草炭、高岭土、多孔砖、木屑、离子交换树脂、陶瓷、硅胶多孔玻璃、纤维素等通过载体对细胞亲和性或静电引力固定细胞的方法。吸附法操作简单，反应条件温和，对细胞无毒无害，缺点是结合不牢固，细胞易脱落，因细胞和土壤环境直接接触受环境变化因素影响大。

除了吸附法外，还有结合法和交联法两种固定化方法，这两种方法在固定化是反应剧烈，所用材料毒性大，是细胞存活率低，所以不适用于活细胞的固定化。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有的固定化方法存在反应剧烈，所用材料毒性大，细胞存活率低，所以不适用于活细胞的固定化。

解决上述技术问题的难度：

(1)固定化材料种类的选择和配比，既要保证成品所需要的物理性状，也不能抑制微生物的正常生存。

(2)配料的选择及比例，通过添加辅料进一步改善成品的性能和微生物生存的胶囊内环境。

解决上述技术问题的意义：近年来，我国西部干旱半干旱地区的林业建设取得了很大成绩。但造林成活(保存)率不高，林分生长不良，稳定性不强，以及森林经营粗放的情况仍相当普遍。在西部干旱区生态植被建设过程中，水分和土壤贫瘠是植被恢复的主要制约因素，而大量研究表明，在干旱区、荒山荒地、侵蚀地、盐碱地、草原、矿区等严重退化生态系统中一般都需要依靠相应的菌根真菌才能建立起植被或实现造林。新型微生物肥料的研发和应用大多集中在农业和园艺蔬菜果树领域，而在林业中的试验研究和推广应用相对较少，使得菌根真菌类复合微生物肥料的开发和应用对于中国林业的可持续发展显得尤为重要。目前市面微生物肥料大多为液体剂和粉剂为主，但微生物与载体结合不牢固，细胞易脱落，裸露在土壤环境中，受环境变化的影响较大，而胶粒剂可以包埋较多的细胞，短时间内获得较高细胞浓度，细胞能均匀地分布在凝胶网格内，包埋后固定化细胞的微环境适于细胞生长，能快速增殖。而市面上将外生菌根菌和细菌类PGPR混合的菌肥少之又少。所以本发明的目的在于将多种菌根菌及PGPR菌包埋固定，并优化胶粒制作工艺，以期得到理想的复合菌根肥。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种复合菌根生物肥及其制备方法和应用。

本发明是这样实现的，一种复合菌根生物肥的制备方法，所述复合菌根生物肥的制备方法包括以下步骤：

第一步，将保藏的菌种用固体活化培养基活化，挑取单菌落按照分组内的成员菌两两交叉三区划线到同一培养基平板上培养，30℃培养3天，3次重复；将无拮抗菌株和菌根真菌接入到各自的液体培养基中，放入摇床中在各自的最优培养条件下振荡培养，培养至发酵液中有效活菌数为2×10⁹个/ml以上，10000rpm离心后用，菌根真菌培养至最大菌丝量时停止培养，待用。

第二步，于35℃下，以海藻酸钠浓度3％与聚乙稀醇浓度3％组合配比，配制溶液100ml，称取菌根真菌菌丝和复合功能细菌菌体各2g加入以上不同浓度配比的100ml包埋剂溶液，于恒温磁力搅拌器上振荡混均，用注射器按照一定的速度均匀滴加到含有3％CaCl₂的饱和硼酸溶液中，交联30min，滤出颗粒，用无菌生理盐水洗涤数次；颗粒置于无菌生理盐水中，4℃保藏。

第三步，选择包埋效果较好的浓度及配比为主料组合，添加0.5％生物炭，于35℃下配制成溶液100ml，121℃灭菌20min，冷却至35℃，取复合功能细菌和菌根真菌菌体各2g，加入包埋剂溶液中，于恒温磁力搅拌器上混均，用注射器按照一定的速度均匀滴加到含有3％CaCl₂的饱和硼酸溶液中，交联30min，滤出颗粒，用无菌生理盐水洗涤数次；颗粒置于无菌生理盐水中，4℃保藏。

进一步，所述复合菌根生物肥的制备方法中活菌数为0.98×10⁹个/g，菌根菌萌发率100％；交联时间60min。

本发明的另一目的在于提供一种由所述复合菌根生物肥的制备方法制备的复合菌根生物肥。所述复合菌根生物肥由菌根真菌、植物生长促生细菌、生物碳和成型所用胶组成；海藻酸钠(SA)3％—聚乙稀醇(PVA)3％(均为化学纯，用前取一定量分别溶于热水，121℃灭菌20min，冷却至约35℃恒温备用。

本发明的另一目的在于提供一种由所述复合菌根生物肥制备的微生物制剂。

本发明的另一目的在于提供一种所述复合菌根生物肥在解磷解钾固氮中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述复合菌根生物肥在虫害防治中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：农业部将微生物肥料和制剂列入生物农业绿色种植和生物环保技术重要产品，微生物肥料得到迅速发展。因长期使用化肥导致的土壤肥力降低、土壤板结、环境污染等诸多短板被逐渐放大，绿色环保已深入人心，在农林业发展中越来越青睐于微生物肥料和有机肥的使用。为了方便保存及运输市面微肥大多是以芽孢杆菌为主的粉剂。为此，本发明功能菌系和外生菌根真菌混合包埋固定化研究及包埋固定化颗粒对油松幼苗促进作用。

对试验室筛选所得6株菌株进行了拮抗性试验，菌株243和331、133和3532存在相互拮抗作用，确定能共处菌株组合为343、3532和224。包埋主料基本浓度及配比试验中初步确定SA3％-PVA1％，SA3％-PVA2％，SA3％-PVA3％三组浓度配比在操作性、成球性、传质速率及机械强度是其余浓度配比中最好，活菌数分别为3.5×10⁸个/g、9.5×10⁸个/g、1.62×10⁹个/g，且菌根菌萌发率均为100％。在最佳浓度配比SA3％-PVA3％中添加0.5％生物炭后，成球更规则，很少出现拖尾，机械强度比不加炭提高了0.02％，包埋率提高了3％，传质速率1时所需时间为5min，比不加生物炭降低了2min，在不同交联时间下未加生物炭组合SA3％-PVA3％活菌数始终高于SA3％-PVA3％+0.5％生物炭活菌数。SA3％-PVA3％+0.5％生物炭在30min、60min时活菌数分别为1.61×10⁹个/g、0.98×10⁹个/g。活菌数已达到国家标准要求。选择交联时间为30min或60min。SA3％-PVA3％+0.5％生物炭在60min时菌根菌萌发及长势最好。结合菌根菌长势，故交联时间为60min。颗粒菌剂菌体的耐盐性、耐酸碱性及耐抗生素性等均优于粉剂和液体剂，但NaCl浓度≥3％时可使颗粒菌剂崩解。不同处理对油松幼苗生物学性状和物质积累有着明显的促进作用，处理VII对油松促生长效果最佳。

附图说明

图1是本发明实施例提供的复合菌根生物肥的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的粉剂菌剂制作流程图。

图3是本发明实施例提供的各菌株交叉划线平板生长情况示意图；

图中：2号：343；3号：331；4号：133；5号：3532；6号：224；7号：4447。

图4是本发明实施例提供的包埋颗粒成球情况示意图。

图5是本发明实施例提供的褐环乳牛肝菌菌丝活力测定示意图。

图6是本发明实施例提供的8d时菌根真菌包埋颗粒萌发情况示意图。

图7是本发明实施例提供的交联时间胶粒内功能细菌活菌数影响示意图。

图8是本发明实施例提供的交联时间对菌根真菌萌发影响示意图。

图9是本发明实施例提供的载体对功能细菌耐盐性的影响示意图。

图10是本发明实施例提供的载体对功能细菌耐酸性影响示意图。

图11是本发明实施例提供的载体对功能细菌耐抗生素影响示意图。

图12是本发明实施例提供的褐环乳牛肝菌与油松形成的外生菌根外部形态图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种复合菌根生物肥及其制备方法和应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的复合菌根生物肥由菌根真菌、植物生长促生细菌、生物碳和成型所用胶组成。菌根真菌菌丝和复合菌体各2g(湿重，培养液10000rpm离心3min取沉淀菌体)后用加入100ml包埋剂溶液中。菌根真菌是褐环乳牛肝菌Suillus luteus li1；促生细菌是3532：Phyllobacterium myrsinacearum(紫金牛叶杆菌)、133：Klebsiella sp(克雷伯氏菌)、WN34：Bacillus methylotrophicus strain(甲基营养杆菌)、4447：Arthrobacterscleromaestrain(巩膜节杆菌)、LGYP224：Bacillus subtilis strain(枯草芽孢杆菌)；褐环乳牛肝菌由实验室从油松菌根中分离获得；促生细菌是3532：Phyllobacterium myrsinacearum(紫金牛叶杆菌)、133：Klebsiella sp(克雷伯氏菌)、WN34：Bacillus methylotrophicus strain(甲基营养杆菌)、4447：Arthrobacterscleromaestrain(巩膜节杆菌)、LGYP224：Bacillus subtilis strain(枯草芽孢杆菌)都有实验室分离自接种了Suillus luteusli1的油松菌根际土壤分离获得。并通过形态学和分子生物学手段鉴定。

本发明实施例提供的所有菌株都保藏于生命科学学院实验室内，具体如下：

平台编号：bio-31679＝cfcc87827，中文名称：褐环乳牛肝菌，拉丁名称：Suillusluteus。

平台编号：bio-85243＝CCTCC2014337＝ACCC03242，中文名称：甲基营养型芽胞杆菌，拉丁名称：Bacillus methylotrophicus。

平台编号：bio-19496＝cfcc10462，中文名称：紫金牛叶瘤杆菌，拉丁名称：Phyllobacterium myrsinacearum。

平台编号：bio-34854＝ACCC 02056，中文名称：巩膜节杆菌，拉丁名称：Arthrobacterscleromae。

平台编号：bio-52746＝CMCC 63501＝ATCC 6633，中文名称：枯草芽孢杆菌，拉丁名称：Bacillus subtilis；

平台编号：bio-15742＝ACCC02815，中文名称：克雷伯氏菌，拉丁名称：Klebsiellasp。

如图1所示，本发明实施例提供的复合菌根生物肥的制备方法包括以下步骤：

S101：将保藏的菌种用固体活化培养基活化，挑取单菌落按照分组内的成员菌两两交叉三区划线到同一培养基平板上培养，30℃培养3天，3次重复；将无拮抗菌株和菌根真菌接入到各自的液体培养基中，放入摇床中在各自的最优培养条件下振荡培养，培养至发酵液中有效活菌数为2×10⁹个/ml以上，10000rpm离心后用，菌根真菌培养至最大菌丝量时停止培养，待用；

S102：于35℃下，以海藻酸钠浓度3％与聚乙稀醇浓度3％组合配比，配制溶液100ml，称取菌根真菌菌丝和复合功能细菌菌体各2g加入以上不同浓度配比的100ml包埋剂溶液，于恒温磁力搅拌器上振荡混均，用注射器按照一定的速度均匀滴加到含有3％CaCl₂的饱和硼酸溶液中，交联30min，滤出颗粒，用无菌生理盐水洗涤数次；颗粒置于无菌生理盐水中，4℃保藏；

S103：选择包埋效果较好的浓度及配比为主料组合，添加0.5％生物炭，于35℃下配制成溶液100ml，121℃灭菌20min，冷却至35℃，取复合功能细菌和菌根真菌菌体各2g，加入包埋剂溶液中，于恒温磁力搅拌器上混均，后续操作同上。

本发明以SA、PVA混合胶包埋固定褐环乳牛肝菌和复合功能细菌，最终确定包埋剂SA、PVA浓度及配比为SA3％-PVA3％，生物炭添加量为0.5％。该组合下胶粒操作性、成球性、传质速率及机械强度最优。活菌数为0.98×10⁹个/g，菌根菌萌发率100％。交联时间60min为宜。

下面结合试验对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、材料与方法

1.1供试菌株

细菌：解无机磷菌：3532、133；固氮菌：WN343、4447；解有机磷菌：331、LGYP224。真菌：褐环乳牛肝菌li1。

细菌：解无机磷菌：3532、133；固氮菌：WN343、4447；解有机磷菌：331、LGYP224。真菌：褐环乳牛肝菌li1由内蒙古自治区森林培育林木菌根生物技术重点试验室提供。

1.2培养基

解有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，卵磷脂0.2g MnSO₄·4H₂O 0.03g，CaCO₃5g，琼脂15g。

解无机磷培养基：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，CaCO₃5g，Ca₃(PO4)₂10g，琼脂15g。

固氮培养基：葡萄糖10g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO₃5g，琼脂15g。

Pachlewski培养基：葡萄糖2％，酒石酸铵0.25％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，麦芽汁1.5％，柠檬酸铁0.003％，微量元素1mL，0.004％VB1mL，琼脂1.6％，自然pH值。

1.3供试材料及试剂

生物炭：生物炭三维网状空隙发达，具有良好的吸附性及增加土壤养分能力。

腐熟羊粪：富含有机质及多种营养元素；包埋剂：海藻酸钠(SA)、聚乙稀醇(PVA)(均为化学纯，用前取一定量分别溶于热水，121℃灭菌20min，冷却至约35℃恒温备用；交联剂：CaCl₂、H₃BO₃均为分析纯。用水稀释成一定浓度溶液，121℃灭菌20min；包埋颗粒制备器：医用注射器或滴管。供试植物：油松。

1.4试验方法

1.4.1菌株的培养及菌株拮抗性试验

将保藏的菌种用固体活化培养基活化，挑取单菌落按照分组内的成员菌两两交叉三区划线到同一培养基平板上培养，30℃培养3天，3次重复。每天观察菌落形成及划线交叉点处的细菌生长情况，判断菌株间是否存在拮抗。若交叉点出两菌均有生长，则说明两菌间不拮抗，或彼此有促进作用；若交叉点处两种菌落都不长或生长较差或只有一种菌落，另一种菌不生长，均说明二者间存在拮抗。将无拮抗菌株和菌根真菌接入到各自的液体培养基中，放入摇床中在各自的最优培养条件下振荡培养，培养至发酵液中有效活菌数为2×10⁹个/ml以上，10000rpm离心后用，菌根真菌培养至最大菌丝量时停止培养，待用。

1.4.2胶粒型复合菌肥的制作

于35℃下，以SA浓度1％、2％、3％与PVA浓度1％、2％、3％一一组合成个9浓度配比，配制溶液100ml，称取菌根真菌菌丝和复合功能细菌菌体各2g加入以上不同浓度配比的100ml包埋剂溶液，于恒温磁力搅拌器上振荡混均，用注射器按照一定的速度均匀滴加到含有3％CaCl₂的饱和硼酸溶液中，交联30min，滤出颗粒，用无菌生理盐水洗涤数次；颗粒置于无菌生理盐水中，4℃保藏。

1.4.2.1胶粒机械强度的测定

取大小一致的包埋颗粒4粒，呈正方形摆在一玻璃板上，在其上放一个玻璃皿，慢慢向玻璃皿里添加破码，直至颗粒完全变形，记录使颗粒完全变形的玻璃皿及所加按码总重1/4为每颗包埋颗粒承重量，以此来表示小球的机械强度。

1.4.2.2胶粒传质速率的测定

取大小相同的包埋颗粒浸没于惰性红墨水中，每隔一分钟取出数粒查看是否完全变红，记录颗粒完全变红所需时间。

1.4.2.3胶粒内外生菌根真菌菌丝活力测定

随机取不同处理的胶粒15粒接入Pachlewski平板培养基中为一个重复，重复3次，从接种第2天起每隔1天观测胶囊的萌发数并记录，取至第16天，共观测8次。

萌发率(％)＝萌发数/接种总数×100％。

1.4.2.4胶粒功能细菌活菌数的测定

称取新鲜包埋颗粒1g于0.2mol/L的柠檬酸钠溶液中，定容至10ml，以旋涡式振荡器充分振荡至颗粒完全溶解，目的使菌体释放完全，用稀释平板法计算活菌数，按下列各式计算各项指标：单位质量颗粒活菌数＝(一定稀释度的活菌数×稀释倍数×菌液量)/颗粒重；包埋率＝(颗粒中包埋的活菌数/总活菌数)。

1.4.2.5生物炭对胶粒肥物理特性的影响

前面的试验基础上，选择包埋效果较好的浓度及配比为主料组合，添加0.5％生物炭，于35℃下配制成溶液100ml，121℃灭菌20min，冷却至35℃，取复合功能细菌和外生菌根真菌li1菌体各2g，加入包埋剂溶液中，于恒温磁力搅拌器上混均，后续操作同上。

观察添加辅料后包埋过程的操作性、成球性，测定包埋颗粒机械强度、传质速率，颗粒活菌数、包埋率、增值倍数及菌根真菌萌发率。比较添加辅料前后颗粒基本性能之间的差异。

1.4.2.6交联时间对胶粒内功能细菌活菌数的影响

设定固化时间10min、30min、60min、90min为4个处理。测定固化不同时间后胶囊菌剂活菌数变化。

1.4.2.7交联时间对褐环乳牛肝菌萌发的影响

设定固化时间10min、30min、60min、90min为4个处理。测定固化不同时间后胶囊菌剂真菌萌发数变化。

1.4.3复合功能细菌肥制作

将1.4.1中得到的3株无拮抗菌株经液体培养后分别按体积1:1:1混合离心后重新悬浮(2×10¹⁰个/ml)，按体积2:8吸附于灭菌的(生物炭：腐熟羊粪＝1:24混合)载体上，搅拌均匀后置于避光阴凉干燥处，有效活菌数为2.0×10⁹个/g，制作流程图2。

1.4.4复合液体菌肥的制作

液体菌根生物肥的制作：平皿中取生长旺盛的菌丝体十小块，接入装有200ml液体培养基的500ml三角瓶中，25℃摇床(160r/min)振荡培养15天，粉碎，过滤菌丝体，重新容于100ml生理盐水，备用。

复合液体功能细菌菌肥的制作：取343、3532、224的保藏菌种，分别在1/2R2A培养基上四区划线，30℃培养24小时，带长出菌落后，挑取单菌落接入1/2R2A液体培养基中，30℃摇床(180r/min)震荡培养24小时，将经液体培养的菌株发酵液按体积1：1：1混合离心后用生理盐水重新悬浮。

1.4.5载体对功能细菌抗逆性的影响

以1.4.3、1.4.4中制作的复合微生物有机肥和复合液体功能细菌菌肥为对照，对胶粒型复合功能细菌菌肥(无菌根菌)进行抗逆性测试。

1.4.5.1耐盐性

NaCl设5个浓度处理：0％、1％、3％、5％、7％。各菌剂均按1％接种量接入液体培养基中培养24h，测定培养液OD600吸光值，每个处理3次重复。

1.4.5.2耐酸碱性

pH设7个处理：4.0、5.0、7.0、8.0、10。方法同1.4.5.1。

1.4.5.3耐抗生素性

抗生素设5种处理：青霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素，以不添加抗生素的培养基为对照，其余步骤同1.4.5.1。

1.4.6复合微生物肥对油松幼苗促生效应研究

1.4.6.1试验设计

共设9个处理，每个处理20次重复。

表1 复合微生物肥对油松幼苗肥效试验设计

种子处理：将油松种子40-50℃温水浸泡1-2天，倒掉飘浮在上层的种子，用30％H₂O₂消毒20min，用流水冲洗数次后置于25℃培养箱，待30％～45％种子露白时播种。

育苗基质及幼苗培育：育苗基质选用蛭石：沙土为1:1混合基质，调节基质含水量为40％左右装袋，高温高压1.01×10⁵Pa下灭菌30min，重复两次，冷却后用于播种油松露白种子。

幼苗接种及培养：油松幼苗培养30天后，选择长势均一的幼苗用于试验幼苗。先在育苗杯底垫一沉4cm厚的无菌基质，将菌剂置于杯底无菌基质上，每杯接种量为3g，以不接菌剂为对照。将小苗置于杯内，用基质填满育苗杯后压实，浇透水，置于光照度为1.9×10⁴LX光照培养架。光期12h·d^-1，温度23～25℃。

1.4.6.2菌根感染率测定及菌根形态观察每个处理随机抽取10杯苗木，洗净后将菌根切成2厘米长根段后，随意取若干段进行菌根统计。

菌根感染率(％)＝菌根数/总根数×100％。

菌根形态观察：用自来水将苗木的根部冲洗干净，剪取细根根段，在实体显微镜下观察菌根的外部形态。

1.4.6.3苗高、干重和地径的测定

生物量的测定：每个处理随机抽取10杯苗木，洗净后分别置于80℃烘箱中烘干至恒重，1/10000电子天平上准确称量。苗高、地径的测定：直尺和游标卡尺测定。

1.4.6.4土壤速效N、P、K含量及有机质含量测定

土壤有机质采用重铬酸钾容量法进行测定，土壤速效氮采用碱解扩散法进行测定，土壤速效磷采用钼锑抗比色法进行测定，火焰光度法测定钾含量。

1.4.6.5土壤可培养微生物数量

称取2g油松幼苗根围育苗基质，加无菌水至20ml，按10倍稀释法稀释至10-3、10-4、10-5，每个梯度三个重复。取稀释后的土壤悬浊液各0.1ml，均匀涂布于细菌、真菌和放线菌固体培养基中，培养3天后，计数。

1.4.6.6油松幼苗针叶N、P含量的测定

针叶全氮含量采用凯氏定氮法。全磷和全钾含量采用H₂SO₄-H₂O₂法消煮，以钼锑抗比色测定全磷量。

1.4.7数据处理

采用Excel和Stst系统分析软件进行数据分析

2、结果与分析

本试验以SA及PVA的混合胶包埋外生菌根真菌和复合功能菌，并确定SA和PVA的最佳浓度配比及交联时间，避免了液体菌剂及草炭吸附菌剂施入土壤后菌体被直接暴露在开放、多变的土壤环境下导致菌体的大量死亡，不易形成优势菌群难以发挥菌剂的应有效果的缺点，包埋法是将微生物包埋在富含营养、对外部环境相对封闭、有缓冲作用的颗粒中，有利于微生物增殖，易于形成优势菌群，有利于人工接种微生物的存活和与土著菌的生态竞争，可以更大限度地发挥人工接种菌剂的作用。

目前，微生物的包埋主要以SA包埋为主，易于操作，成球性好，但机械强度较低，施入土壤后的容重性差，而PVA包埋法操作难度大，成球性较差，易粘连成片，且容易吸水膨胀，但机械强度较高，成本低。为了克服单种材料包埋的不足，本试验以海藻酸钠配合聚乙稀醇为包埋剂主料对复合菌体及外生菌根真菌进行包埋固定，以进一步提高包埋菌剂的综合性能。

2.1菌株拮抗性试验及功能菌株的选择

由图3可知，试验室所得6株促生功能菌中2号菌种与3号、4号菌种在交叉点均不生长，菌落延直线两边延伸，说明2-3、2-4菌株之间存在相互拮抗作用，3-4菌株交叉点之间4号不生长，说明3号菌株对4号菌株有拮抗作用，微生物间的拮抗现象较为普遍，相互拮抗的菌株间可能是营养和生态位的生长的竞争，也可能是通过分泌某些物质而抑制它菌的生长，其余菌株无拮抗，确定菌剂制备菌株为2、5、6。

2.2SA-PVA基本浓度及配比的筛选

2.2.1胶粒肥物理特性的测定

表2 SA-PVA配比对胶粒肥物理特性的影响

注：表中数据为3次重复的平均值，不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

由表2可知，操作性、成球性、传质速率和机械强度均较好的有三组：SA3％-PVA1％，SA3％-PVA2％，SA3％-PVA3％。当SA浓度为1％及PVA浓度为1％、2％、3％时均不成球，易连粘。随着SA浓度增加成球性越好，而SA浓度一定时，随着PVA浓度的增加，机械强度也随之增加，颗粒完全变形时承受重量最大达到203.2g/g。有效保证颗粒菌剂施入土壤后的完整性，综上可知SA浓度越高成球性越好，PVA浓度越高机械强度越高。

包埋颗粒的传质性在一定程度上代表菌体在颗粒内移动的难易程度，是否可以占据和利用颗粒内部有效空间，以及菌体从包埋颗粒内释放到颗粒外的难易程度等。从表2可知，随着SA和PVA浓度的增加时，各浓度颗粒传质速率为1时所需时间也相应增加。组合SA2％-PVA1％、SA2％-PVA2％、SA2％-PVA3％、SA3％-PVA1％传质速率为1时所需时间分别为2min、3min、5min、4min。传质速率太快，颗粒三维网状结构空隙越发达，交联后冲洗颗粒时菌体损失越大不益于菌体的包埋。而组合SA3％-PVA3％传质速率为1时所需时间为7min，能满足实际需要。

2.2.2褐环乳牛肝菌菌丝活力测定

从图6可以看出，不同浓度组合的胶囊菌剂在pach培养基上培养8天后菌根真菌萌发率均达到100％，随着SA及PVA浓度的增加各组合萌发率有所下降，SA3％-PVA3％在第4天萌发率最低，只有28％，可能是因为随着浓度的增加传质速率降低的缘故，但均满足实际需要。

2.2.3功能细菌活菌数的测定

表3 颗粒活菌数及包埋率

注：表中数据为3次重复的平均值，不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

从表3可知，组合SA3％-PVA1％，SA3％-PVA2％，SA3％-PVA3％的活菌数分别为3.5×10⁸个/g、9.5×10⁸个/g、1.62×10⁹个/g。组合SA3％-PVA1％的包埋率仅只有20％，随着PVA浓度的增加包埋率也随之增加，由于3％CaCl2的饱和硼酸溶液作为交联剂时，pH只有3.9，属于极强酸，组合SA3％-PVA1％传质速率相对SA3％-PVA2％，SA3％-PVA3％要快，通透性高。交联剂对菌体有一定的杀伤作用，数次洗涤后菌体损失率也相对较高。初步确定复合功能菌株的包埋浓度选择SA3％-PVA3％。

2.2.4生物炭对胶粒肥颗物理特性的影响

表4 生物炭对胶粒肥物理特性的影响

注:表中数据为3次重复的平均值，不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

由表4可以知添加0.5％生物炭后，成球更规则，更易操作，由于添加了生物炭后，包埋剂溶液粘稠度增加，滴加时液滴更规则，操作很少出现存在拖尾现象，SA3％-PVA3％(0.5％生物炭)处理机械强度只比SA3％-PVA3％提高了0.02％，差异不显著，添加辅料后处理SA3％-PVA3％(0.5％生物炭)机械强度有所增加的同时传质速率相对SA3％-PVA3％处理却降低了2min。这既保证了颗粒菌剂施入土壤后颗粒的完整性，同时增加了颗粒菌剂菌体的释放和与外界营养物质的获取速度，有益于菌体在颗粒内的稳定生长。

2.2.5生物炭对胶粒肥功能细菌的影响

表5 颗粒活菌数及包埋率

注:表中数据为3次重复的平均值，不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

由表5可知，两处理交联时间为30min时，两处理活菌数无明显差异，均为1.6*10⁹个/g，经24h增值培养后两处理活菌数分别为2.2×10¹⁰个/g、4.0×10¹⁰个/g，由此可见添加辅料后由利于菌体的生长繁殖，加入辅料后生物炭能作为细菌承载物，使细菌能更好的依附于载体，同时少量的生物炭改变了颗粒通透性，使颗粒菌剂能更好的与外界交换营养物质，颗粒菌剂施入土壤后更有益于菌体的稳定生长繁殖。

2.2.6交联时间对胶粒内功能细菌活菌数的影响

由图7可知，随着交联时间的增加颗粒活菌数随之减少，10分钟时两处理颗粒菌剂活菌数分别为9.5×10⁹个/g和8.35×10⁹个/g，加入辅料生物炭后活菌数较未加辅料处理活菌数降低13％，交联时间为30min时两处理活菌数无差异，处理SA3％-PVA3％在30min到60min时活菌数有所增加，但在60min后活菌数开始降低，90min时有效活菌数为1.3×10⁹个/g，添加辅料生物炭处理60min时，颗粒活菌数为0.98×10⁹个/g，并且在60min到90min时活菌数无明显变化。加入辅料后颗粒菌剂在不同交联时间活菌数始终低于未加辅料处理。但影响不明显。10分钟时两处理活菌数最高，但胶囊菌剂交联未完全，不能达到理想的机械强度，交联时间30min或60min时颗粒活菌数能达到国家要求，故选择最佳交联时间为30或60分钟。

2.2.7交联时间对褐环乳牛肝菌萌发的影响

由图8可知，交联时间在90min时处理Ⅰ和处理Ⅱ颗粒菌根菌萌发率均为0％，交联时间为10min、30min和60min时，处理Ⅰ和处理Ⅱ菌根菌萌发率均为100％，10min时，处理Ⅰ菌丝体并未将颗粒完全包裹，处理Ⅱ大多数颗粒被菌丝体包裹，30min时，两处理并未有太大差别，但在60min时，处理Ⅱ菌丝体以包埋颗粒为中心向周围延伸，而处理Ⅰ包埋颗粒被菌丝体完全包裹，包埋颗粒看上去更大，但菌丝体并未向平板空白区域延伸。故选择交联时间为60min。

2.3载体对功能细菌抗逆性的影响

2.3.1耐盐性

如图9所示，随着盐浓度增加，3种剂型活菌数随之降低，盐浓度为0％、1％时活菌数颗粒＞粉剂＞液体，可能是由于颗粒的屏障对盐的胁迫起到一定的吸附和缓冲作用，而液体和草炭粉剂中的菌体与盐溶液直接接触，菌体受盐胁迫较重。但盐浓度为3％时，颗粒出现不同程度崩解，活菌数甚至小于粉剂和液体剂。

2.3.2耐酸碱性

由图10可知，pH在4和10时，液体和粉剂活菌数几乎忽略不计，但颗粒菌剂依然能保持较高活菌数，各PH条件下各菌剂活菌数始终为颗粒剂＞粉剂＞液体剂。可能与颗粒本身形成的屏障对外界酸碱胁迫离子的阻止作用有关，二是可能因为颗粒本身的一些极性基团因为静电作用，可以吸附一部分进入颗粒内部的氢离子或氢氧根离子，减轻了酸碱对菌体的危害。

2.3.3耐抗生素性

由图11可知，各菌剂对青霉素及卡那霉素的敏感度低于氯霉素、庆大霉素及链霉素。其中庆大霉素对各菌剂的杀伤作用最大，其次为链霉素及氯霉素。3中剂型对不同抗生素的敏感程度，粉剂和液体剂无显著差异，颗粒剂活菌数始终高于粉剂及液体剂。可能是由于粉剂和包埋剂对于抗生素分子产生了一定吸附作用，降低了对菌体的作用浓度的缘故。此外，在实际应用中，可以考虑在施用菌剂的同时添加适量菌剂微生物不敏感的抗生素，防止其他杂菌的污染；或对于作物进行肥药联用，以节约人力物力。

2.4不同菌剂对油松促生效应研究

2.4.1菌根外部形态观察

由图12可见，从外部形态观察褐环乳牛肝菌与油松幼苗形成的菌根主要形态为棒状和二叉分支状，颜色呈淡黄色或红色。表面有大量外延菌丝。

2.4.2复合菌根生物肥对油松幼苗生长的影响

处理I、II、III分别为CK、胶粒型菌根菌肥(菌根真菌)、液体菌根菌肥(菌根真菌)比较3个处理对油松幼苗生长的影响，目的在于探究菌根菌对油松幼苗促生效果及将菌根菌包埋固定后使用是否优于液体菌根菌。

表6 胶粒型菌根肥对油松幼苗生长的影响

注：表中数据为3次重复的平均值：不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

由表6可以看出处理II和III对油松幼苗生物学性状和物质积累有着明显的促进作用，其中处理II苗高、地径、一级侧根数、地上干重和地下干重较CK分别增加了18.8％、9.9％、43.2％、59％和30.5％，由此可见，外生菌根菌对油松幼苗促生作用主要体现在干物质的积累，其主要原因在于大量外延菌丝有助于油松幼苗对营养物质的吸收及对难容性物质的转化。处理II苗高、地径、地上干重和地下干重较处理III分别增加了4.5％、7.5％、8.1％和9.6％，两者一级侧根数差异不显著，侵染率也比后者高了18.3％，侵染率高达97.6％，处理II针叶N、P含量较CK分别增加了10.1％和25.9％，较处理III两项指标差异不显著，由此可见，包埋固定后的菌根真菌对油松幼苗促生长效应和物质的积累优于直接使用液体菌根菌。

表7 复合菌根生物肥对油松幼苗生长的影响

注：表中数据为3次重复的平均值：不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

处理IV、V、VI分别为复合胶粒型菌根生物肥(菌根真菌和复合功能细菌)、胶粒型菌根菌肥+生物炭+复合功能细菌、生物炭+复合功能细菌。比较3个处理对油松幼苗生长的影响，目的在于探究菌根菌和复合功能细菌共包埋是否优于菌根菌单独包埋后配合复合功能菌粉剂使用。

由表7可以看出，处理V侵染率比处理IV侵染率低了26.7％，说明微生物炭+复合功能菌和胶粒型菌根菌肥一起施用时，前者对胶粒型菌根菌肥菌根菌萌发有一定抑制作用。处理IV地径、一级侧根数较处理V分别增加了12％、10.5％，两者地上干重和地下干重差异不显著，就苗高而言，前者却比后者低了10.7％。处理IV和处理V地径、一级侧根数、地上干重和地下干重显著高于处理VI，但处理VI苗高仍高于处理IV，且和处理V差异不显著，分析原因可能是微生物炭菌剂中复合功能细菌对油松幼苗苗高促进作用优于外生菌根菌，处理V苗高高于处理IV，说明处理V中复合功能细菌起主导作用，且对外生菌根真菌有着一定抑制作用。处理IV和V针叶含N量差异不显著，分别较处理VI增加了6.6％和7％，处理IV、V和VI针叶P含量差异不显著。

表8 复合菌根生物肥对油松幼苗生长的影响

注：表中数据为3次重复的平均值：不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

处理VII、VIII、IX分别为复合胶粒型菌根生物肥+生物炭+羊粪、生物炭+羊粪+复合功能细菌、生物炭+复合功能细菌。比较3个处理对油松幼苗生长的影响，目的在于探究复合胶粒型菌根生物肥配合有机羊粪使用促生效果是否更佳。

由表8可知，处理VII、处理VIII各项指标显著高于处理IX，处理VIIIPGPR固定载体为生物炭，PGPR受环境因素较大。处理VII地径、一级侧根、地上干重和地下干重较处理VIII分别增加了21％、43％、21.8％和40％，同时显著高于处理IX，但就苗高而言却比处理VIII低了4.2％。处理VII针叶N、P含量显著高于其余处理，较VIII分别增加了4.4％、30％，较处理IX分别增加了10.8％、48％，复合胶粒型菌根生物肥配合一定量炭基有机肥效果更好。

2.4.3复合菌根生物肥对育苗基质营养成分影响

处理II速效N、P、K及有机质含量较CK分别高100％、29.8％、24.8％和33.8％，处理II土壤速效N、P、K及有机质含量较处理III分别增加了31％、8.8％、10％和9.9％，胶粒型菌根菌肥优于液体菌根菌肥。处理IV速效N、P、K含量显著高于处理V和处理VI，呈IV＞V＞VI，由此说明外生菌根真菌和复合功能细菌混合包埋固定优于外生菌根真菌单独包埋配合生物炭+复合功能细菌使用，处理V、VI有机质含量差异不显著，分别较处理IV增加了51％左右。处理VII较处理VIII三项指标分别增加了7.8％、44％和13％，且两者速效N、P、K含量显著高于处理IX，包埋剂优于粉剂，并且菌根菌起到了至关重要的作用，但就有机质而言，IX＞VIII＞VII，说明处理VII对有机质矿化作用和腐殖化作用优于处理VIII，处理VII速效N、P、K含量较处理IV分别高21％、78％、14.7％。处理VIII较处理VI三项指标分别增加了59.3％、111.9％和20.7％，说明混合包埋菌剂或微生物炭菌剂配合有机羊粪肥施用更有利于土壤速效N、P、K的积累，处理IX较CK三项指标分别增加了39.8％、3.8％和7％，可以看出，该炭基有机肥营养元素N含量高于P、K，并且对土壤速效P、K含量的积累效果不显著。

表9 复合菌根生物肥对育苗基质营养成分影响

注：表中组1、组2、组3数据为3次重复的平均值，不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

2.5.4复合菌根生物肥对育苗基质可培养微生物数量的影响

土壤中根际微生物对土壤养分转化和吸收起着重要作用，不同处理对微生物数量影响较大，处理II真菌、细菌、放线菌数量分别是CK的1.5倍、8.6倍、1.3倍，较处理III分别增加了15％、20％和26％，外生菌根真菌在空间相对密闭的胶粒中能更稳定的生长繁殖，有助于育苗基质微生物群落结构的快速形成，生长后期胶粒中SA或PVA的分解还能为外生菌根真菌提供碳源。处理IV真菌、细菌、放线菌数量显著高于处理V和处理VI，呈IV＞V＞VI，将外生菌根真菌和复合功能细菌混合包埋更有助于菌根菌及功能细菌的生长。处理VII真菌、细菌、放线菌数量在所有处理中最高，原因可能是处理VII中PGPR对生物炭有机肥有一定的矿化作用，使生物炭有机肥释放更多营养元素，为油松幼苗提供营养的同时也为PGPR提供了一定生长所需营养。IX真菌、细菌、放线菌数量较CK虽然有所增加，但差异不明显。

表10 复合菌根生物肥对育苗基质可培养微生物数量的影响

注：表中组1、组2、组3数据为3次重复的平均值，不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

利用SA-PVA-0.5％生物炭包埋PGPR制备颗粒菌剂，颗粒机械强度、成球性等性能指标优于单一材料的包埋。对油松促生试验中发现，经包埋固定后的外生菌根菌处理侵染率远高于液体菌根菌处理侵染率，并且和生物炭+复合功能细菌配施时，发现生物炭+复合功能细菌对胶粒菌根菌的生长或萌发有一定抑制作用。不同处理对油松幼苗生物学性状和物质积累中，粉剂(生物炭+羊粪+复合功能细菌)处理生物学性状主要体现在纵向，且苗高在所有处理中最高，复合胶粒型菌根生物肥+生物炭+有机肥处理地径、侧根数和干物质的积累等指标在所有处理中最高。研究各处理对育苗基质肥力影响中发现基质速效P含量整体低于速效N、K。各处理针叶对N素的积累整体高于对P素的积累，速效N、K的充足加速了速效P的消耗，导致土壤速效P低于速效N、K含量。

(1)本试验以SA、PVA混合胶包埋固定褐环乳牛肝菌和复合功能细菌，最终确定包埋剂SA、PVA浓度及配比为SA3％-PVA3％，生物炭添加量为0.5％。该组合下胶粒操作性、成球性、传质速率及机械强度最优。活菌数为0.98×10⁹个/g，菌根菌萌发率100％。交联时间60min为宜。

(2)SA3％-PVA3％+0.5％生物炭包埋胶粒菌体耐盐性、耐酸碱性及耐抗生素性优于生物炭粉剂和液体剂

(3)不同处理对油松幼苗株高、根长、茎粗和干物质的积累的影响中处理VII效果最佳，且对育苗基质肥力的提高、育苗基质可培养微生物数量及油松幼苗针叶N、P含量的积累均优于其余处理。

本发明通过肥效试验分析可知，菌根菌包埋固定后对油松幼苗各指标及基质肥力的增加优于液体菌根菌，菌根菌和复合功能细菌共包埋优于菌根菌单独包埋后配合生物炭+复合功能细菌使用，并且菌根菌和复合功能细菌共包埋后配合有机肥(羊粪)使用效果更佳。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种复合菌根生物肥的制备方法，其特征在于，所述复合菌根生物肥的制备方法包括：

第一步，将保藏的菌种用固体活化培养基活化，挑取单菌落按照分组内的成员菌两两交叉三区划线到同一培养基平板上培养，30℃培养3天，3次重复；将无拮抗菌株和菌根真菌接入到各自的液体培养基中，放入摇床中在各自的最优培养条件下振荡培养，培养至发酵液中有效活菌数为2×10⁹个/ml以上，10000rpm离心后用，菌根真菌培养至最大菌丝量时停止培养，待用；所述无拮抗菌株为促生细菌是3532：紫金牛叶杆菌Phyllobacteriummyrsinacearum；WN343：甲基营养杆菌Bacillus methylotrophicus strain；LGYP224：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain；按照体积比紫金牛叶杆菌Phyllobacteriummyrsinacearum 3532：甲基营养杆菌WN343：枯草芽孢杆菌LGYP224＝1：1:1组成复合功能细菌；

第二步，于35℃下，以海藻酸钠浓度3％与聚乙稀醇浓度3％组合配比，配制溶液100ml，添加0.5％生物炭，于35℃下配制成溶液100ml，121℃灭菌20min，冷却至35℃，取复合功能细菌和菌根真菌菌体各2g，加入包埋剂溶液中，于恒温磁力搅拌器上混均，用注射器按照一定的速度均匀滴加到含有3％CaCl₂的饱和硼酸溶液中，交联60min，滤出颗粒，用无菌生理盐水洗涤数次；颗粒置于无菌生理盐水中，4℃保藏；

所述复合菌根生物肥中活菌数为0.98×10⁹个/g，菌根菌萌发率100％。

2.一种由权利要求1所述复合菌根生物肥的制备方法制备的复合菌根生物肥。

3.一种由权利要求2所述复合菌根生物肥制备的微生物制剂。

4.一种如权利要求2所述复合菌根生物肥在增加土壤中植物可吸收氮、磷和钾的作用。

5.一种如权利要求2所述复合菌根生物肥在植物土传病害防治中的应用。

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